曹雅琦，魏丹丹，張森，曾飛，郭盛，郭建明，段金廒

(1.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，國家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用重點研究室，江蘇 南京 210023)

苦參為豆科槐屬植物苦參SophoraflavescensAit.的干燥根，具有驅(qū)蟲、消炎、利尿、止瀉等多種生物活性[1]。從苦參中分離出的異戊烯基黃酮類化合物對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和枯草桿菌等革蘭陽性菌有顯著的抗菌作用[2-3]。甘草為豆科甘草屬植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、脹果甘草G.inflataBat.或光果甘草G.glabraL.的干燥根和根莖，含有豐富的黃酮類成分。目前，國內(nèi)外對甘草黃酮的研究集中在抑菌、免疫、抗腫瘤和抗氧化活性等方面[4-5]?？鄥⒑透什菥鶠槌Ｓ弥兴?，二者配伍使用始見于苦參甘草湯，出自《備急千金要方》卷十五，主治疳痢不止。

金黃色葡萄球菌是一種常見的人畜共患病原菌，是引起奶牛乳腺炎的主要病原菌之一[6]，其在奶牛乳腺炎中的檢出率為17.43%～52.80%[7]，給國內(nèi)外養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。而近年來由于抗生素的濫用，導(dǎo)致金黃色葡萄球菌耐藥性逐漸增強，出現(xiàn)了多種耐藥菌株，因此，養(yǎng)殖業(yè)迫切需要探索新的抗菌策略來控制耐藥菌株的感染。中藥具有多組分、多靶點和多作用的特點，在長期臨床應(yīng)用中尚未發(fā)現(xiàn)明顯的耐藥性，從中草藥中尋找新型抗菌藥物已成為解決細菌耐藥性的有效途徑[8]。

本研究對苦參異戊烯基黃酮類化合物及甘草黃酮類化合物進行了體內(nèi)、體外抗菌活性評價，為苦參和甘草的資源價值發(fā)現(xiàn)及其綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)，同時為防治奶牛乳腺炎及其他金黃色葡萄球菌感染的日化用品、中成藥和中獸藥的研發(fā)提供參考，并為畜牧養(yǎng)殖業(yè)替代抗生素研究提供支撐。

1 材料

1.1 實驗菌株

金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus(ATCC 25923)，由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院饋贈。

1.2 實驗藥材

苦參藥材來自內(nèi)蒙古地區(qū)所生產(chǎn)苦參飲片，購自2018年7月，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)段金廒教授鑒定為豆科槐屬植物苦參S.flavescens的干燥根，標本現(xiàn)存于江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，標本號為SF20180722；甘草藥材來源于江陰天江藥業(yè)，購自2017年10月，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)段金廒教授鑒定為豆科甘草屬植物甘草G.uralensis的干燥根及根莖，標本現(xiàn)存于江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，標本號為GU20171023。

1.3 實驗試劑

LB培養(yǎng)基(LB)、水解酪蛋白培養(yǎng)基(MH)、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)、磷酸鹽緩沖溶液(PBS)購自上海源葉生物科技有限公司；甲醇(色譜純)、甲酸(色譜純)、乙腈(色譜純)、無水乙醇(分析純)、結(jié)晶紫(分析純)購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；乙酸乙酯(分析純)購自南京晚晴有限公司；AB-8大孔吸附樹脂購自索萊寶有限公司；搖瓶、平皿、康寧全白酶標96孔微孔板購自上?；茖嶒炂鞑挠邢薰荆怀兯蒑illipore超純水系統(tǒng)提供。

小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-2(IL-2)、白介素-1β(IL-1β)酶聯(lián)免疫試劑盒購自南京金益柏生物科技有限公司；蘇木素-伊紅染液試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；注射用青霉素鈉購自江蘇省人民醫(yī)院；獸用青霉素購自久鵬制藥有限公司。

1.4 實驗動物

BALB/C孕鼠，雌性，SPF級，購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2017-0001；屏障飼養(yǎng)環(huán)境系統(tǒng)，溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%，換氣次數(shù)10～20次/h，每日12 h/12 h交替照明；實驗期間每日消毒地面、臺面和墻面，消毒劑為新潔而滅、來蘇爾、乙醇交替使用。

1.5 儀器

DHG-9023A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海昕儀儀器儀表有限公司),TDL-80-2B型離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠),FW80型高速萬能粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司),超凈工作臺,恒溫生化培養(yǎng)箱,Quitix125D電子天平(德國賽多利斯公司),IS-RDV1型恒溫振蕩器(美國精騏公司),KH-500型超聲波清洗器,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士布奇公司)。Waters ACQUITY UPLC系統(tǒng)(美國Waters公司),Waters 2998型PDA檢測器(美國Waters公司),Waters Q-TOF Premier飛行時間質(zhì)譜儀(美國Waters公司),MassLynx 4.1質(zhì)譜工作站軟件(美國Waters公司)。

