彭 芳，丁向東，周揚(yáng)帆，王貴明，陳艷宇

子宮頸癌是女性第三大常見(jiàn)惡性腫瘤，占所有癌癥的12%。每年有超過(guò)20萬(wàn)女性死于子宮頸癌[1]。在中國(guó)，子宮頸癌的發(fā)病率約為其他發(fā)達(dá)國(guó)家的6倍，且每年約有13萬(wàn)人死于子宮頸癌[2]。因此，鑒定新的有效預(yù)后生物標(biāo)志物是子宮頸癌研究的重要目標(biāo)。

環(huán)狀RNA(circRNAs)是內(nèi)源性非編碼RNA的一類，其結(jié)構(gòu)為共價(jià)環(huán)狀閉合的單鏈RNA。越來(lái)越多的證據(jù)表明，circRNA與多種人類疾病相關(guān)，如動(dòng)脈粥樣硬化[3]、阿爾茨海默病[4]、糖尿病[5]，尤其是腫瘤[6]。大量研究表明，circRNAs在腫瘤進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用，在食管癌中，circ0043898作為腫瘤抑制因子可抑制癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并能誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡和死亡[7]。在非小細(xì)胞肺癌中，circRNAF-circEA-2a作為腫瘤促進(jìn)因子可促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和侵襲[8]。但大多數(shù)circRNAs在子宮頸癌中的功能仍然未知。采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)子宮頸癌細(xì)胞系及組織、正常子宮頸上皮細(xì)胞及正常子宮頸組織中circEPSTI1的表達(dá)，探討circRNA-circEPSTI1在子宮頸癌生長(zhǎng)與侵襲中的作用及機(jī)制，以期為子宮頸癌的治療提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集2016年4月～2018年9月廣東省第二人民醫(yī)院手術(shù)切除的新鮮子宮頸癌組織92例?；颊吣挲g范圍31～65歲，中位年齡51.4歲，≤50歲者42例，>50歲者50例；腫瘤組織≤4 cm者38例，>4 cm者54例；FIGO分期：Ⅰ期35例，Ⅱ期30例，Ⅲ期27例；組織學(xué)分級(jí)：Ⅰ期30例，Ⅱ期37例，Ⅲ期25例；病理類型：鱗癌64例，腺癌28例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者69例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者23例；HPV陽(yáng)性59例，HPV陰性33例。60例正常子宮頸組織來(lái)源于本院同期因子宮良性病變行全子宮切除術(shù)患者，年齡范圍32～58歲，中位年齡50.2歲。標(biāo)本置DEPC水處理后的EP管中，液氮里速凍30 min后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。本?shí)驗(yàn)獲廣東省第二人民醫(yī)院衛(wèi)生委員會(huì)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)收集和使用標(biāo)本組織。

1.2 細(xì)胞及組織SiHa和HeLa人子宮頸癌細(xì)胞株以及End1/E6E7人正常子宮頸上皮細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，用10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，置37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1qRT-PCR 采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)circEPSTI1的表達(dá)。用RNA抽提試劑盒(RNeasy Mini Kit，Qiagen公司)分別抽提三種細(xì)胞株中的總RNA，再經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Biorad公司)合成cDNA于-70 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩＠鋬霰４娴淖訉m頸癌及正常子宮頸組織標(biāo)本放入研缽中，加入少量液氮充分研磨標(biāo)本呈粉末，于研缽中加入0.6 mL Trizol，繼續(xù)研磨標(biāo)本成勻漿后，加入Tube管中，采用Trizol法抽提組織中的總RNA，再經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA存于-70 ℃。具體操作方法依據(jù)文獻(xiàn)[9]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包括2x QuantiTect SYBR Green PCRMaster Mix 10 μL，10x miScript Universal Primer 2 μL，10x miScript Primer Assay 2 μL，Template cDNA 1 μg，RNase-free water加至共20 μL。循環(huán)體系為：Cycle 1：37 ℃ 15 min，3個(gè)循環(huán)；Cycle 2：94 ℃ 5 s，55 ℃ 5 s，70 ℃ 5 s，合計(jì)40個(gè)循環(huán)；Cycle 3：4 ℃ 5 s，在CFX96 qRT-PCR系統(tǒng)上檢測(cè)。以β-actin為內(nèi)參，所測(cè)定的circEPSTI1相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT法分析。

