李惠，熊忠飛，李喜宏

(天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

蘆筍(AsparagusofficinalisL.)含有豐富的氨基酸、蛋白質(zhì)和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)[1,2]，同時(shí)富含黃酮、多糖等生物活性物質(zhì)[3,4]，故而，蘆筍被冠以“蔬菜之王”的美譽(yù)。蘆筍營養(yǎng)豐富，尤其蘆筍多糖具有降血脂、抗腫瘤、提高免疫力等功效[5]。因此，蘆筍多糖的提取研究日益受到廣泛關(guān)注。

目前，國內(nèi)外對多糖的提取主要有熱水浸提法、超聲波提取法、堿液提取法和乙醇提取法等[6,7]。傳統(tǒng)熱水浸提法存在得率低、周期長、能耗高等缺點(diǎn)。過酸或過堿提取環(huán)境易破壞多糖結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致生物活性降低。超聲波在液體中通過高頻振動(dòng)產(chǎn)生空化效應(yīng)，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，利于多糖溶出和擴(kuò)散。據(jù)報(bào)道，當(dāng)超聲波功率在300～500 W，多糖結(jié)構(gòu)容易受到破壞，天然活性降低[8]。酶可有效使植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜分解[9]，提高多糖提取率。實(shí)驗(yàn)以蘆筍老莖為原料提取多糖，通過低功率超聲結(jié)合酶法技術(shù)，采用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化工藝條件并測定抗氧化活性，旨在為蘆筍多糖提取提供新的思路，為蘆筍老莖資源的綜合利用提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆筍：市售；果膠酶(1000 U/mg)、纖維素酶(50 U/mg)：上海源葉生物科技有限公司；石油醚、無水乙醇、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、硫酸亞鐵、雙氧水等：均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

JJ-1000精密型電子天平 常熟雙杰測試儀器廠；TU-1901型紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；Centrifuge 5804R型冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；PS-30AD數(shù)控超聲波清洗器 深圳市潔康洗凈電器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)處理

1.3.1 蘆筍多糖提取工藝

蘆筍老莖→清洗→切塊→烘干→粉碎→篩分→稱取→超聲提取→酶提取→滅酶→抽濾→濃縮→醇沉→離心→蘆筍粗多糖。

1.3.2 操作要點(diǎn)

將蘆筍老莖清洗干凈，去除泥沙，切塊后置于60 ℃烘箱內(nèi)烘干。將干蘆筍用粉碎機(jī)粉碎后過60目篩，備用。精確稱取蘆筍粉1.000 g，按料液比加入蒸餾水進(jìn)行超聲提取。加入一定量的復(fù)合酶(纖維素酶∶果膠酶為1∶1)，水浴恒溫提取1 h，90 ℃滅酶10 min，用真空抽濾機(jī)抽濾取濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將濾液濃縮至30 mL。按照1∶3的比例向濃縮液中加入95%乙醇，4 ℃醇沉過夜，10000 r/min離心10 min后收集沉淀，沉淀即為蘆筍粗多糖[10]。

1.3.3 多糖含量的測定

1.3.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱量干燥至恒重的葡萄糖0.1000 g，用蒸餾水定容至1000 mL，制得濃度為100 μg/mL的葡萄糖溶液，分別吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL置于25 mL比色管中，用蒸餾水稀釋至1 mL，分別加入1 mL 5%苯酚、5 mL濃硫酸，混勻后靜置5 min，沸水浴20 min，迅速冷卻至室溫，以蒸餾水作為空白液，在波長490 nm處測吸光值[11]。

1.3.3.2 蘆筍多糖得率的計(jì)算

蘆筍粗多糖加水定容至100 mL，稀釋100倍。取稀釋液1 mL于25 mL比色管中，加入1 mL 5%苯酚溶液、5 mL濃硫酸，混勻后靜置5 min，沸水浴20 min，迅速冷卻至室溫，以蒸餾水作為空白液，在波長490 nm處測吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算多糖含量，多糖得率按照公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：Y為多糖得率，%；M0為粗多糖質(zhì)量，mg；M1為蘆筍原料質(zhì)量，mg。

