王 彪， 周新麗

（上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

微流控芯片技術(shù)通常指的是在幾平方厘米的載體上實(shí)現(xiàn)微納水平流體的操控與反應(yīng)的科學(xué)技術(shù)[1]。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，該技術(shù)已在核酸、蛋白、細(xì)胞以及類組織、器官等多個(gè)層次的研究與應(yīng)用方面取得了突破性進(jìn)展[2-3]。尤其是芯片上基于細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，在細(xì)胞分析、體外組織與器官的模擬、藥物篩選等方面具有應(yīng)用潛力[4]。芯片上的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前提之一是有效的芯片上細(xì)胞培養(yǎng)。然而，與采用培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶等傳統(tǒng)宏觀狀態(tài)下的細(xì)胞培養(yǎng)相比，微流控芯片上的細(xì)胞培養(yǎng)在載體的形式與材料特性、培養(yǎng)體系的比表面積等方面存在顯著差異[5-6]。長(zhǎng)期的體外細(xì)胞培養(yǎng)表明，對(duì)于黏附型生長(zhǎng)細(xì)胞，附著表面的理化特性對(duì)細(xì)胞的黏附、增殖、分化等過程具有重要影響，親水性表面更易于細(xì)胞的黏附增殖[7]；此外，培養(yǎng)體系的比表面積顯著作用于細(xì)胞的生長(zhǎng)微環(huán)境，隨著體系比表面積的增大，細(xì)胞與微環(huán)境間質(zhì)能交換活動(dòng)加強(qiáng)，基質(zhì)中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗加快、代謝廢物更易積累[6]；培養(yǎng)基組分及更換頻率同樣是細(xì)胞培養(yǎng)過程中的關(guān)鍵因素，提高基質(zhì)中血清、生長(zhǎng)因子濃度往往能夠促進(jìn)細(xì)胞更快地生長(zhǎng)。上述微流控芯片上細(xì)胞培養(yǎng)與傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)之間的差異導(dǎo)致芯片上細(xì)胞的生長(zhǎng)行為發(fā)生改變[8]。因此，實(shí)現(xiàn)芯片上細(xì)胞的有效培養(yǎng)必須在參考傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)方案的基礎(chǔ)上進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。

目前，用于細(xì)胞培養(yǎng)的微流控芯片材質(zhì)主要有聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）、聚苯乙烯、玻璃等，結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)主要有微通道、微腔室及兩者的組合等多種形式，并實(shí)現(xiàn)了鼠成纖維細(xì)胞（Ng3T3）、人肺癌細(xì)胞（PLETCs）以及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）等多型細(xì)胞的芯片上二維（2D）或三維（3D）、靜態(tài)或灌注等方式的培養(yǎng)[9-12]。PDMS、玻璃由于易加工成型、價(jià)格低廉、透光等優(yōu)點(diǎn)通常被用于細(xì)胞培養(yǎng)芯片的制作，然而，PDMS 存在未聚合單體滲漏、非特異性分子吸附等缺點(diǎn)，玻璃表面不易于細(xì)胞的長(zhǎng)期黏附生長(zhǎng)，因此，PDMS、玻璃等材料在用于芯片上細(xì)胞培養(yǎng)之前必須進(jìn)行相應(yīng)的表面處理[9]。文獻(xiàn)[13-14]通過化學(xué)接枝的方式對(duì)PDMS 進(jìn)行表面改性，促進(jìn)了細(xì)胞的黏附與增殖，但這些方法涉及多步化學(xué)反應(yīng)，增加了方案的復(fù)雜性。Jastrzebska 等[15]通過表面包被聚賴氨酸（poly-L-lysine，PLL）、纖連蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）、膠原蛋白（Collagen）的方式促進(jìn)了Balb 3T3/c，HMEC-1，HT-29 細(xì)胞在PDMS 表面的黏附與增殖能力；Yoshimitsu 等[16]采用纖連蛋白（FN）、層粘連蛋白（Laminin）、膠原蛋白（Collagen）、明膠（gelatin）對(duì)PDMS 表面進(jìn)行包被，證明了纖連蛋白、層粘連蛋白比膠原蛋白、明膠具有更強(qiáng)的促進(jìn)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞201B7 hiPSCs 附著、增殖以及自我更新能力。處于芯片微通道/腔室中的培養(yǎng)體系具有較大的比表面積，單位體積基質(zhì)具有更高的細(xì)胞密度，這使得細(xì)胞微環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗加快、代謝廢物易于積累，因此，必須形成適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種密度、培養(yǎng)基組分及更換頻率以實(shí)現(xiàn)芯片上細(xì)胞微環(huán)境的穩(wěn)定。文獻(xiàn)[6,17]發(fā)現(xiàn)微觀培養(yǎng)狀態(tài)下鼠乳腺成纖維細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗率是宏觀培養(yǎng)狀態(tài)下的3～4 倍，并通過模型分析指出，培養(yǎng)基液體層厚度為200 μm 時(shí)換液頻率應(yīng)當(dāng)為常規(guī)培養(yǎng)條件下的6 倍；然而，文獻(xiàn)[18-19]提出過高的基質(zhì)更換頻率不利于微通道中細(xì)胞的生長(zhǎng)。通過實(shí)驗(yàn)與模型分析，Giulitti 等[20]考察了基質(zhì)的連續(xù)灌注與間隔更換兩種方式對(duì)PDMS 芯片微通道中鼠成肌細(xì)胞（C2C12）、人成纖維細(xì)胞（HFF）生長(zhǎng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，快速、間隔式換液比慢速、連續(xù)灌注更有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。綜上，微流控芯片上細(xì)胞的培養(yǎng)條件需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確定。

