鄭露露，蔡永萍,2，胡 勇，魯康洋，何桂芳，李明鳳，曹立宇,2，尹 玉,2

骨肉瘤是常見的骨原發(fā)性高度惡性腫瘤，好發(fā)于青少年。自采用新輔助化療聯(lián)合手術(shù)切除綜合治療后，患者5年生存率從10%～20%提高到60%～70%，但對化療耐藥的患者預(yù)后較差，易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[1]。化療耐藥成為制約骨肉瘤療效的瓶頸。近年研究表明，腫瘤干細(xì)胞是一群具有自我更新能力、不對稱分裂的細(xì)胞亞群，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和化療耐藥具有密切關(guān)系[2]。

新近研究發(fā)現(xiàn)，叉頭轉(zhuǎn)錄因子1(FoxM1)不僅在促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中扮演重要角色，還參與腫瘤的化療耐藥[3]。Yuan等[4]報道FoxM1通過促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的更新參與化療耐藥。本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxM1通過上調(diào)DNA損傷修復(fù)蛋白表達(dá)促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞對順鉑化療藥物的耐藥[5]，但FoxM1是否通過調(diào)控腫瘤干細(xì)胞化參與順鉑的化療耐藥，目前尚未見報道。本實驗主要探討FoxM1是否促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞化參與骨肉瘤細(xì)胞對順鉑的化療耐藥，期望為逆轉(zhuǎn)骨肉瘤化療耐藥提供新思路和治療靶點。

1 材料與方法

1.1 試劑骨肉瘤細(xì)胞系MG-63購自中科院上海細(xì)胞庫。FoxM1抗體(克隆號ab175798)購于Abcam公司。β-actin抗體(克隆號4970T)購于CST公司。Sox-2(克隆號WLA022)、Nanog(克隆號WL00982)、Oct-4(克隆號WL02020)抗體，均購于萬類生物公司。HRP標(biāo)記的抗兔二抗、DMSO(二甲亞砜)購于碧云天公司。bFGF、EGF、DMEM/F12、限制性內(nèi)切酶購于Gibco公司。RPMI 1640培養(yǎng)基購于Hyclone公司。Polybrene和嘌呤霉素購于Sigma公司。Lipofectamine 2000及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Invitrogen公司。Thiostrepton(CAS 1393-48-2)、PLKO載體、過表達(dá)質(zhì)粒PCDH載體，均購于Sigma-Aldrich公司。滅活胎牛血清(FBS)購于Biological Industries公司。非黏附性6孔板購于NEST公司。順鉑(CDP)購于南京制藥廠。質(zhì)粒測序由安徽通用生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞在含10%滅活胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每2～3天棄舊液，PBS清洗，更換新的培養(yǎng)液，細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化傳代繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2耐藥細(xì)胞系的建立 將對數(shù)生長期的MG-63細(xì)胞接種于小皿，0.1 μg/mL培養(yǎng)48 h后更換為無順鉑的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)80%～90%后傳代，重復(fù)上述3次后藥物濃度增加為0.2 μg/mL，依此遞增順鉑濃度繼續(xù)誘導(dǎo)細(xì)胞耐藥，約17周后得到在2 μg/mL濃度下穩(wěn)定生長和傳代耐藥細(xì)胞命名為MG-63R。

1.2.3慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)FoxM1細(xì)胞 FoxM1克隆引物序列如下：FoxM1正義鏈：5′-AGAGCTAGCGAATTCATGAAAACTAGCCCCCGTCG-3′；反義鏈：5′-CGCGGCCGCGGATCCGTACTGTAGC TCAGGAATAAACTGGG-3′。對FoxM1擴增產(chǎn)物經(jīng)測序驗證。將750 μL opti-MEM和60 μL Lipofectamine 2000混合物與750 μL opti-MEM、12 μg質(zhì)粒(LV-NC或LV-FoxM1)、6 μg包裝病毒質(zhì)粒和1.5 μg VSVG的混合物，混合后室溫靜置20 min，將其加入293T細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)6 h后更換培養(yǎng)基，隔天收獲293T的培養(yǎng)基病毒上清。取2 mL，同時加入2 μL Polybrene，用于培養(yǎng)MG-63細(xì)胞，6 h后添加2 mL培養(yǎng)液，第2天更換新鮮培養(yǎng)液。1 μg/mL的嘌呤霉素篩選感染細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.4MTT法 采用MTT法檢測IC50值。每孔8×103個細(xì)胞，設(shè)置5個復(fù)孔。第2天，棄去培養(yǎng)基，每孔加入順鉑濃度分別為0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μg/mL，聯(lián)合使用4 μmol/L Thiostrepton或單獨使用順鉑。第3天，每孔中加入新鮮配置的MTT溶液，37 ℃的溫度下保存4 h后棄去液體，每孔加入150 μL DMSO，紫色結(jié)晶溶解，室溫?fù)u床搖10 min，490 nm處測定吸光度。

