路會(huì)玲，林 盪

（蘇州市立醫(yī)院呼吸與危重癥科，江蘇 蘇州 215001）

肺癌是全球范圍內(nèi)高發(fā)的癌癥，而我國的肺癌發(fā)病率現(xiàn)以每年26.9%的速度增長，肺癌死亡率在過去30年間上升了465%[1]。它在我國已成為發(fā)病率和死亡率增長最快，對(duì)人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是肺癌中最常見的組織類型，包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、大細(xì)胞癌，大部分NSCLC患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，5 年生存率很低，因此對(duì)NSCLC的早診斷、早治療，是目前肺癌檢測(cè)研究的主要方向之一[2]。

外泌體是一類幾乎所有細(xì)胞都能夠分泌的，存在于幾乎所有體液中的囊泡類物質(zhì)。外泌體能夠包裹其內(nèi)部的物質(zhì)，進(jìn)行物質(zhì)的傳輸和信號(hào)的傳遞[3-4]。miRNA是一類長約20 bp的單鏈RNA，能夠與靶基因的3'非翻譯區(qū)結(jié)合，通過阻礙翻譯或者促進(jìn)靶基因mRNA降解的方式，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，影響人的生長發(fā)育，疾病發(fā)生等多項(xiàng)生理功能[5-7]。研究表明，外泌體能夠包裹miRNA并將其傳遞至遠(yuǎn)處，作用于靶細(xì)胞中的靶基因，影響下游信號(hào)通路[8]。在腫瘤中，外泌體miRNA能夠影響腫瘤生長，腫瘤血管、腫瘤轉(zhuǎn)移龕的形成和癌癥耐藥等方面[9-10]。與此同時(shí)，外泌體miRNA也能夠作為新型分子標(biāo)志物，用于癌癥的診斷和監(jiān)控[11-12]。

本研究通過分析芯片數(shù)據(jù)，找到在早期NSCLC中表達(dá)異常的一系列外泌體miRNA，從中挑選出差異表達(dá)最明顯的miR-141，使用TCGA數(shù)據(jù)庫對(duì)miR-141在NSCLC中的作用進(jìn)行初步分析，證明miR-141不利于NSCLC患者生存。接下來對(duì)miR-141的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，并對(duì)這些預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行功能分析，從而預(yù)估外泌體miR-141可能的功能和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般材料與資料 芯片數(shù)據(jù)篩選：通過GEO數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），下載GSE114711芯片結(jié)果的原始數(shù)據(jù)，使用R語言對(duì)結(jié)果進(jìn)行初步處理，去除本研究中并不涉及的晚期NSCLC的數(shù)據(jù)和其他不必要的數(shù)據(jù)，一共有7 例吸煙對(duì)照組和11 例早期NSCLC，計(jì)算出每個(gè)miRNA的變化倍數(shù)（Fold of change）和P值，使用R語言中的ggplot2包，將處理過的數(shù)據(jù)以火山圖的形式表現(xiàn)出來。將閾值設(shè)為變化倍數(shù)＞1或＜－1，P值＜0.05，篩選出差異表達(dá)miRNA。

1.2 方法

1.2.1 生存分析：肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌的生存分析數(shù)據(jù)來源于TCGA數(shù)據(jù)庫（https://cancergenome.nih.gov/），下載數(shù)據(jù)后，使用R語言中的survival包，繪制miR-141高表達(dá)和低表達(dá)時(shí)生存情況，使用Log-rank檢驗(yàn)比較生存差異。

1.2.2 靶基因預(yù)測(cè)：通過在線軟件mirPath v.3（http://snf-515788.vm.okeanos.grnet.gr/）[13]，在TargetScan，microT-CDS v5.0[14]和Tarbase v7.0[15]三個(gè)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，其中TargetScan基于靶mRNA序列的進(jìn)化保守等特征來搜尋動(dòng)物的microRNA靶基因，TarBase v7.0是已有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的miRNA-靶基因結(jié)果數(shù)據(jù)庫，microT-CDS v5.0使用其特有算法搜索帶注釋的miRNA靶標(biāo)。對(duì)三個(gè)數(shù)據(jù)庫得到的靶基因進(jìn)行分析，繪制韋恩圖，取三個(gè)數(shù)據(jù)結(jié)果的交集，能夠有效提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。