肝癌是目前人類主要的致死疾病之一，對(duì)體外肝癌細(xì)胞的研究有利于揭示肝癌疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)理，同時(shí)有助于相關(guān)藥物的開發(fā)篩選。已有報(bào)道進(jìn)行了微流控芯片上肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)與分析[21-22]，但關(guān)于芯片材料、換液頻率等因素對(duì)芯片上肝癌細(xì)胞培養(yǎng)的影響缺乏分析。本文設(shè)計(jì)制作了一種簡(jiǎn)單高通量的PDMS-玻璃微流控芯片，并進(jìn)行了芯片上人肝癌細(xì)胞（HepG2）的培養(yǎng)，主要考察芯片材料的表面包被、細(xì)胞接種密度、培養(yǎng)基血清濃度以及更換頻率4 個(gè)因素對(duì)芯片上細(xì)胞培養(yǎng)的影響，以期為微流控芯片上肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、耗材與設(shè)備

人肝癌細(xì)胞株HepG2（購(gòu)于上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)基；胎牛血清（FBS）；無菌PBS 液；D-Hanks 緩沖液；青鏈霉素（雙抗）；0.25%胰酶（含0.02%乙二胺四乙酸（EDTA））；人層纖連蛋白（Fibronectin，200 μg/ml）；聚賴氨酸（Polylysine，0.5 mg/ml）；膠原蛋白粉（Collagen，來源于魚鱗皮膚）；丫啶橙（AO）染料；Sylgard184 型聚二甲基硅氧烷（美國(guó)Dow Corning 公司）；HQ6100 感光干膜（長(zhǎng)興化工）；紫外曝光燈；FM-360 覆膜機(jī)（杭州新彩辦公設(shè)備有限公司）；Harrick 等離子體清洗機(jī)；熒光顯微鏡（Nikon）；細(xì)胞培養(yǎng)箱。

1.2 微流控芯片的設(shè)計(jì)與制作

微流控芯片由PDMS 與載玻片鍵合而成，上層PDMS 中含有6 條平行直通道（長(zhǎng)×寬×高：10 mm×0.5 mm×0.1 mm），通道兩端分別連接一個(gè)直徑5 mm、深5 mm 的柱狀儲(chǔ)液池用于存儲(chǔ)培養(yǎng)基，結(jié)構(gòu)如圖1 所示。芯片采用感光干膜軟光刻法加工制成，具體參見文獻(xiàn)[23]，主要流程如下：首先在基板上層壓100 μm 厚的感光干膜層，并通過打印機(jī)將圖案在透明膠片上制成光掩膜。紫外線透過光掩膜對(duì)感光干膜照射70 s，之后用1%碳酸鈉顯影制成微通道陽(yáng)模，再將PDMS 基質(zhì)與固化劑以質(zhì)量比為10∶1 混合澆鑄于微通道陽(yáng)模上，真空60 ℃下固化3 h。剝離固化后的PDMS 基片，利用平頭打孔器在微通道兩端打孔形成儲(chǔ)液池，氧等離子體表面處理后與載玻片進(jìn)行不可逆鍵合即制成PDMS-玻璃微流控芯片。

