王 蔚，杜 淵，王洪連，孫長(zhǎng)偵，王 麗，白 雪，楊思進(jìn)

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000）

腦出血是內(nèi)科臨床常見(jiàn)的危急重癥，發(fā)病急，轉(zhuǎn)變快，急性期嚴(yán)重威脅患者生命安全，患病后又往往留有不同程度的后遺癥，給患者的生活質(zhì)量造成不良影響，由此帶來(lái)巨大的社會(huì)和家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。研究表明，諸多炎性因子參與了腦出血的發(fā)病過(guò)程，且與疾病的預(yù)后密切相關(guān)［1-2］。腦出血屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)病”范疇，蛭龍活血通瘀膠囊是我院研制的院內(nèi)中成藥復(fù)方制劑，該藥廣泛用于中風(fēng)患者的防治，取得了滿意療效［3］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察蛭龍活血通瘀膠囊對(duì)腦出血大鼠腦組織病理形態(tài)和血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1（IL-1）及白細(xì)胞介素6（IL-6）的影響，探討該藥防治腦出血的有效作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量260～300 g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SCXK（川）2015-030。飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，環(huán)境溫度22±2℃，濕度30%～40%，普通大鼠飼料喂養(yǎng)，自由攝食及飲水。

1.2 藥物 蛭龍活血通瘀膠囊由黃芪、水蛭、地龍、大血藤、桂枝等藥物組成，規(guī)格為每粒0.4 g（相當(dāng)于含生藥2.625 g），由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)20180216；鹽酸法舒地爾注射液（規(guī)格為每支2 ml∶30 mg，批號(hào)180101，成都菀東藥業(yè)有限公司生產(chǎn)）；TNF-α、IL-1及IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒均為上海優(yōu)選生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 儀器 大鼠腦立體定位儀（北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司）；ATPB457A小動(dòng)物電子稱(chēng)（深圳安普特電子科技有限公司）；BSA224S精密電子天平；cx21FS1光學(xué)顯微照相系統(tǒng)（日本Olympus公司）；國(guó)產(chǎn)BMZ-3型自動(dòng)組織包埋機(jī)（湖北安立信醫(yī)療實(shí)業(yè)有限公司）；德國(guó)Leica石蠟切片機(jī)（北京科譽(yù)興業(yè)科技發(fā)展有限公司）；infinite F50酶標(biāo)儀（奧地利Tecan）；TDZ5-WS醫(yī)用離心機(jī)（長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

2 方 法

2.1 分組與造模 將40只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、腦出血模型組、蛭龍活血通瘀組、鹽酸法舒地爾組，每組10只。實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)前稱(chēng)重，按照0.4 g/kg給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，剪斷鼠尾取自體血50μl。將大鼠以俯臥位固定于立體定位儀上，頭部進(jìn)行備皮消毒以暴露手術(shù)區(qū)域，縱行切開(kāi)頭皮正中約10 mm，用30%雙氧水腐蝕骨膜，暴露前囟和冠狀縫，參照ROSENBER［4］的方法，根據(jù)《腦立體定位圖譜》［5］定位尾殼核區(qū)域，調(diào)整微量進(jìn)樣器使針尖垂直于矢狀縫右側(cè)旁開(kāi)3.0 mm，前囟前0.2 mm處，用三棱針在針尖下方鉆孔，深度達(dá)硬腦膜表面，以顱骨外板為零點(diǎn)進(jìn)針6.0 mm，以5μl/min緩慢勻速將血注入腦內(nèi)，留針約15 min后緩慢退針，骨蠟封閉鉆孔，縫合頭皮并常規(guī)消毒。假手術(shù)組術(shù)中只進(jìn)針，不注血。采用ZEA LONGA 的“5分制法”［6］進(jìn)行術(shù)后大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分，造模成功的大鼠（評(píng)分為1～3分）納入實(shí)驗(yàn)。