1.3.3 靶基因功能預(yù)測(cè)：將篩選出的靶基因，使用Metascape（http://metascape.org/）在線軟件[16]進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，并繪制功能網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 根據(jù)變化倍數(shù)＞1或＜－1，P＜0.05的標(biāo)準(zhǔn)，在芯片數(shù)據(jù)中篩選出差異表達(dá)miRNA，這些miRNA在對(duì)照組和早期NSCLC中的表達(dá)水平以Graphpad Prism v6.01繪制，以min to max形式表示，兩組數(shù)據(jù)的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。使用Log-rank檢驗(yàn)比較生存差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

NCBI網(wǎng)站的GEO數(shù)據(jù)庫包含了大量研究人員所做的芯片等數(shù)據(jù)，二次利用這些數(shù)據(jù)能夠大大降低研究者的實(shí)驗(yàn)成本，從GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE114711芯片結(jié)果，其中包括了7 例吸煙對(duì)照組，11 例早期NSCLC和8 例晚期NSCLC樣本的血漿外泌體miRNA檢測(cè)結(jié)果。由于目前包括影像學(xué)技術(shù)等在內(nèi)的檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，晚期NSCLC患者更容易被發(fā)現(xiàn)和診斷，而早期NSCLC患者則可能被漏診或難以確診，因此對(duì)于早期NSCLC患者的診斷研究可能更具有意義。對(duì)芯片結(jié)果中吸煙對(duì)照組和早期NSCLC的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析后發(fā)現(xiàn)，在檢測(cè)的3 762 個(gè)血漿外泌體miRNA中，沒有在早期NSCLC中表達(dá)上調(diào)的且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的血漿外泌體miRNA（圖1）；有7 個(gè)表達(dá)下調(diào)且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的血漿外泌體miRNA。

圖1 對(duì)照組和早期NSCLC血漿外泌體miRNA芯片結(jié)果統(tǒng)計(jì)

從這7個(gè)miRNA中，根據(jù)平均表達(dá)水平和變化趨勢(shì)，進(jìn)一步篩選出miR-141，miR-141在對(duì)照組和早期NSCLC中平均表達(dá)水平都較高，且表達(dá)水平下降趨勢(shì)最為明顯（對(duì)照組血漿外泌體中miR-141平均水平為早期NSCLC的74.7倍，P＝0.015）（圖2）。

圖2 7 個(gè)miRNA在對(duì)照組和早期NSCLC血漿外泌體中的表達(dá)情況

TCGA數(shù)據(jù)庫是美國國家癌癥研究所和美國人類基因組研究所建立的一個(gè)匯聚了大量癌癥患者基因組數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫，其中肺腺癌共2 932 例，肺鱗狀細(xì)胞癌共902 例。通過檢索TCGA數(shù)據(jù)庫，分析miR-141對(duì)NSCLC患者生存周期的影響，發(fā)現(xiàn)具有高miR-141水平的肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌患者，都具有較短的生存周期（P＝0.0211和P＝0.0419，圖3），說明在NSCLC中，miR-141可能作為癌基因發(fā)揮作用，促進(jìn)癌癥發(fā)生發(fā)展，對(duì)患者生存不利。

圖3 TCGA數(shù)據(jù)庫中，miR-141的生存分析結(jié)果：肺腺癌（A）；肺鱗狀細(xì)胞癌（B）

使用TarBase，TargetScan和microT-CDS三個(gè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-141的靶基因。Tarbase預(yù)測(cè)到的靶基因有893 個(gè)，microT-CDS預(yù)測(cè)到的靶基因有934 個(gè)，TargetScan預(yù)測(cè)到的靶基因有221 個(gè)，三個(gè)數(shù)據(jù)庫取交集，得到共同預(yù)測(cè)到的靶基因有59個(gè)（圖4）。

圖4 miR-141的靶基因預(yù)測(cè)

對(duì)這59 個(gè)靶基因進(jìn)行功能預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)它們參與多項(xiàng)通路的調(diào)節(jié)，其中細(xì)胞形態(tài)發(fā)生的調(diào)節(jié)、細(xì)胞黏附的調(diào)節(jié)、細(xì)胞基質(zhì)連接、激動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架等可能會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲；有絲分裂細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期、上皮細(xì)胞增殖等可能影響腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡；Rho GTP酶信號(hào)和JNK級(jí)聯(lián)的調(diào)節(jié)能夠影響細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；這些基因間也存在相互作用，形成一個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，影響生理生化功能（圖5）。

