張麗華

妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病(gestational trophoblastic disease,GTD)是一系列源于妊娠物而非患者本身的疾病，因攜帶父源基因而與其他腫瘤不同[1]。GTD主要包括葡萄胎、侵蝕性葡萄胎、妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞瘤[2]。葡萄胎屬于良性病變，但與腫瘤有著極為相似的侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特征，約有4%的部分性葡萄胎和20%的完全性葡萄胎會(huì)進(jìn)展為妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞瘤[3]。妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞瘤具有較強(qiáng)的局部浸潤、破壞和侵入血管的能力，易發(fā)生早期廣泛遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，尤其是顱腦轉(zhuǎn)移引發(fā)復(fù)雜并發(fā)癥，導(dǎo)致患者死亡[4]。微小RNA在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，有研究表明，miR-181a通過靶向ABI1影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[5]，但miR-181a與妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病關(guān)系尚不清楚。GATA結(jié)合蛋白6(GATA binding protein 6,GATA6是一種保守的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在多種腫瘤疾病中異常表達(dá)，參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[6]。但GATA6在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病中的研究筆者尚未見報(bào)道。本研究探討miR-181a、GATA6在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病中的意義，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年2月至2017年3月于我院就診的妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病患者80例為研究對象，其中未發(fā)生惡變葡萄胎患者45例，年齡21～45歲，平均年齡(25.12±5.23)歲；妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞瘤患者35例，年齡23～49歲，平均年齡(26.43±6.27)歲；Ⅰ期妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞瘤9例，Ⅱ期妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞瘤11例，Ⅲ期妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞瘤15例。另選取同期因個(gè)人因素或社會(huì)因素行人工流產(chǎn)手術(shù)的正常早孕者40例為對照組，年齡21～46歲，平均年齡(25.87±5.19)歲。3組受試者年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①研究組患者均經(jīng)B超、影像學(xué)、病理學(xué)診斷確診為妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病患者；②對照組正常早孕者均無異常妊娠史，且均確診為孕8～12周正常妊娠。③受試者及家屬對本研究內(nèi)容完全知情，并自愿簽署知情同意書；④所有入選者臨床資料完整。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①已接受過藥物治療或手術(shù)治療者；②合并其他惡性腫瘤者；③依從性差，無法配合完成研究者；④臨床資料不全者。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集：妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞瘤組織標(biāo)本取自手術(shù)切除子宮標(biāo)本，葡萄胎標(biāo)本取自患者首次清宮時(shí)，對照組正常早孕絨毛組織取自正常早孕行人工流產(chǎn)手術(shù)者，所有組織采集后以0.9%氯化鈉溶液吸凈，一部分放入液氮中速凍5 min后置于-80℃保存?zhèn)溆?，另一部分?0%甲醛溶液固定，用于免疫組化實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 miR-181a、GATA6 mRNA表達(dá)水平檢測：采用RNAfast 200提取試劑盒(上海飛捷生物科技有限公司)提取組織中總RNA。總RNA提取后以1.0%瓊脂糖電泳檢測其純度及完整性。取2 μg純凈無降解RNA，以Prime Script TM RT reagent Kit(Perfect Real Time)試劑盒(大連寶生物工程有限公司)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光定量PCR反應(yīng)體系及實(shí)驗(yàn)操作參照SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ試劑盒(大連寶生物工程有限公司)說明書進(jìn)行，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)，反應(yīng)體系加配完成后，置于CFX95熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)反應(yīng)。反應(yīng)程序結(jié)束后收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，miR-181a以U6為內(nèi)參基因，GATA6以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt計(jì)算受試者組織中miR-181a和GATA6 mRNA相對表達(dá)水平。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 免疫組化：所有組織經(jīng)10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm厚度切片。每個(gè)樣本分別做蘇木精-伊紅染色法和免疫組化EnVi-son兩步法染色，DAB顯色劑顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片，光鏡下觀察。由高年資病理醫(yī)師根據(jù)免疫組化染色結(jié)果，隨機(jī)取5個(gè)高倍視野進(jìn)行結(jié)果判定，以細(xì)胞核出現(xiàn)黃色至棕褐色顆粒為陽性顯色，無著色記0分，淡黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色3分，陽性細(xì)胞密度分級(jí)為陽性細(xì)胞數(shù)<10%記1分，10%～50%記2分，>50%記3分，兩項(xiàng)評分乘積結(jié)果>3分為陽性。