1.3.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染與鑒定 si-circEPSTI1、si-NC質(zhì)粒以及Lipofectamine 2000均購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，CCK-8粉購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。常規(guī)培養(yǎng)SiHa和HeLa細(xì)胞至90%匯合度后收集細(xì)胞，制成每毫升1×105個(gè)細(xì)胞的懸液，按每孔2 mL鋪至6孔板內(nèi)，放置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)50%時(shí)用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。將si-circEPSTI1與si-NC轉(zhuǎn)染質(zhì)粒按轉(zhuǎn)染說(shuō)明分別轉(zhuǎn)染于SiHa和HeLa細(xì)胞中。置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。細(xì)胞分為si-circEPSTI1組與si-NC組，其中si-NC組為si-circEPSTI1組的對(duì)照組，采用qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.3.3CCK-8 分別取上述兩組轉(zhuǎn)染后的SiHa和HeLa細(xì)胞懸液100 μL(約1×103細(xì)胞)接種到96孔板中，設(shè)復(fù)孔6個(gè)；細(xì)胞接種后培養(yǎng)，在監(jiān)測(cè)點(diǎn)時(shí)(第1、2、3、4、5天)，向每孔中加入10 μL CCK-8溶液，輕輕敲擊培養(yǎng)板混勻，避免氣泡產(chǎn)生影響OD值的讀數(shù)；37 ℃孵育2 h，使用Bio-Tek EPOCH2測(cè)量450 nm的OD值；重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.3.4裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn) 4周齡雌性BALB/c裸鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，6只，質(zhì)量(20±2) g。隨機(jī)分為si-circEPSTI1組和si-NC組，每組3只。取HeLa細(xì)胞懸液1 mL(約5×107細(xì)胞)接種于裸鼠一側(cè)腋部皮下，每組3只裸鼠；記錄觀察裸鼠的一般情況、移植瘤形成的時(shí)間及大?。籹i-circEPSTI1組以40 μL si-circEPSTI1進(jìn)行瘤內(nèi)原位多點(diǎn)注射，si-NC組以40 μL si-NC進(jìn)行瘤內(nèi)原位多點(diǎn)注射，每4天1次；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將腫瘤完整剝離并進(jìn)行大體照相，測(cè)量腫瘤體積及重量。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分遵循標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物護(hù)理和實(shí)驗(yàn)室指南并獲得廣東省第二人民醫(yī)院倫理批準(zhǔn)。

1.3.5Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 在Transwell小室(美國(guó)Invitrogen公司)中鋪加8 μL稀釋好的基質(zhì)膠，過(guò)夜形成基質(zhì)膜。在Transwell小室上層分別接種轉(zhuǎn)染si-circEPSTI1或si-NC轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的SiHa或HeLa細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液濃度為每毫升1×105個(gè)細(xì)胞，接種量100 μL。下腔加500 μL含20%FBS的培養(yǎng)液。置37 ℃溫箱中孵育36 h，取出，用棉簽擦棄小室上層未遷移的細(xì)胞，PBS液輕洗，4%多聚甲醛固定、結(jié)晶祡染色下層穿出細(xì)胞，PBS液洗，倒置，晾干。光鏡下觀察拍照，隨機(jī)選取4個(gè)高倍視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6Western blot法 采用Western blot法檢測(cè)circEPSTI1對(duì)EPSTI1、Twist、Slug蛋白的表達(dá)。HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收獲細(xì)胞。RIPA裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法測(cè)定細(xì)胞的蛋白濃度，每組取等量樣本進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，加入EPSTI1、Twist、Slug抗體或β-actin抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，4 ℃過(guò)夜，TBST洗膜，加二抗孵育1 h，洗膜，ECL發(fā)光，X片曝光、顯影、定影，掃描圖片，并計(jì)算結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 人子宮頸癌細(xì)胞及組織中circEPSTI1的表達(dá)qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，人子宮頸癌細(xì)胞株SiHa和HeLa細(xì)胞中circEPSTI1的表達(dá)水平分別為1.726±0.046、1.589±0.039，與正常子宮頸上皮細(xì)胞株End1/E6E7細(xì)胞的表達(dá)水平(0.638±0.058)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖1A)。子宮頸癌組織中circEPSTI1的表達(dá)水平為1.718±0.036，與正常子宮頸組織中的表達(dá)水平(0.613±0.023)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖1B)。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)circEPSTI1在人子宮頸癌SiHa細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、正常子宮頸上皮細(xì)胞End1/E6E7和子宮頸癌組織、正常子宮頸組織中的表達(dá)