2 方法

2.1 苦參異戊烯基黃酮、甘草黃酮的制備

干燥苦參藥材，粉碎，6倍量乙酸乙酯滲漉提取4次，減壓濃縮回收溶劑后，經(jīng)AB-8大孔樹脂柱層析，棄去10%乙醇部位，收集80%乙醇洗脫餾分，濃縮并冷凍干燥，得苦參異戊烯基黃酮富集部位(KSHT)。干燥甘草藥材，粉碎，10倍量70%的乙醇加熱回流提取3次，乙酸乙酯萃取后萃取物經(jīng)AB-8大孔樹脂柱層析，收集60%醇洗脫餾分，濃縮并冷凍干燥，得甘草黃酮富集部位(GCHT)。黃酮含量測定參照文獻[9]，以蘆丁為對照品，加入5%亞硝酸鈉溶液，于500 nm處測定吸光度，KSHT黃酮含量為50.12%，GCHT的含量為41.13%。

2.2 KSHT及GCHT定性分析

采用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)對苦參異戊烯基黃酮及甘草黃酮進行定性分析。其中超高效液相色譜部分采用Waters Acquity系統(tǒng)(Waters,Prague,Czech Republic)，Waters Acquity UPLC色譜柱(BEH C18100 mm×2.1 mm,1.7 μm)，柱溫為35 ℃，以A(0.1%甲酸-水)和B(乙腈)為流動相進行梯度洗脫：0～1 min，5%～30% B；1～5 min，30%～50% B；5～14 min，50%～70% B；14～20 min，70%～100% B；流速為0.4 mL/min，進樣量為5 μL。Q-TOF-MS離子源采用電噴霧ESI，陰離子模式，掃描時間為1 s，質(zhì)量范圍為m/z100～1 000 ，毛細管電壓：2.0 kV，離子源溫度：120 ℃，去溶劑化溫度：350 ℃，流速：600 L/h，錐孔氣流速：50 L/h。

2.3 KSHT及GCHT對金黃色葡萄球菌的抑制作用

2.3.1 KSHT及GCHT對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度(MIC)值測定 參照文獻[10]測定供試液對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度?；罨辏600 nm值為1的菌液用麥氏比濁管稀釋至0.5麥氏比濁度，繼續(xù)稀釋1 000倍得到試驗用菌液(約為1.5×106U/mL)，備用。96孔板4倍稀釋法配置苦參異戊烯基黃酮及甘草黃酮不同濃度梯度溶液。以注射用青霉素鈉為陽性藥物對照，96孔板10倍稀釋法配置陽性藥不同濃度梯度溶液?？鄥愇煜┗S酮及甘草黃酮的最終濃度梯度為0.39～100 μg/mL，青霉素鈉最終濃度梯度為1×10-3～10 μg/mL。菌液加藥后37 ℃下培養(yǎng)16 h，用酶標儀于600 nm處檢測各孔A(吸光度)值，試驗重復(fù)3次，每次平行3個復(fù)孔，取平均值，計算相應(yīng)濃度下的抑菌率，以肉眼觀測不到菌落生長的濃度為各組相應(yīng)MIC值。

2.3.2 KSHT及GCHT抑制金黃色葡萄球菌生物被膜及黃素IC50值測定 按2.3.1項下濃度梯度配置各供試液及菌液，于96孔板中37 ℃下培養(yǎng)各加藥后菌液及空白菌液36 h，使其被膜生長充分，之后棄去培養(yǎng)基，PBS溶液洗滌，甲醇固定，用0.5%結(jié)晶紫染色，加入雙蒸水洗滌晾干，加入33%冰醋酸于37 ℃培養(yǎng)箱中溶解后于570 nm處測定A值，計算KSHT及GCHT對金黃色葡萄球菌生物被膜的抑制率及半數(shù)抑制濃度IC50值[11]。

按1∶1 000比例吸取對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌菌液于TSB培養(yǎng)基中，于96孔板中37 ℃下培養(yǎng)各加藥后菌液及空白菌液16 h；之后將菌液于12 000 r/min下離心后棄去上清液，PBS溶液清洗沉淀，離心后棄去上清，重復(fù)3次，加入甲醇溶液于55 ℃下水浴加熱3 min，之后于12 000 r/min下離心10 min，吸取上清液于96孔板中，于465 nm處測定A值，計算KSHT及GCHT對金黃色葡萄球菌黃素生成的抑制率及半數(shù)抑制濃度IC50值[12]。