2 結(jié)果

2.1 3組受試者miR-181a、GATA6 mRNA表達(dá)水平比較 3組受試者組織中miR-181a、GATA6 mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞瘤組患者miR-181a表達(dá)水平線顯著低于葡糖胎組和對照組(P<0.05)；葡萄胎組患者顯著低于對照組(P<0.05)；妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞瘤組患者GATA6 mRNA表達(dá)水平線顯著高于葡糖胎組和對照組(P<0.05)；葡萄胎組患者顯著高于對照組(P<0.05)。見表2。

組別miR-181aGATA6對照組(n=40) 1.02±0.261.03±0.28葡萄胎組(n=45) 0.67±0.22?1.52±0.32?妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞瘤組(n=35)0.46±0.17?#1.89±0.37?#F值61.82167.163P值<0.001<0.001

注：與對照組比較，*P<0.05；與葡萄胎組比較，#P<0.05

2.2 3組受試者GATA6蛋白表達(dá)水平比較 GATA6蛋白定位與細(xì)胞核，陽性呈淺黃色或棕黃色。GATA6在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞瘤患者中陽性表達(dá)率顯著高于葡萄胎組和對照組(P<0.05)；葡萄胎組顯著高于對照組(P<0.05)。見表3，圖1。

表3 不同妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病中GATA6蛋白表達(dá) 例

注：與對照組比較，*P<0.05；與葡萄胎組比較，#P<0.05

圖1GATA6在不同組織中的免疫組化表達(dá)；A、B為對照組絨毛細(xì)胞中的表達(dá)；C、D為葡萄胎組織中的表達(dá)；E、F為妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞瘤組織中表達(dá)(A、C、E為蘇木精-伊紅染色法，B、D為免疫組化EnVi-son兩步法染色,×100)

2.3 葡萄胎患者組織miR-181a、GATA6表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 以葡萄胎患者組織中miR-181a表達(dá)水平平均值將患者分為高表達(dá)21例和低表達(dá)24例；GATA6蛋白表達(dá)分為陽性26例和陰性19例；miR-181a、GATA6表達(dá)水平與葡萄胎患者子宮體積、β-hCG、卵巢黃素囊腫大小有關(guān)(P<0.05)；與患者年齡無關(guān)(P>0.05)。見表4。

表4 葡萄胎患者組織miR-181a、GATA6表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

2.4 妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞瘤患者組織miR-181a、GATA6表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 以miR-181a表達(dá)水平平均值將患者分為高表達(dá)12例和低表達(dá)23例；GATA6蛋白表達(dá)分為陽性28例和陰性7例；miR-181a、GATA6表達(dá)水平與妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期、預(yù)后有關(guān)(P<0.05)；與患者年齡、腫瘤直徑、轉(zhuǎn)移病灶數(shù)無關(guān)(P>0.05)。見表5。

表5 妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞瘤患者組織miR-181a、GATA6表達(dá)與病理特征關(guān)系 例(%)

2.5 妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病組織miR-181a、GATA6 mRNA表達(dá)相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示葡萄胎患者組織中miR-181a、GATA6 mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.601,P=0.000)；在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞瘤組織中miR-181a、GATA6表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.611,P=0.000)。生物信息學(xué)預(yù)測網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/vert_72/)分析結(jié)果顯示GATA6是miR-181a的靶基因。見圖2。

圖2妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病組織miR-181a、GATA6 mRNA表達(dá)相關(guān)性分析

3 討論

GTN是與妊娠相互關(guān)聯(lián)的良性和惡性腫瘤，組織學(xué)為依據(jù)主要分為葡萄胎和妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞瘤[1]。GTN具有典型早期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部浸潤等特征，葡萄胎雖為良性腫瘤，若不及時(shí)發(fā)現(xiàn)治療，也有惡變的可能[7]?；熕幬锛盎煼绞降陌l(fā)展使妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞瘤的治愈率顯著提升，但早期肺腦等器官轉(zhuǎn)移給患者手術(shù)治療和化療帶來嚴(yán)峻考驗(yàn)，兩種治療方式并未顯著改善患者預(yù)后[8]。因此，更深入了解GTD的發(fā)病機(jī)制，尋找藥物作用的潛在靶點(diǎn)，對患者臨床治療和預(yù)后改善有重要的意義。