與正常子宮頸上皮細(xì)胞和正常子宮頸組織相比，**P<0.01

2.2 子宮頸癌組織中circEPSTI1的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系circEPSTI1的表達(dá)水平與FIGO分期、組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，在FIGO分期為I期的患者中的表達(dá)明顯低于FIGO分期為Ⅱ～Ⅲ期的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.025)；在組織學(xué)分級(jí)為I期的患者中circEPSTI1的表達(dá)明顯低于組織學(xué)分級(jí)為Ⅱ+Ⅲ期的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)；在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中circEPSTI1的表達(dá)明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.038)；circEPSTI1的表達(dá)與患者年齡(50歲分界)、腫瘤大小、病理類型、HPV感染無(wú)關(guān)(P>0.05，表1)。

2.3 敲減circRNA-circEPSTI1對(duì)子宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響為進(jìn)一步評(píng)估circEPSTI1在子宮頸癌細(xì)胞中所發(fā)揮的生物學(xué)功能，通過(guò)轉(zhuǎn)染si-circEPSTI1的方式敲減子宮頸癌細(xì)胞系(SiHa和HeLa細(xì)胞)中circEPSTI1的表達(dá)。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染si-circEPSTI1后，子宮頸癌細(xì)胞系(SiHa和HeLa細(xì)胞)中circEPSTI1的表達(dá)水平均顯著下調(diào)(P<0.01)(圖2)。

表1 子宮頸癌中circEPSTI1的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

*P<0.05

圖2 qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染si-circEPSTI1后SiHa和HeLa細(xì)胞中circEPSTI1的表達(dá)與si-NC組相比，**P<0.01

為探討circEPSTI1在體外對(duì)子宮頸癌細(xì)胞的增殖作用，采用CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，在子宮頸癌細(xì)胞系(SiHa和HeLa細(xì)胞)中，與si-NC組相比，si-circEPSTI1組細(xì)胞在450 nm處的OD值明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖3)。提示通過(guò)抑制circEPSTI1的表達(dá)水平，能夠顯著抑制子宮頸癌細(xì)胞系的增殖。

圖3 CCK-8法檢測(cè)si-circEPSTI1對(duì)SiHa(A)和HeLa(B)細(xì)胞增殖能力的影響與si-NC組相比，**P<0.01

為了探討circEPSTI1在體內(nèi)對(duì)子宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)作用，進(jìn)行了裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)。在皮下注射裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)連續(xù)28天的觀察發(fā)現(xiàn)，si-circEPSTI1組的裸鼠腫瘤質(zhì)量明顯低于si-NC組(P<0.05)(圖4)。此結(jié)果表明，敲低circEPSTI1表達(dá)水平，在體內(nèi)能夠顯著抑制子宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

為進(jìn)一步檢測(cè)circEPSTI1在體外對(duì)子宮頸癌細(xì)胞侵襲能力的影響，采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，結(jié)果顯示在子宮頸癌細(xì)胞系(SiHa和HeLa細(xì)胞)中，與si-NC組相比，si-circEPSTI1組的子宮頸癌細(xì)胞穿過(guò)基質(zhì)膜的數(shù)目明顯減少(P<0.01)(圖5)。提示敲低circEPSTI1表達(dá)水平，能夠抑制子宮頸癌細(xì)胞的侵襲能力。

2.4 Western blot法檢測(cè)si-circEPSTI1對(duì)EPSTI1、Twist、Slug蛋白表達(dá)的影響Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，在子宮頸癌HeLa細(xì)胞中，si-circEPSTI1組EPSTI1、Twist、Slug蛋白表達(dá)水平明顯低于si-NC組(圖6)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。提示敲低circEPSTI1表達(dá)水平能顯著抑制EPSTI1、Twist、Slug的表達(dá)。

圖4 裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)si-circEPSTI1對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響與si-NC組相比，*P<0.05

圖5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)si-circEPSTI1對(duì)SiHa和HeLa細(xì)胞侵襲能力的影響