圖1 PDMS-玻璃微流控芯片示意圖Fig.1 Schematic of PDMS-glass microfluidic chip

1.3 HepG2 細(xì)胞的培養(yǎng)

對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)到80%～90%匯合度時(shí)進(jìn)行胰酶處理，收集后置于離心機(jī)中1 000 r/min 離心4 min，去除上清液，加入1 ml 包含體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS 的DMEM 高糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入T25 培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加5 ml 包含體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS 的DMEM 高糖培養(yǎng)基后晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使細(xì)胞均勻分布于瓶底，后轉(zhuǎn)入37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，用于后續(xù)傳代培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)。

1.4 微流控芯片上HepG2 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響因素分析

1.4.1 包被物對(duì)芯片上HepG2 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

選用纖連蛋白（FN）、聚賴氨酸（PLL）、膠原蛋白（Collagen）進(jìn)行微通道底部的玻璃表面修飾，考察不同包被物促細(xì)胞生長(zhǎng)的效果。分別配制纖連蛋白（10 μg/ml）、聚賴氨酸（0.1 mg/ml）、膠原蛋白（0.1 mg/ml）包被液。取經(jīng)過滅菌烘干的芯片置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，先用無菌水沖洗一遍通道，再用移液槍吸取10 μl 包被液從通道一端注入微通道內(nèi)對(duì)通道底部的玻璃表面進(jìn)行包被，將含有包被液的芯片于超凈臺(tái)內(nèi)孵育1 h 并吸出剩余包被液，后自然干燥1 h 備用。HepG2 細(xì)胞通過常規(guī)胰酶消化處理，收集離心后用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度到1.0×106個(gè)/ml。用移液槍取5 μl 細(xì)胞懸液注入芯片通道內(nèi)，再將加載細(xì)胞的芯片置于培養(yǎng)皿內(nèi)，在皿內(nèi)加入適量無菌水，最后將培養(yǎng)皿放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞于微通道內(nèi)貼壁后，在通道一側(cè)的儲(chǔ)液池內(nèi)加滿培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)，每12 h 進(jìn)行換液，并于24，48 h 時(shí)對(duì)細(xì)胞形態(tài)與活性進(jìn)行記錄與分析。

1.4.2 細(xì)胞接種密度對(duì)芯片上HepG2 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

在確定微通道表面包被物的基礎(chǔ)上，考察不同的細(xì)胞接種密度對(duì)芯片上HepG2 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。采用優(yōu)化后的包被物進(jìn)行通道表面包被。HepG2 細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后進(jìn)行常規(guī)胰酶消化處理，離心收集后用包含10%FBS 的DMEM 高糖培養(yǎng)基重懸并制備0.5×106，1.0×106，2.0×106個(gè)/ml這3 種細(xì)胞密度懸液。將3 種細(xì)胞懸液導(dǎo)入微通道進(jìn)行芯片上細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)到24，48 h時(shí)對(duì)細(xì)胞形態(tài)與活性進(jìn)行記錄與分析。

1.4.3 培養(yǎng)基血清濃度對(duì)芯片上HepG2 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

考察基質(zhì)中血清濃度對(duì)芯片上細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。以DMEM 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)液，分別配制含F(xiàn)BS體積分?jǐn)?shù)為5%，10%，20%的完全細(xì)胞培養(yǎng)液。取滅菌后的芯片，芯片的包被以及細(xì)胞接種分別在上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行，待細(xì)胞在微通道內(nèi)附著后分組加入上述3 種血清濃度的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每12 h 換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)到24，48 h時(shí)對(duì)細(xì)胞形態(tài)與活性進(jìn)行記錄與分析。

1.4.4 培養(yǎng)基更換時(shí)間對(duì)芯片上HepG2 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

進(jìn)一步考察培養(yǎng)基更換的時(shí)間間隔對(duì)芯片上細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。在上述優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上進(jìn)行芯片上HepG2 細(xì)胞的培養(yǎng)，分別設(shè)置8，16，24 h這3 種培養(yǎng)基更換時(shí)間間隔并進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)，待培養(yǎng)48 h 后對(duì)細(xì)胞形態(tài)與活性進(jìn)行記錄與分析。

1.5 微流控芯片上與傳統(tǒng)6 孔板中HepG2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線對(duì)比

在上述4 種培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上進(jìn)行微流控芯片上HepG2 細(xì)胞的培養(yǎng)，并與傳統(tǒng)的6 孔板上細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行對(duì)比，考察兩種培養(yǎng)方式下細(xì)胞生長(zhǎng)結(jié)果的異同。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化處理，離心收集后重懸。為了增加兩種方案的可比性，通過調(diào)整接種細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度來控制兩種培養(yǎng)方式的起始細(xì)胞面密度相近，約為100 個(gè)/mm2。芯片上細(xì)胞培養(yǎng)在上述優(yōu)化后的條件下進(jìn)行，孔板中的細(xì)胞采用傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)方式進(jìn)行培養(yǎng)。分別于第2 h，1，2，3，4 d 對(duì)細(xì)胞形態(tài)與活性進(jìn)行記錄與分析。