1.2.5細(xì)胞增殖實驗 每孔2×103個細(xì)胞，設(shè)置5個復(fù)孔。24 h后棄去培養(yǎng)基，每孔加入2 μg/mL的順鉑，聯(lián)合使用4 μmol/L Thiostrepton或單獨使用順鉑。第1、2、3、4和5天，每孔中加入新鮮配置的MTT溶液，37 ℃的溫度下保存4 h后棄去液體，每孔加入150 μL DMSO，紫色結(jié)晶溶解，室溫?fù)u床搖10 min，490 nm處測定吸光度。

1.2.6Western blot法 提取總蛋白，采用BCA進(jìn)行蛋白定量，每孔加入蛋白樣品總量約80 μg進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒流200 mA轉(zhuǎn)膜2 h后用5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜。TBST清洗3次，每次5 min，加入HRP標(biāo)記的抗兔二抗(1 ∶10 000稀釋)孵育1 h，TBST清洗3次，顯影并用Image J軟件分析處理條帶。一抗稀釋比：FoxM1(1 ∶1 000)、Sox-2(1 ∶500)、Nanog(1 ∶500)、Oct-4(1 ∶500)和β-actin(1 ∶1 000)。

1.2.7無血清培養(yǎng)懸浮克隆球試驗 將MG-63、MG-63F、MG-63V、MG-63R細(xì)胞接種于低黏附6孔板，每孔接種3 000個細(xì)胞，加入1 mL的含20 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF的DMEM/F12無血清培養(yǎng)基。間隔3天加入500 μL含10 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF的DMEM/F12的無血清培養(yǎng)基。第3天加入4 μmol/L Thiostrepton。培養(yǎng)2周后隨機選取10個不同視野用倒置顯微鏡計數(shù)大于直徑50 μm球體。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤耐藥細(xì)胞和親本細(xì)胞中FoxM1蛋白的表達(dá)運用濃度遞增方法誘導(dǎo)篩選骨肉瘤親本MG-63細(xì)胞，獲得穩(wěn)定在2 μg/mL順鉑中生長良好的耐藥細(xì)胞系MG-63R。與MG-63相比，MG-63R對順鉑的抵抗性更強，其IC50由親本細(xì)胞的1.27增加到7.36(圖1A)。2 μg/mL順鉑處理后，與MG-63相比，MG-63R增殖能力明顯增強(圖1B)。Western blot法檢測結(jié)果顯示，在MG-63R細(xì)胞中FoxM1蛋白表達(dá)比MG-63細(xì)胞明顯升高(圖1C，P<0.05)。

2.2 利用慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)FoxM1骨肉瘤細(xì)胞MG-63F酶切及測序結(jié)果顯示，慢病毒表達(dá)載體LV-FoxM1構(gòu)建正確，并進(jìn)行慢病毒包裝轉(zhuǎn)染，1 μg/mL的嘌呤霉素進(jìn)行篩選。構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)FoxM1的MG-63F(轉(zhuǎn)染LV-FoxM1)和對照組MG-63V(轉(zhuǎn)染LV-NC)。Western blot法結(jié)果顯示，與對照組相比，MG-63F中FoxM1蛋白表達(dá)水平明顯增高(圖2A)。FoxM1特異性抑制劑4 μmol/L Thiostrepton處理后，MG-63F中FoxM1蛋白水平表達(dá)明顯下降(圖2B)，表明成功構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)FoxM1骨肉瘤細(xì)胞。

圖1 A.MTT法檢測MG-63和MG-63R的IC50值；B.2 μg/mL順鉑處理后對MG-63和MG-63R的增殖能力影響；C.Western blot法檢測MG-63和MG-63R中FoxM1蛋白表達(dá)水平

圖2 A.Western blot法檢測MG-63V和MG-63F細(xì)胞中FoxM1蛋白水平；B.在MG-63F細(xì)胞中，經(jīng)thiostrepton處理后FoxM1蛋白的表達(dá)水平變化