2.4 KSHT與GCHT聯(lián)用抑制金黃色葡萄球菌活性評價

采用微量棋盤稀釋法[13]，于96孔微孔板測定KSHT與GCHT以2×MIC～1/16×MIC的質(zhì)量濃度聯(lián)合應(yīng)用對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，計算分級抑菌濃度(FIC)指數(shù)。同時，測定各孔600 nm處的吸光度A值：A值大于0.1的標記為綠色，即有菌生長；A值小于0.1的標記為紅色，即無菌生長。

FIC指數(shù)=MIC(KSHT聯(lián)合)/MIC(KSHT單用)+MIC(GCHT聯(lián)合)/MIC(GCHT單用)，式中MIC(KSHT單用)和MIC(GCHT單用)分別為KSHT和GCHT單用時的各自的濃度，MIC(KSHT聯(lián)合)和MIC(GCHT聯(lián)合)為兩藥聯(lián)用時各自的濃度。若FIC指數(shù)≤0.5，兩藥具協(xié)同作用；0.52，拮抗作用。

2.5 KSHT及GCHT體內(nèi)抗小鼠乳腺炎活性評價

BALB/c孕鼠72只，適應(yīng)飼養(yǎng)1周，待其分娩后6～8 d，隨機分為9組，每組8只：空白對照組，模型組，陽性藥組(獸用青霉素)，KSHT高、低劑量組，GCHT高、低劑量組，KSHT-GCHT 1∶1聯(lián)用高、低劑量組，依據(jù)藥典要求甘草及苦參給藥量，換算至小鼠，高劑量給藥組灌胃劑量為100 mg/kg，低劑量給藥組灌胃劑量為50 mg/kg；模型組及空白組灌胃相同體積的1%吐溫-80的生理鹽水。小鼠自由飲水，模型組及各給藥組于第5對乳房處注射生理鹽水稀釋的濃度為2.0×104U/mL的金黃色葡萄球菌，每側(cè)50 μL；空白組于相同位置注射相同體積的生理鹽水。造模成功后連續(xù)給藥7 d，各給藥組用1%吐溫-80的生理鹽水溶解，末次給藥后脫頸處死小鼠，快速剪開腹部皮膚，觀察乳腺組織的病理變化。

2.5.1 乳腺臟器指數(shù)及組織病理學(xué)評價 稱取各組小鼠乳腺組織質(zhì)量，計算其臟器指數(shù)。取第5對乳腺組織一側(cè)置于4%多聚甲醛溶液固定，HE染色，并進行乳腺組織病理學(xué)評價。

2.5.2 乳腺組織載菌量及炎癥因子測定 另一側(cè)乳腺組織稱質(zhì)量后按每1 g質(zhì)量加入1 mL無菌生理鹽水，冰上研磨為勻漿。各組勻漿液稀釋至合理的倍數(shù)，取100 μL稀釋液涂布平板，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h，選擇菌落數(shù)為30～300的平板進行計數(shù)，并換算各小鼠乳腺組織單位質(zhì)量的載菌量。剩余乳腺組織勻漿液以12 000 r/min離心15 min，取上清液，按照試劑盒說明書，測定各炎癥因子水平。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 KSHT及GCHT定性分析

根據(jù)UPLC-QTOF/MS質(zhì)譜信息，參考文獻報道[14-24]，從KSHT中共鑒定20個黃酮類成分，其中18個為異戊烯基取代黃酮類化合物。從GCHT中共鑒定出22個黃酮類化合物，均為黃酮及二氫黃酮類化合物，結(jié)果見表1～2。

表1 苦參異戊烯基黃酮化合物歸屬

(續(xù)表)

表2 甘草黃酮化合物歸屬

3.2 KSHT及GCHT對金黃色葡萄球菌MIC值的影響

KSHT及GCHT對金黃色葡萄球菌的MIC值分別為25 μg/mL與100 μg/mL；通過比較MIC值及不同劑量下兩者抑菌率發(fā)現(xiàn)，苦參異戊烯基黃酮的體外抑菌活性優(yōu)于甘草黃酮，結(jié)果見表3。