2.2 給藥 蛭龍活血通瘀組采用灌胃給藥，每日1.2 g/kg（按成人60 kg用量為3.6 g/d計(jì)算，大鼠為人體用量20倍），灌胃體積為3 ml；鹽酸法舒地爾組采用腹腔注射給藥，每日12 mg/kg（按成人60 kg用量為90 mg/d計(jì)算）［7］；假手術(shù)組和腦出血模型組均給予等體積的生理鹽水灌胃。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 腦組織病理形態(tài) 各組大鼠術(shù)后3 d給予深度麻醉，用0.9%生理鹽水、4%多聚甲醛依次行心臟灌注，快速剪斷鼠頭，剝?nèi)〈竽X，冠狀位切取針孔處含血腫的腦組織，浸泡于4%多聚甲醛中，固定24 h后給予由低到高梯度的乙醇脫水，二甲苯透明，用石蠟包埋制成蠟塊，用切片機(jī)切片，約為5μm厚度，展片、撈片、烤片，經(jīng)二甲苯脫蠟，依次由高到低梯度乙醇浸泡，蒸餾水洗，蘇木青染色后水洗，鹽酸乙醇浸泡后水洗，弱氨水返藍(lán)，伊紅染色后水洗，再由低到高梯度乙醇脫水，二甲苯透明，干燥后用中性樹(shù)膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察血腫周?chē)X組織病理學(xué)改變。

2.3.2 血清中TNF-α、IL-1及IL-6的含量 各組大鼠術(shù)后3 d給予深度麻醉，仰臥位放在操作臺(tái)上，剪開(kāi)胸腔暴露心臟，用采血針經(jīng)心臟采血3～5 ml于采血管中，靜置2 h后，放入離心機(jī)，以3 000 r/min離心10 min，然后分離血清置于-20℃冰箱存放備檢。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）對(duì)大鼠血清TNF-α、IL-1及IL-6進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照各試劑盒使用說(shuō)明書(shū)的要求完成。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析（One-way ANOVA），LSD及Dunnett法作多重比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組血腫周?chē)X組織HE染色比較 假手術(shù)組：血腫周?chē)X組織結(jié)構(gòu)清晰、完整，神經(jīng)細(xì)胞胞體規(guī)律排列，胞漿染色均勻，無(wú)明顯腫脹；腦出血模型組：血腫周?chē)X組織呈明顯水腫，細(xì)胞核固縮，廣泛液化，細(xì)胞間隙結(jié)構(gòu)紊亂，血管周?chē)目障对龃?，組織結(jié)構(gòu)疏松，局部有出血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及膠質(zhì)細(xì)胞增生；與腦出血模型組比較，蛭龍活血通瘀組和鹽酸法舒地爾組的血腫周?chē)X組織水腫程度明顯減輕，細(xì)胞層次也較清楚，神經(jīng)細(xì)胞液化、壞死等均有所減輕，病理形態(tài)得到明顯改善。見(jiàn)圖1。

圖1 各組血腫周?chē)X組織HE染色比較（×400）

3.2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1及IL-6的含量比較 見(jiàn)表1。與假手術(shù)組比較，腦出血模型組大鼠血清TNF-α、IL-1及IL-6的含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與腦出血模型組比較，蛭龍活血通瘀組、鹽酸法舒地爾組大鼠血清TNF-α、IL-1及IL-6的含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；蛭龍活血通瘀組和鹽酸法舒地爾組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1及IL-6的含量比較 （pg/ml，x±s）

4 討 論

腦出血后造成神經(jīng)系統(tǒng)損傷和功能障礙的機(jī)制尚未完全明確，但血腫周?chē)X水腫形成是影響腦出血后病情轉(zhuǎn)歸和預(yù)后的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而炎性反應(yīng)在其中產(chǎn)生了重要作用。喻明等［8］研究表明，腦出血后機(jī)體的適度炎性反應(yīng)對(duì)血腫吸收和壞死組織清除具有一定的作用，而一旦炎性反應(yīng)過(guò)度則會(huì)導(dǎo)致并加重腦水腫，影響出血區(qū)的腦血流量，增加血-腦脊液屏障通透性，使其結(jié)構(gòu)破壞進(jìn)而導(dǎo)致腦組織一系列繼發(fā)性損傷。白細(xì)胞在病區(qū)局部聚集和黏附是炎性反應(yīng)的重要標(biāo)志，其中包括中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，由此釋放多種炎性因子，如TNF-α、IL-6等。這些由免疫細(xì)胞產(chǎn)生的小分子多肽具有很高的免疫活性，能介導(dǎo)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、機(jī)體代謝和炎性反應(yīng)。研究證實(shí)，炎性因子在腦出血病理生理機(jī)制中具有重要作用［9］，在急性腦出血中能夠激活、介導(dǎo)腦組織的繼發(fā)性損傷。