1.6 細(xì)胞形態(tài)及活性分析

細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)采用倒置顯微鏡明場(chǎng)拍照，觀察芯片以及孔板中的細(xì)胞形態(tài)、匯合度等。細(xì)胞活性采用丫啶橙熒光染色法確定，熒光染料丫啶橙具有細(xì)胞膜透過性，能透過細(xì)胞膜并與細(xì)胞核DNA 結(jié)合，在激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm 下正常細(xì)胞發(fā)綠色均勻熒光，而凋亡細(xì)胞中細(xì)胞核染色質(zhì)發(fā)生固縮或斷裂，與染料結(jié)合后發(fā)強(qiáng)熒光。根據(jù)產(chǎn)品說明配置0.2 μg/ml 的丫啶橙染液，待芯片上與孔板中的細(xì)胞生長(zhǎng)到特定時(shí)間點(diǎn)后將培養(yǎng)基更換為丫啶橙染液，避光作用3 min 后于熒光顯微鏡下拍照記錄。使用Image pro plus 軟件粒子計(jì)數(shù)與分析模塊對(duì)丫啶橙熒光染色圖片進(jìn)行細(xì)胞數(shù)目的統(tǒng)計(jì)分析。細(xì)胞增殖率（24 h）定義為（N2-N1）/N1，其中，N1為第一天細(xì)胞數(shù)，N2為第二天細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 通道表面不同包被物處理對(duì)HepG2 細(xì)胞附著生長(zhǎng)的影響

對(duì)附著細(xì)胞而言，附著基質(zhì)材料及其表面特性對(duì)細(xì)胞的黏附、增殖、分化等具有顯著影響[7]。傳統(tǒng)的聚苯乙烯（PS）細(xì)胞培養(yǎng)瓶/皿表面經(jīng)過包被或等離子體處理等提高其親水性，從而有利于細(xì)胞的黏附生長(zhǎng)。采用纖連蛋白（FN）、聚賴氨酸（PLL）、膠原蛋白（Collagen）對(duì)芯片微通道進(jìn)行表面包被，考察不同包被物的促細(xì)胞黏附生長(zhǎng)能力。圖2 為不同包被物條件下HepG2 細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的明場(chǎng)形態(tài)圖，圖3 為通過細(xì)胞熒光染色分析獲得的細(xì)胞增值曲線以及增殖率圖。G，G/F，G/P，G/C 分別表示通道底部玻璃表面未包被、纖連蛋白（FN）、聚賴氨酸（PLL）、膠原蛋白（Collagen）包被處理。

圖2 不同包被物作用下微通道中HepG2 細(xì)胞12，24，48 h 明場(chǎng)形態(tài)圖Fig.2 Bright field morphology of HepG2 cells in microchannels at 12, 24, and 48 h under the action of different coatings

圖3 不同包被物處理下HepG2 細(xì)胞的增殖曲線以及增殖率圖Fig.3 Proliferation curve and proliferation rate of HepG2 cells under different coating treatments

從圖2 中可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組細(xì)胞在微通道中均逐漸鋪展開來，纖連蛋白包被組較聚賴氨酸、膠原蛋白包被以及未包被組具有更充分的細(xì)胞鋪展形態(tài)以及更高的匯合度。圖3 顯示了不同包被物質(zhì)作用下HepG2 細(xì)胞的增值曲線以及增殖率。第一天，纖連蛋白包被下的HepG2 細(xì)胞具有最高的增殖率，高于聚賴氨酸、膠原蛋白組；膠原蛋白與未包被組相似，在第一天時(shí)細(xì)胞數(shù)有所降低，可能是由于一些未貼壁細(xì)胞凋亡壞死后在通道內(nèi)隨著換液而流失。第二天，各組細(xì)胞數(shù)均呈現(xiàn)增加，但是，纖連蛋白、聚賴氨酸兩組細(xì)胞的增殖率較膠原蛋白與未包被組低，這是由于前兩組在第一天細(xì)胞已增加到一定密度，第二天細(xì)胞增殖會(huì)較早地達(dá)到接觸抑制的狀態(tài)，進(jìn)而降低了增殖率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，纖連蛋白具有比聚賴氨酸以及膠原蛋白更好的促細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)能力，這與Jastrzebska 等[15]和Yoshimitsu等[16]對(duì)PDMS 表面包被以促進(jìn)芯片上細(xì)胞生長(zhǎng)的研究結(jié)果一致。