1.3.4 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

準(zhǔn)確稱取1.000 g蘆筍粉，在料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g/mL)，超聲溫度30，40，50，60，70 ℃，超聲時(shí)間10，20，30，40，50 min，超聲功率50，100，150，200，250 W，酶解時(shí)間20，30，40，50，60 min，加酶量1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%，酶解溫度30，40，50，60，70 ℃的條件下提取多糖，計(jì)算多糖得率，考察不同料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間、超聲功率、酶解時(shí)間、加酶量及酶解溫度對蘆筍多糖得率的影響，每組測定3次。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在單因素基礎(chǔ)上，選擇加酶量(A)、超聲時(shí)間(B)和料液比(C)3個(gè)因素，以多糖得率為考察指標(biāo)，通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化超聲酶法提取蘆筍多糖工藝。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.6 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-dipheny-1-2-picrylhydrazyl, DPPH)自由基清除能力的測定[12]

分別配制不同濃度的多糖溶液，加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液于具塞試管中，混勻，室溫避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長處測吸光度A0。以蒸餾水代替蘆筍多糖溶液作為空白Ai，以無水乙醇代替DPPH溶液作為對照Aj。DPPH自由基清除率計(jì)算見公式(2)：

(2)

1.3.7 羥自由基(·OH)清除能力的測定[13]

根據(jù)Fenton反應(yīng)原理，從不同濃度多糖溶液中準(zhǔn)確量取1 mL，分別加入1 mL 2 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 2 mmol/L H2O2溶液，混勻后反應(yīng)10 min，加入1 mL 2 mmol/L水楊酸溶液，混勻，37 ℃恒溫反應(yīng)30 min，于510 nm波長處測吸光值A(chǔ)0，用蒸餾水代替蘆筍多糖作為空白Ai，用蒸餾水代替水楊酸溶液作為對照Aj。羥自由基清除率計(jì)算見公式(3)：

(3)

1.3.8 處理與分析方法

采用Origin 2017統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)整理、分析與作圖，利用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，P<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 Fig.1 Standard curve of glucose

由圖1可知，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.1903x-0.1981，相關(guān)系數(shù)R2=0.9993。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比對蘆筍多糖得率的影響

圖2 料液比對多糖得率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of polysaccharides

由圖2可知，隨著料液比增加，蘆筍多糖得率先升高后趨于穩(wěn)定，當(dāng)料液比為1∶40時(shí)，蘆筍得率最大，為4.12%，這可能是因?yàn)榱弦罕容^低時(shí)，溶液粘稠，細(xì)胞未完全空化，多糖提取不完全；料液比過高時(shí)，溶劑對超聲波能量吸收也隨之增大，導(dǎo)致蘆筍粉吸收超聲波能量減小[14]，細(xì)胞壁破碎不完全，多糖溶出效果下降。因此，選擇最佳料液比為1∶40(g/mL)。

2.2.2 超聲溫度和超聲時(shí)間對蘆筍多糖得率的影響

圖3 超聲溫度(A)和超聲時(shí)間(B)對多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature (A) and ultrasonic time (B) on the extraction yield of polysaccharides

由圖3中A可知，隨著超聲溫度升高，多糖得率也隨之增加，當(dāng)超聲溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，多糖得率最高。隨著超聲溫度進(jìn)一步升高，多糖得率開始降低。其原因可能是多糖溶解度隨著超聲溫度的升高而增加，但是當(dāng)超聲溫度超過閾值時(shí)，多糖中熱敏性物質(zhì)發(fā)生變性降解[15]，提取率會降低。因此，最佳超聲溫度為50 ℃。

由圖3中B可知，多糖得率隨著超聲時(shí)間的延長先增大后減小。在超聲時(shí)間30 min時(shí)最大，得率為3.67%。主要是因?yàn)槌暡ㄌ幚砬捌?，?xì)胞破碎程度大，細(xì)胞內(nèi)的多糖溶出，多糖得率增大。但是超聲波對多糖具有剪切作用[16]，處理時(shí)間太長會破壞多糖的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致多糖得率下降。因此，選擇超聲波處理30 min效果最佳。