圖5 miR-141靶基因功能預(yù)測(cè)

3 討論

在本研究中，使用GEO數(shù)據(jù)庫中的GSE114711芯片數(shù)據(jù)，一共篩選出了7 個(gè)miRNA在對(duì)照組和早期NSCLC中表達(dá)差異顯著，并進(jìn)一步挑選出miR-141這個(gè)平均拷貝數(shù)最高，且變化倍數(shù)最高的miRNA進(jìn)行進(jìn)一步研究，該miRNA不利于患者生存，可能起到癌基因的作用。使用多個(gè)miRNA靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫，取交集得到59 個(gè)miR-141的靶基因，對(duì)59 個(gè)靶基因的功能進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，它們參與脊索動(dòng)物的胚胎發(fā)育、糖酵解和調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附等多項(xiàng)功能，并形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，影響整體的生理生化狀態(tài)。

miR-141是miR-200家族的一員，除了miR-141外，miR-200家族還包括miR-200a、miR-200b、miR-200c和miR-429，該家族在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、后期侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。研究表明，在NSCLC中，miR-141能夠通過靶向PHLPP1和PHLPP2影響細(xì)胞的增殖[17]，通過調(diào)節(jié)EIF4、ZEBE和PDCD4的表達(dá)影響化療耐藥性[18-20]，腫瘤組織中的miR-141也能夠用于預(yù)測(cè)早期NSCLC的總體生存期[21]。

外泌體是所有活細(xì)胞都能夠分泌的、存在于所有體液中的囊泡類物質(zhì)，細(xì)胞將其分泌到細(xì)胞外、組織液，乃至血液中，這些被包裹在外泌體中的miRNA，能夠有效避免內(nèi)環(huán)境中的各種酶以及pH、滲透壓等理化性質(zhì)對(duì)miRNA的影響，使得外泌體包裹的miRNA，相對(duì)于游離miRNA更加穩(wěn)定。包裹在外泌體中的miRNA，通過血液等載體達(dá)到靶細(xì)胞后，進(jìn)入細(xì)胞并作用于靶基因。腫瘤細(xì)胞也能夠通過外泌體傳遞miRNA，有研究表明，腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體miRNA能夠作用于遠(yuǎn)端靶細(xì)胞，為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供合適的環(huán)境，或作用于周圍細(xì)胞，抑制免疫[22-23]。前列腺癌細(xì)胞來源的外泌體miR-141能夠通過影響成骨活性來促進(jìn)前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移[24]。血液中外泌體miRNA也可作為診斷標(biāo)志物，血漿或血清來源的外泌體miR-141可以用于前列腺癌[25]和卵巢癌[26]的診斷。但外泌體miR-141在NSCLC中的研究還沒有相關(guān)文章發(fā)表。

本研究利用生物信息學(xué)手段，探討了血漿外泌體miR-141在早期NSCLC診斷的潛在作用和可能機(jī)制。二次利用GEO數(shù)據(jù)庫內(nèi)的已發(fā)表文章的芯片數(shù)據(jù)，篩選出差異表達(dá)的miR-141，并使用TCGA數(shù)據(jù)庫對(duì)miR-141對(duì)肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌患者進(jìn)行了生存分析，說明外泌體miR-141具有作為診斷標(biāo)志物的潛力。同時(shí)使用多個(gè)miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫篩選出可信度較高的miR-141靶基因，并對(duì)其進(jìn)行功能注釋。后續(xù)需要在更多的樣本上驗(yàn)證外泌體miR-141作為早期NSCLC的標(biāo)志物的可能性，同時(shí)對(duì)其作用機(jī)制也要進(jìn)行進(jìn)一步的探索。

與對(duì)照組相比，早期NSCLC患者血液外泌體中存在大量表達(dá)降低的miRNA，其中差異最明顯的是miR-141。血液中的外泌體miR-141，能夠通過體液循環(huán)到達(dá)靶細(xì)胞，在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，該調(diào)節(jié)可能會(huì)影響腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤微環(huán)境調(diào)節(jié)和免疫等功能，從而對(duì)NSCLC的發(fā)展、轉(zhuǎn)移和治療等產(chǎn)生影響。綜上所述，外泌體miR-141具有作為早期NSCLC診斷標(biāo)志物的潛力。