2.3 骨肉瘤耐藥細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞樣特征Western blot法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物Sox-2、Nanog、Oct-4蛋白在MG-63R細(xì)胞中表達(dá)較MG-63細(xì)胞明顯增高(圖3A)。MG-63R細(xì)胞成球能力較親本細(xì)胞強，形成較大的非貼壁球體，懸浮克隆球平均數(shù)量22個，而MG-63細(xì)胞懸浮克隆球數(shù)量平均為14個(圖3B、C，P<0.05)。結(jié)果顯示，同親本MG-63細(xì)胞相比，順鉑耐藥細(xì)胞MG-63R細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞樣特征明顯增強。

圖3 A.Western blot法檢測耐藥細(xì)胞MG-63和MG-63R中腫瘤干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物Sox-2、Nanog、Oct-4蛋白的表達(dá)；B、C.MG-63和MG-63R的平均懸浮克隆球數(shù)目

2.4 FoxM1過表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞樣特征和順鉑耐藥的影響與對照組相比，腫瘤干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物Sox-2、Nanog、Oct-4蛋白在MG-63F細(xì)胞中明顯增強(圖4A)。MG-63F細(xì)胞成球能力強，其懸浮克隆球平均數(shù)量25個，而MG-63V細(xì)胞懸浮克隆球平均數(shù)量為14個(圖4B、C，P<0.05)。同時，MG-63F較對照組表現(xiàn)出更強的順鉑抵抗性，其IC50值由對照組0.96升高到31.23(圖4D)。在順鉑處理后，與MG-63V相比，MG-63F增殖明顯增強(圖4E)。研究結(jié)果提示，F(xiàn)oxM1過表達(dá)促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞對順鉑耐藥，并且腫瘤干細(xì)胞化樣特征增強。

2.5 FoxM1抑制劑對逆腫瘤干細(xì)胞化及對順鉑敏感性的影響結(jié)果顯示，MG-63F中FoxM1抑制劑4 μmol/L Thiostrepton處理后，腫瘤干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物Sox-2、Nanog、Oct-4的蛋白水平表達(dá)明顯降低(圖5A)。4 μmol/L Thiostrepton處理后，MG-63F細(xì)胞懸浮克隆球數(shù)量明顯降低，同時MG-63V細(xì)胞懸浮克隆球數(shù)量也明顯減少(圖5B、C)。4 μmol/L Thiostrepton處理后，MG-63F細(xì)胞對順鉑的耐藥性降低，其IC50值由17.22降為0.62(圖5D)。與單獨使用2 μg/mL順鉑相比，聯(lián)合使用4 μmol/L Thiostrepton和2 μg/mL順鉑處理后，MG-63F增殖能力明顯降低(圖5E)。以上結(jié)果表明，抑制FoxM1表達(dá)可能通過抑制骨肉瘤細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞化逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥性，從而增強其對順鉑的敏感性。

3 討論

骨肉瘤是發(fā)生于青少年的常見骨原發(fā)性高度惡性腫瘤，新輔助化療耐藥的患者術(shù)后易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，5年生存率不足20%[6]。探索化療耐藥機制及尋找逆轉(zhuǎn)靶點成為骨肉瘤患者治療面臨的一大難題[7]。目前研究發(fā)現(xiàn)多種因素參與化療耐藥，包括細(xì)胞膜泵藥物外排能力增強、抗凋亡能力和DNA損傷修復(fù)能力增強和獲得腫瘤干細(xì)胞樣特征等[8]。

大量研究表明對化療藥物具有抵抗性的一群細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞特征，傳統(tǒng)的化療藥物治療可以消滅大多數(shù)處于增殖期的腫瘤細(xì)胞，但是具有耐藥性的腫瘤干細(xì)胞會再次增殖分化形成腫瘤的復(fù)發(fā)[9]。體外無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)懸浮克隆球是常見的檢測腫瘤干細(xì)胞能力形成的實驗，也可用來富集腫瘤干細(xì)胞[9-10]。但目前關(guān)于骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞亞群對化療藥物抵抗性增加的具體機制尚不清楚[2]。Basu-Roy等[11]研究發(fā)現(xiàn)，Sox2通過拮抗Hippo通路，促進(jìn)骨肉瘤干細(xì)胞增殖和更新。也有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞對化療藥物抵抗性可能與ABC轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)增高促進(jìn)藥物外排能力有關(guān)[10,12]。