炎性因子中TNF-α屬于前炎性因子，是機(jī)體炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中由小膠質(zhì)細(xì)胞及星形細(xì)胞分泌，通過(guò)激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管收縮，影響血-腦脊液屏障通透性，并可使小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞變形腫脹，釋放大量氧自由基及興奮性氨基酸，與其他炎性因子如IL-1、IL-6協(xié)同作用，加重腦出血后腦水腫的發(fā)生［10］。IL-1是一類(lèi)具有廣泛作用的多肽，其與細(xì)胞膜上IL-1受體相結(jié)合，通過(guò)G蛋白發(fā)揮作用。在腦組織中，IL-1主要參與T和B淋巴細(xì)胞的增殖和分化，刺激造血干細(xì)胞分化，參與炎性反應(yīng),亦是多形核白細(xì)胞的直接及間接趨化因子，引起血腫周?chē)奂嘈魏思?xì)胞，炎癥介質(zhì)激活，誘導(dǎo)黏附分子合成及釋放，使腦組織損傷加重。IL-6是一種分子量約為26 KD的細(xì)胞因子，在腦組織受到損傷時(shí)，可由小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生，同時(shí)周?chē)蟹置贗L-6的白細(xì)胞數(shù)量也增多，從而使血清中IL-6含量升高，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成神經(jīng)毒性作用［11］。研究報(bào)道，腦出血患者在起病后3～4 d血腫周?chē)X水腫的程度與起病24 h內(nèi)TNF-α的含量相關(guān)，腦出血患者血漿中TNF-α與IL-6水平于發(fā)病后3 d達(dá)到高峰,這與腦組織水腫及炎性反應(yīng)最嚴(yán)重的時(shí)期相吻合,并且隨著病程的延長(zhǎng)，腦水腫得到改善后TNF-α和IL-6的水平也有所下降［12-13］。

Ras同源基因/Rho相關(guān)螺旋卷曲蛋白激酶（Ras homolog gene/a Rho-associated coiled coil-forming protein kinase，Rho/ROCK）作為機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種信號(hào)傳遞通路，能夠介導(dǎo)腦出血后炎癥反應(yīng)，影響血腦屏障通透性，與腦水腫密切相關(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致腦組織損傷。Rho激酶抑制劑通過(guò)抑制Rho激酶活性，可抑制炎性反應(yīng)，抗血管痙攣及促進(jìn)神經(jīng)損傷后修復(fù)，具有神經(jīng)保護(hù)作用，通過(guò)抑制該通路的激活，可抑制血管收縮和炎性因子的釋放［14］。鹽酸法舒地爾是一種新型的Rho激酶抑制劑，也是目前唯一一種應(yīng)用于臨床的Rho激酶抑制劑，研究顯示，它可通過(guò)抑制磷酸化過(guò)程起到抑制炎性細(xì)胞遷移、浸潤(rùn)，減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)損傷，并可保護(hù)血-腦脊液屏障，減輕腦出血后腦水腫，促進(jìn)腦損傷后神經(jīng)功能修復(fù)［15-17］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，鹽酸法舒地爾可降低大鼠血清TNF-α、IL-6水平，減輕腦出血后的腦血管痙攣［18］。

蛭龍活血通瘀膠囊是我院常用的院內(nèi)制劑，被廣泛應(yīng)用臨床心腦血管疾病的治療中，該藥全方具有益氣祛痰、活血化瘀、溫經(jīng)通絡(luò)、養(yǎng)血祛風(fēng)之效［19］。前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明［20-21］，該藥能改善腦出血大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分，降低腦含水量，能明顯抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）活化，促進(jìn)蛋白酶激活受體-1（PAR-1）的表達(dá)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，對(duì)腦出血大鼠具有腦保護(hù)作用。為進(jìn)一步探索蛭龍活血通瘀膠囊防治腦出血的作用機(jī)制，本研究以自體血制備腦出血實(shí)驗(yàn)大鼠模型，以ROCK抑制劑鹽酸法舒地爾為陽(yáng)性對(duì)照藥，觀察蛭龍活血通瘀膠囊對(duì)大鼠腦出血后血清炎性因子TNF-α、IL-1及IL-6水平的影響。結(jié)果表明，蛭龍活血通瘀膠囊能明顯改善腦出血大鼠腦組織病血腫周?chē)±硇螒B(tài)，可能與顯著降低腦出血大鼠血清TNF-α、IL-1及IL-6炎性因子的水平有關(guān)，但其機(jī)制是否與鹽酸法舒地爾通過(guò)抑制ROCK通路調(diào)節(jié)炎性因子的釋放相似，尚待進(jìn)一步探索。