表3 苦參異戊烯基黃酮及甘草黃酮體外抑菌活性

注：青霉素劑量a=10 μg/mL，b=1 μg/mL,c=0.1 μg/mL,d=0.01 μg/mL,e=0.001 μg/mL。

3.3 KSHT與GCHT聯(lián)用對FIC指數(shù)的影響

苦參異戊烯基黃酮(KSHT)與甘草黃酮(GCHT)聯(lián)用時，對金黃色葡萄球菌的抑制活性見圖1。由結(jié)果可知，當二者濃度均為各自MIC值的1/4時，兩藥聯(lián)合使用表現(xiàn)出顯著的抑菌作用。二者聯(lián)用的FIC指數(shù)見表4，由此可知：二者以各自MIC濃度的1/4聯(lián)用時，對金黃色葡萄球菌生長具有協(xié)同抑制作用；二者以各自MIC濃度以上進行聯(lián)用時，對金黃色葡萄球菌生長具有相加作用。

3.4 KSHT及GCHT對金黃色葡萄球菌生物被膜及黃素生成抑制作用

KSHT及GCHT在體外均有顯著的抑制金黃色葡萄球菌生物被膜生成的活性，KSHT對金黃色葡萄球菌的生物被膜IC50值為1.25 μg/mL，GCHT對金黃色葡萄球菌的生物被膜IC50值為2.84 μg/mL，兩者1∶1聯(lián)用時，對金黃色葡萄球菌的生物被膜的IC50值為1.14 μg/mL，KSHT對生物被膜抑制作用優(yōu)于GCHT，兩者1∶1聯(lián)用時，抑制被膜生長作用優(yōu)于單用，結(jié)果見表5。

KSHT與GCHT在體外均有顯著的抑制金黃色葡萄球菌黃素生成的作用，KSHT對金黃色葡萄球菌黃素的IC50值為7.22 μg/mL，GCHT對金黃色葡萄球菌的黃素IC50值為20.35 μg/mL，兩者1∶1聯(lián)用時，對金黃色葡萄球菌的黃素的IC50值為6.41 μg/mL，結(jié)果表明，KSHT效果優(yōu)于GCHT，兩藥1∶1聯(lián)用時，其抑制黃素生成活性優(yōu)于單用，結(jié)果見表6。

表4 苦參異戊烯基黃酮與甘草黃酮聯(lián)合抑菌作用

表5 苦參異戊烯基黃酮及甘草黃酮抑制金黃色葡萄球菌生物被膜生成活性

注：青霉素劑量a=10 μg/mL，b=1 μg/mL,c=0.1 μg/mL,d=0.01 μg/mL,e=0.001 μg/mL。

表6 苦參異戊烯基黃酮及甘草黃酮抑制金黃色葡萄球菌黃素生成活性

注：青霉素劑量a=10 μg/mL，b=1 μg/mL,c=0.1 μg/mL,d=0.01 μg/mL,e=0.001 μg/mL。

3.5 苦參異戊烯基黃酮及甘草黃酮抗小鼠乳腺炎的作用

3.5.1 組織病理學(xué)觀察 組織病理學(xué)觀察表明：空白對照組小鼠乳腺組織無異常病理變化，間質(zhì)無明顯炎癥浸潤(圖2A)；模型組小鼠乳腺腺泡病變明顯，腺泡明顯增生，腺泡腔內(nèi)可見大量炎性細胞碎片，炎癥細胞類型多樣，以嗜中性粒細胞為主(圖2B)。相比模型組，各給藥組均有不同程度的改善，兩藥聯(lián)用效果優(yōu)于各自單用：KSHT高劑量組乳腺腺泡上皮細胞輕微剝脫，無顯著炎性細胞浸潤(圖2C)；KSHT低劑量組乳腺腺泡上皮細胞輕微剝脫，間質(zhì)中度炎性細胞浸潤，以嗜中性粒細胞為主(圖2D)。GCHT高劑量組乳腺組織無異常病理變化，乳腺腺泡上皮細胞輕微剝脫(圖2E)；GCHT低劑量組乳腺間質(zhì)輕微炎性細胞浸潤，以嗜中性粒細胞為主(圖2F)。KSHT-GCHT(1∶1)聯(lián)用高劑量組僅見乳腺腺泡上皮細胞輕微剝脫，無顯著炎性細胞浸潤(圖2G)；KSHT-GCHT(1∶1)聯(lián)用低劑量組乳腺腺泡上皮細胞輕微剝脫，間質(zhì)輕微炎性細胞浸潤，以淋巴細胞為主(圖2H)。陽性藥組乳腺組織僅有間質(zhì)輕度炎癥細胞浸潤(圖2I)。