最初發(fā)現(xiàn)FoxM1是調(diào)控細(xì)胞周期重要的轉(zhuǎn)錄因子，隨后研究發(fā)現(xiàn)FoxM1也可通過調(diào)控下游AKT通路等參與傳統(tǒng)抗腫瘤化療藥物的耐藥[13]。本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，順鉑耐藥骨肉瘤細(xì)胞高表達(dá)FoxM1，臨床骨肉瘤組織樣本中高表達(dá)FoxM1的患者生存率較低[14]，新輔助化療耐藥患者預(yù)后往往較差，推測FoxM1高表達(dá)可能與骨肉瘤化療耐藥相關(guān)。但FoxM1是否通過調(diào)控腫瘤干細(xì)胞化參與化療耐藥，目前尚不清楚。本實驗結(jié)果顯示，與親本細(xì)胞相比，骨肉瘤順鉑耐藥細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞樣標(biāo)志物(Sox-2、Oct-4、Nanog)表達(dá)增強，無血清培養(yǎng)試驗顯示平均懸浮克隆球數(shù)目增多。文獻(xiàn)報道[15-16]骨肉瘤順鉑耐藥細(xì)胞高表達(dá)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，更容易形成懸浮球，在小鼠體內(nèi)更易形成腫瘤，與本實驗結(jié)果一致。穩(wěn)定過表達(dá)FoxM1骨肉瘤細(xì)胞具有和順鉑耐藥細(xì)胞同樣的表型，包括對順鉑耐藥性增強，同時腫瘤干細(xì)胞樣特征明顯增強，和平均懸浮克隆球數(shù)目也顯著增高。由此作者推測FoxM1過表達(dá)可能通過促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞特征參與骨肉瘤順鉑耐藥。與本實驗結(jié)果一致，Hou等[12]報道FoxM1表達(dá)促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞特征參與鼻咽癌化療耐藥。但后續(xù)可能需要更多的其它實驗如動物成瘤實驗等，進(jìn)一步驗證FoxM1過表達(dá)的細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞特征。

圖4 A.Western blot法檢測MG-63V和MG-63F中腫瘤干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物Sox-2、Nanog、Oct-4的蛋白表達(dá)水平；B、C.MG-63V和MG-63F的平均懸浮克隆球數(shù)目；D.MTT法檢測MG-63V和MG-63F的IC50值；E.檢測在順鉑作用下MG-63V和MG-63F的增殖能力

圖5 A.Western blot法檢測MG-63F中4 μmol/L Thiostrepton處理后對腫瘤干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物蛋白Sox-2、Nanog、Oct-4表達(dá)的影響；B、C. 4 μmol/L Thiostrepton分別處理MG-63V、MG-63F細(xì)胞后其相應(yīng)平均懸浮克隆球數(shù)目變化；D.MTT法檢測MG-63F中4 μmol/L Thiostrepton處理后IC50的值；E.4 μmol/L Thiostrepton處理后MG-63F增殖能力變化

本實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxM1抑制劑Thiostrepton處理后，能夠顯著逆轉(zhuǎn)穩(wěn)定過表達(dá)FoxM1骨肉瘤細(xì)胞對順鉑的耐藥性，推測抑制FoxM1表達(dá)可能通過逆轉(zhuǎn)骨肉瘤細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞化表型，增加骨肉瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性。但FoxM1促進(jìn)骨肉瘤干細(xì)胞表達(dá)的具體機制目前尚不清楚，仍需進(jìn)一步研究，深入探討其發(fā)生的分子機制。Yuan等[4]研究發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中，F(xiàn)oxM1通過與泛素樣含PHD蛋白和環(huán)指域蛋白(UHRF1)基因的FKH motifs區(qū)域結(jié)合促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞更新和紫杉烷的耐藥性。最近報道發(fā)現(xiàn)FoxM1通過下調(diào)DNA雙鏈損傷介導(dǎo)修復(fù)途徑促進(jìn)鼻咽癌對順鉑的化療耐藥[17]，也有研究顯示FoxM1高表達(dá)通過上調(diào)ABCC10促進(jìn)藥物外排參與結(jié)直腸癌對5-FU的耐藥[10]。以上研究表明，F(xiàn)oxM1除了通過促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞化促進(jìn)化療耐藥，還可能通過促進(jìn)DNA損傷修復(fù)、增加藥物外排能力等機制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的化療耐藥。

綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)FoxM1過表達(dá)可能通過促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞化參與骨肉瘤對順鉑耐藥，抑制FoxM1表達(dá)增加骨肉瘤細(xì)胞耐藥細(xì)胞對順鉑的敏感性，推測FoxM1可能成為骨肉瘤順鉑化療耐藥治療的新靶點。