2.2.3 超聲功率和酶解時(shí)間對蘆筍多糖得率的影響

圖4 超聲功率(A)和酶解時(shí)間(B)對多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power (A) and enzymolysis time (B) on the extraction yield of polysaccharides

由圖4中A可知，當(dāng)超聲功率從50 W增加到150 W時(shí)，多糖得率增加，隨后多糖得率呈下降趨勢，其原因可能是隨著超聲功率的提高，超聲的空化作用增強(qiáng)，破壞細(xì)胞壁，溶劑更易滲入細(xì)胞中，多糖提取率增加。繼續(xù)增大超聲功率，超聲波的空化作用也會破壞多糖的結(jié)構(gòu)，使得多糖提取率降低，因此選擇150 W作為提取蘆筍多糖的最佳超聲功率。

由圖4中B可知，隨著酶解時(shí)間的延長，多糖得率隨之增加。當(dāng)酶解時(shí)間為50 min時(shí)，多糖得率最高，之后隨著酶解時(shí)間進(jìn)一步增加，多糖得率緩慢下降。主要是因?yàn)榍捌诿附鈺r(shí)間短，酶解不充分，部分多糖未能充分溶出，酶解時(shí)間過長，已溶出的多糖發(fā)生水解。因此，最佳酶解時(shí)間為50 min。

2.2.4 加酶量和酶解溫度對蘆筍多糖得率的影響

圖5 加酶量(A)和酶解溫度(B)對多糖得率的影響Fig.5 Effect of enzyme additive amount (A) and enzymolysis temperature (B) on the extraction yield of polysaccharides

由圖5中A可知，蘆筍多糖得率隨著加酶量的增加呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)加酶量達(dá)到2.5%時(shí)，多糖得率最高，為4.11%。隨著加酶量繼續(xù)增加，多糖得率無顯著性差異。其原因可能是：酶濃度增加，酶與底物接觸的機(jī)會隨之增加，水解的分子數(shù)目也不斷增加，多糖溶出更多，由于加酶量達(dá)到一定程度后，溶液中的酶分子呈飽和狀態(tài)[17]，過剩的酶無法與底物結(jié)合，多糖已基本溶出，多糖得率基本達(dá)到平衡，因而不再升高。因此，最佳加酶量為2.5%。

由圖5中B可知，多糖得率隨著酶解溫度的升高而增加，當(dāng)酶解溫度為50 ℃時(shí)，多糖得率最高，為3.98%，然而酶解溫度繼續(xù)升高，多糖得率卻下降。由于酶解溫度升高，酶活加強(qiáng)，反應(yīng)速度提高，但是酶解溫度太高，部分酶變性失活[18]，多糖得率隨之下降。因此，最佳酶解溫度為50 ℃。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，綜合考慮各因素以及拐點(diǎn)波動(dòng)大小等對多糖得率的影響，選擇加酶量、超聲時(shí)間和料液比3個(gè)因素為自變量，以蘆筍多糖得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn)，共包括17組實(shí)驗(yàn)方案，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.3.2 響應(yīng)面分析

利用Design-Expert軟件對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到蘆筍多糖提取率的回歸方程：Y=4.084+0.084A-0.034B+0.17C+0.013AC-0.092BC-0.094A2-0.41B2-0.24C2。

對回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸方程各項(xiàng)的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

注：“*”表示差異顯著(P<0.05)；“**”表示差異極顯著(P<0.01)。

回歸模型的P值<0.0001，差異極顯著，失擬項(xiàng)P值為0.5570，差異不顯著，說明回歸模型具有良好的擬合度，可以用來分析和預(yù)測蘆筍多糖的最佳提取工藝。模型相關(guān)系數(shù)R2為0.9882>0.80，說明98.82%以上的數(shù)據(jù)都可以通過該數(shù)學(xué)模型來解釋。證明回歸方程具有較高的可信度。在3個(gè)因素中，對蘆筍多糖提取率影響大小依次為料液比>加酶量>超聲時(shí)間。一次項(xiàng)A，C、交互項(xiàng)BC和二次項(xiàng)A2、B2、C2對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響極顯著(P<0.01)，一次項(xiàng)B、交互項(xiàng)AB、AC對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不顯著(P>0.05)，這說明各因素之間與多糖提取率是非線性關(guān)系。