3.5.2 乳腺組織臟器指數(shù)、載菌量及炎癥因子含量的測定 臟器指數(shù)結(jié)果顯示：相比空白組，模型組小鼠乳腺指數(shù)顯著增加，可能與炎癥所致的紅腫熱痛相關(guān)；與模型組相比，陽性藥組、GCHT高劑量組、KSHT高劑量組以及KSHT與GCHT1∶1聯(lián)用組小鼠乳腺指數(shù)顯著下降，提示各治療組均可不同程度改善乳腺炎小鼠乳腺的紅腫熱痛，其中KSHT與GCHT1∶1聯(lián)用組優(yōu)于兩者單用。各組乳腺組織載菌量結(jié)果顯示：與空白組相比，模型組小鼠乳腺載菌量顯著增加；與模型組相比，各給藥組小鼠乳腺載菌量均下降。其中，GCHT組效果優(yōu)于KSHT組，KSHT與GCHT聯(lián)用組效果最優(yōu)，優(yōu)于兩者單用(表7)。炎癥因子測定結(jié)果顯示：金黃色葡萄球菌造模后，模型組小鼠乳腺組織IL-1β、IL-2和TNF-α含量均顯著上升，IL-1β與TNF-α的含量增加尤其顯著。二者單用時，甘草黃酮GCHT各劑量組對IL-1β、IL-2和TNF-α的降低作用均優(yōu)于同劑量下的苦參異戊烯基黃酮組KSHT，與相同劑量的二者聯(lián)用組抗炎效果相當或略有優(yōu)勢。對于IL-2的調(diào)控，KSHT組單用時與模型組相比未有顯著差異，與GCHT聯(lián)用后對IL-2有顯著下調(diào)作用，且效果優(yōu)于GCHT單用。對于TNF-α的調(diào)控作用，KSHT與GCHT1∶1聯(lián)用組的下調(diào)作用要優(yōu)于KSHT單用組，KSHT與GCHT1∶1聯(lián)用組對各炎癥因子的下調(diào)作用均優(yōu)于KSHT單用，略優(yōu)于GCHT單用(表7)。

表7 乳腺炎小鼠乳腺臟器指數(shù)、載菌量及組織炎性指標

4 討論

我國是養(yǎng)殖業(yè)大國，飼料中添加抗生素的興起使動物養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展進入一個新的階段，但抗生素過量、超量使用的情況嚴重制約我國養(yǎng)殖業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展[25]?？股貫E用，導(dǎo)致細菌耐藥性逐漸增強，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的出現(xiàn)，嚴重威脅人、畜安全。根據(jù)我國農(nóng)業(yè)部《獸藥管理條例》《飼料和飼料添加劑管理條例》有關(guān)規(guī)定，自2020年1月1日起，已發(fā)布停止生產(chǎn)、進口、經(jīng)營、使用部分藥物飼料添加劑，主要包括土霉素預(yù)混劑、土霉素鈣預(yù)混劑、亞甲基水楊酸桿菌肽預(yù)混劑、那西肽預(yù)混劑、桿菌肽鋅預(yù)混劑、恩拉霉素預(yù)混劑、喹烯酮預(yù)混劑、黃霉素預(yù)混劑、黃霉素預(yù)混劑(發(fā)酵)、維吉尼亞霉素預(yù)混劑等10種添加劑。綠色環(huán)保的無抗養(yǎng)殖新體系將逐漸成為養(yǎng)殖業(yè)的主流趨勢，因此，研究出無耐藥性的飼用添加劑成為新時代養(yǎng)殖行業(yè)的重中之重[26]。文獻報道[27]，苦參異戊烯基黃酮對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和枯草桿菌等革蘭陽性菌有顯著的抗菌作用；甘草黃酮具有抗氧化、抗菌、抑制炎癥反應(yīng)、降血脂、抗腫瘤等作用，能夠有效地預(yù)防和改善細菌感染、潰瘍等多種疾病[28]。因此，從中藥及天然藥物中尋找新型替代抗生素類飼料添加劑成分是行業(yè)共識和必由之路；同時，同為豆科根莖類藥用植物，苦參和甘草主要分布于我國生態(tài)環(huán)境較為脆弱的西北地區(qū)，長期的挖根取藥勢必進一步加劇當?shù)氐纳鷳B(tài)惡化，因此對其進行資源綜合利用，實現(xiàn)資源的吃干榨盡符合綠色、可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略。

本研究對苦參異戊烯基黃酮類化合物及甘草黃酮類化合物以及兩者聯(lián)用進行了體內(nèi)、體外抗菌活性評價，為苦參和甘草的資源價值發(fā)現(xiàn)及其綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)，同時為防治奶牛乳腺炎及其他金黃色葡萄球菌感染的日化用品、中成藥和中獸藥的研發(fā)提供參考，并為畜牧養(yǎng)殖業(yè)替代抗生素研究提供支撐。