miRNA是一類內(nèi)源性非編碼小RNA分子，通過與靶基因mRNA的5’端或3’端發(fā)生特異性結(jié)合調(diào)控靶基因的表達(dá)。miRNAs由RNA聚合酶Ⅱ經(jīng)復(fù)雜的過程加工成成熟的miRNAs，成熟的miRNAs參與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體中干擾靶RNA的穩(wěn)定性和翻譯過程[9]。miRNA異常表達(dá)與多種良性腫瘤、惡性腫瘤、心血管疾病發(fā)生有關(guān)[10]。miR-181a表達(dá)失調(diào)與人類多種癌癥發(fā)生和預(yù)后相關(guān)[11]。Shi等[12]研究表明miR-181a通過靶向調(diào)控CDK1表達(dá)抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖，提示miR-181a表達(dá)可能影響腫瘤細(xì)胞增殖。本結(jié)果顯示，miR-181a在葡萄胎和妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞瘤患者組織中的表達(dá)水平顯著低于對照組，提示miR-181a低表達(dá)可能與妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病發(fā)生有關(guān)。臨床病例特征分析結(jié)果顯示，miR-181a表達(dá)水平與葡萄胎患者子宮體積、β-hCG、卵巢黃素囊腫大小有關(guān)，提示miR-181a低表達(dá)可能導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞異常增生，推測miR-181a可能參與了葡萄胎的惡性進(jìn)展過程。miR-181a可通過靶向ABI1表達(dá)影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[5]，提示miR-181a與腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。本結(jié)果顯示妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞瘤患者組織中miR-181a表達(dá)水平顯著低于葡萄胎組，miR- 181a表達(dá)與妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期、預(yù)后有關(guān)，與Feng等[11]研究miR-181a與腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、預(yù)后有關(guān)結(jié)果一致，提示miR-181a表達(dá)異?？赡軈⑴c妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移過程。

GATA6是GATA家族重要成員之一，是能夠特異識(shí)別GATA序列并結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，位于人類18q11.1-q11.2區(qū)段，包含7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子[13]。GATA6在多種腫瘤組織中表達(dá)異常，參與腫瘤發(fā)生過程。在非小細(xì)胞肺癌中GATA6表達(dá)上調(diào)，是影響患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素[13]。本研究結(jié)果顯示，GATA6在葡萄胎和妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞瘤患者組織中的表達(dá)水平顯著高于對照組，免疫組化結(jié)果與GATA6 mRNA結(jié)果有較好的一致性，提示GATA6高表達(dá)可能影響腫瘤細(xì)胞的增殖。葡萄胎患者組織中GATA6表達(dá)水平與葡萄胎患者子宮體積、β-hCG、卵巢黃素囊腫大小有關(guān)，提示GATA6高表達(dá)促進(jìn)了滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的增生，可能參與葡萄胎患者的發(fā)病。Tian等[14]研究發(fā)現(xiàn)MIR-124靶向GATA6抑制膽管癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，提示GATA6可能與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)。臨床病理特征分析顯示GATA6表達(dá)水平與妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期、預(yù)后有關(guān)，提示GATA6可能通過影響腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，間接影響患者預(yù)后。在葡萄胎、妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞瘤中，miR-181a與GATA6表達(dá)水平與臨床病理特征具有較高的一致性，推測二者可能存在相關(guān)性。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，miR-181a與GATA6 mRNA水平在葡萄胎、妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞瘤患者分別呈負(fù)相關(guān)。本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示GATA6是miR-181a的靶基因。Zhao等[15]研究表明miR-181a靶向調(diào)控GATA6抑制人喉鱗癌的進(jìn)展，提示miR-181a與GATA6在喉鱗癌中存在靶向調(diào)控關(guān)系。推測miR-181a可能靶調(diào)控GATA6表達(dá)參與妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的發(fā)生和進(jìn)展過程，但具體調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，miR-181a在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病中表達(dá)下調(diào)，GATA6在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病中表達(dá)上調(diào)，miR-181a可能靶向調(diào)控GATA6參與妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的發(fā)生過程。但miR-181a和GATA6是否存在調(diào)控關(guān)系以及具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。