響應(yīng)值蘆筍多糖得率受各因素A、B、C相互作用影響變化構(gòu)成三維空間曲面圖，從響應(yīng)面圖和等高線圖上可直觀反映出單個(gè)因素及兩個(gè)因素之間的相互作用。不同影響因子間的響應(yīng)面及等高線圖見圖6。曲線越陡峭，說明該條件改變對響應(yīng)值影響越大；曲線越平緩，說明因子對響應(yīng)值的影響越小。

圖6 各因素交互作用對多糖含量影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface diagrams and contour diagrams of the interactive effects of various factors on the yield of polysaccharides

由圖6可知，圖6B中曲面圖坡度大于圖6A、圖6C中，圖6A、圖6C中等高線圖幾乎為圓形，所以超聲時(shí)間和料液比對蘆筍多糖得率影響極顯著[19]，超聲時(shí)間和加酶量、加酶量和料液比的相互作用不明顯，這一結(jié)論與表3的分析結(jié)果相吻合。通過對響應(yīng)面回歸方程進(jìn)行分析，確定最佳提取工藝條件為：料液比1∶43.8，加酶量2.734%，超聲時(shí)間29.159 min。在最佳提取條件下，蘆筍多糖提取率為4.137%。實(shí)際操作中，料液比為1∶44，加酶量為2.7%，超聲時(shí)間為29 min，在最佳提取條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，最終蘆筍多糖平均提取率為4.12%，與理論預(yù)測值相比，相對誤差為0.41%，實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性較好，結(jié)果穩(wěn)定，具有有效性。

2.4 抗氧化能力結(jié)果分析

2.4.1 DPPH自由基清除能力

圖7 蘆筍多糖對DPPH自由基清除能力 Fig.7 Scavenging ability of asparagus polysaccharides to DPPH free radical

由圖7可知，蘆筍多糖對DPPH自由基的清除能力較強(qiáng)。在質(zhì)量濃度20～100 μg/mL范圍內(nèi)，蘆筍多糖對DPPH自由基的清除能力隨著濃度的增加先增加后趨于穩(wěn)定，清除能力低于相同濃度的Vc對DPPH自由基的清除能力。當(dāng)濃度為60 μg/mL時(shí)，蘆筍多糖對DPPH自由基的清除能力趨于穩(wěn)定，基本保持在74%左右，其對DPPH自由基的清除能力可達(dá)到Vc對DPPH自由基清除能力的2/3以上，表明蘆筍多糖具有良好的清除DPPH自由基的能力。

2.4.2 羥自由基清除能力

圖8 蘆筍多糖對羥自由基清除能力 Fig.8 Scavenging ability of asparagus polysaccharides to hydroxy free radical

由圖8可知，在質(zhì)量濃度為0.2～0.6 mg/mL范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增加，蘆筍多糖對·OH的清除能力逐漸增強(qiáng)，質(zhì)量濃度從0.2 mg/mL增加到0.6 mg/mL，對·OH的清除率從41.02%增加到68.73%，而Vc對·OH的清除率一直維持在極高水平。在質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL時(shí)，蘆筍多糖對·OH的清除率達(dá)到Vc對·OH清除率的50%以上，說明蘆筍多糖具有較好的清除·OH能力。

3 結(jié)論

本研究優(yōu)化了超聲波輔助酶法提取蘆筍多糖的提取工藝參數(shù)。蘆筍多糖提取率的影響順序?yàn)榱弦罕?加酶量>超聲時(shí)間，最佳工藝參數(shù)為料液比1∶44 (g/mL)、超聲時(shí)間29 min、加酶量2.7%。在此最佳條件下蘆筍多糖得率可達(dá)4.12%，且具有較好的抗氧化能力。研究證明，超聲波輔助酶法提取工藝具有提取溫度低、超聲處理時(shí)間短、酶解效率高等優(yōu)點(diǎn)，高效可靠，實(shí)用價(jià)值高。