圖6 Western blot法檢測(cè)si-circEPSTI1對(duì)EPSTI1、Twist、Slug蛋白表達(dá)的影響

3 討論

circRNA具有豐富的跨物種保守特征，在唾液、血液和外泌體中穩(wěn)定表達(dá)，且具有組織/發(fā)育階段特異性，滿足有希望的癌癥生物標(biāo)志物的要求。此外，因circRNA數(shù)量相對(duì)較少，故比miRNA更容易被檢測(cè)到。越來(lái)越多的研究報(bào)道，circRNAs參與腫瘤的進(jìn)展。在胃癌中circ_002059表達(dá)下調(diào)，并與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)[10]。circ_100855在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中顯著上調(diào)和circ_104912顯著下調(diào)，并且兩者的表達(dá)與腫瘤分期和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，提示circ_100855與circ_104912是喉鱗狀細(xì)胞癌潛在的新的生物標(biāo)志物[11]。Yao等[12]發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌中circRNA_100876上調(diào)，且其上調(diào)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期及預(yù)后密切相關(guān)，提示circRNA_100876可能作為非小細(xì)胞肺癌預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物和治療新靶點(diǎn)。circBRAF在高級(jí)別(Ⅲ和Ⅳ)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)顯著低于低級(jí)別(I和II)，circBRAF可能是膠質(zhì)瘤患者病理分級(jí)和預(yù)后的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物[13]。circRNA_000479來(lái)自于EPSTI1基因，位于染色體13q14上，因此將circRNA_000479命名為“circEPSTI1”。研究發(fā)現(xiàn)circEPSTI1在骨肉瘤、卵巢癌及三陰型乳腺癌中的表達(dá)均增高[9,14-15]，circEPSTI1的表達(dá)增高與三陰型乳腺癌的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期呈正相關(guān)，并且亦與患者總生存期和無(wú)瘤生存期相關(guān)[9]。目前，只有少數(shù)報(bào)道有關(guān)子宮頸癌circRNAs的研究。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)circEPSTI1在子宮頸癌細(xì)胞與組織中高表達(dá)，并且circEPSTI1的表達(dá)水平與FIGO分期、腫瘤分級(jí)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，與上述研究相符。提示circEPSTI1在子宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮重要的功能。

研究報(bào)道，circRNA以miRNA海綿或競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNAs(ceRNAs)的形式調(diào)節(jié)基因表達(dá)。研究顯示，不同的circRNA在腫瘤中功能各異。有些充當(dāng)腫瘤抑制因子，而有些充當(dāng)腫瘤促進(jìn)因子樣作用。如在非小細(xì)胞肺癌中，hsa_circ_0033155可作為腫瘤抑制因子調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、集落形成和遷移[16]。在膀胱癌中，過(guò)表達(dá)circTCF25通過(guò)circTCF25-miR-103a-3p/CDK6途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移[17]。在三陰型乳腺癌中，circEPSTI1通過(guò)吸附miR-4753和miR-6809調(diào)節(jié)BCL11A表達(dá)，從而影響細(xì)胞的增殖和凋亡[9]。在骨肉瘤中，circEPSTI1通過(guò)miR-892b-MCL1軸調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在子宮頸癌細(xì)胞中減少circEPSTI1表達(dá)，抑制體外培養(yǎng)癌細(xì)胞的增殖和侵襲，同時(shí)抑制異種移植瘤的生長(zhǎng)，提示circEPSTI1可能促進(jìn)子宮頸癌的進(jìn)展。EPSTI1是定位于13q13.3染色體的干擾素應(yīng)答基因，研究發(fā)現(xiàn)EPSTI1在浸潤(rùn)性乳腺癌中高度表達(dá)并參與乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡[18]。研究還發(fā)現(xiàn)，EPSTI1可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[19]。EPSTI1的表達(dá)對(duì)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化有促進(jìn)作用[18]。因此，EPSTI1是一個(gè)重要的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)因子。本實(shí)驗(yàn)在敲減circEPSTI1表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)子宮頸癌細(xì)胞中的EPSTI1、Twist、Slug蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)，提示circEPSTI1促進(jìn)子宮頸癌中細(xì)胞的生長(zhǎng)與侵襲可能是通過(guò)調(diào)控EPSTI1、Twist、Slug信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，circEPSTI1在子宮頸癌細(xì)胞系與組織中高表達(dá)并與子宮頸癌的高級(jí)別FIGO分期、高組織學(xué)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。敲減circEPSTI1表達(dá)，能夠抑制子宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)與侵襲，其機(jī)制可能與調(diào)控EPSTI1、Twist、Slug信號(hào)通路有關(guān)。因此，circEPSTI1可能有望成為子宮頸癌潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。