2.2 細(xì)胞接種密度對(duì)HepG2 細(xì)胞芯片上生長(zhǎng)的影響

長(zhǎng)期的體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)踐表明，細(xì)胞起始接種密度會(huì)對(duì)細(xì)胞群體的黏附增殖產(chǎn)生明顯的影響，較高的細(xì)胞接種密度有利于細(xì)胞群體的黏附增殖，而較低的細(xì)胞起始密度下細(xì)胞生長(zhǎng)相對(duì)緩慢。為考察不同細(xì)胞接種密度對(duì)微流控芯片上細(xì)胞培養(yǎng)的影響，實(shí)驗(yàn)設(shè)置了0.5×106，1.0×106，2.0×106個(gè)/ml 這3 種細(xì)胞加載密度，并獲得了各細(xì)胞加載密度下芯片上細(xì)胞的增值曲線以及增殖率，如圖4 所示。

圖4 不同細(xì)胞接種密度條件下HepG2 細(xì)胞的增值曲線與增殖率圖Fig.4 Proliferation curve and proliferation rate of HepG2 cells under different cell seeding density

從圖4 中可以看出，第一天1.0×106個(gè)/ml 組細(xì)胞具有最高增殖率，這是由于0.5×106個(gè)/ml 組細(xì)胞密度過低，細(xì)胞間相互促進(jìn)生長(zhǎng)的作用不夠強(qiáng)，而2.0×106個(gè)/ml 組細(xì)胞可能由于過高的細(xì)胞密度導(dǎo)致微環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，限制了細(xì)胞的進(jìn)一步生長(zhǎng)；第二天各組細(xì)胞增殖率均發(fā)生了變化，0.5×106個(gè)/ml 組細(xì)胞增殖率相對(duì)第一天升高，并明顯高于其他兩組，而1.0×106個(gè)/ml 與2.0×106個(gè)/ml 組細(xì)胞增殖率均出現(xiàn)降低，這是由于0.5×106個(gè)/ml 組細(xì)胞經(jīng)過一天的培養(yǎng)已在通道中穩(wěn)定下來并且細(xì)胞數(shù)有所增加，這為第二天的快速生長(zhǎng)奠定了基礎(chǔ)，而1.0×106個(gè)/ml 與2.0×106個(gè)/ml組細(xì)胞經(jīng)過第一天的培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)已有較大提升，在第二天的生長(zhǎng)過程中，由于空間受限、接觸抑制等因素出現(xiàn)生長(zhǎng)速率放緩，并且這一趨勢(shì)隨著細(xì)胞密度的增加而更加明顯。上述結(jié)果與Yu 等[24]對(duì)不同起始密度條件下微通道中粘蟲卵巢細(xì)胞（Sf9）生長(zhǎng)行為的觀察具有相似性。

2.3 血清濃度對(duì)芯片上HepG2 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

體外動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中一般在培養(yǎng)基質(zhì)中添加體積分?jǐn)?shù)為10%～20%的血清（常見的有牛血清、馬血清等）以促進(jìn)細(xì)胞的黏附與增殖。培養(yǎng)基的組分比較復(fù)雜，并且其品質(zhì)隨著產(chǎn)地及工藝而不同，但關(guān)鍵成分都包括血清、氨基酸、維生素等幾類物質(zhì)。為了考察培養(yǎng)基質(zhì)中不同體積分?jǐn)?shù)血清（胎牛血清FBS）對(duì)芯片上HepG2 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，以DMEM 高糖培養(yǎng)基為基礎(chǔ)液分別配制含F(xiàn)BS 體積分?jǐn)?shù)為5%，10%，20%的完全培養(yǎng)基進(jìn)行芯片上HepG2 細(xì)胞的培養(yǎng)，細(xì)胞在微流控芯片上的增值曲線以及增殖率如圖5 所示。

圖5 不同基質(zhì)血清濃度條件下HepG2 細(xì)胞增殖曲線與增殖率圖Fig.5 Proliferation curve and proliferation rate of HepG2 cells under different matrix serum concentration

從圖5 中看到，隨著血清體積分?jǐn)?shù)的增加，單位面積上的活細(xì)胞數(shù)逐漸增加。第一天，隨著血清濃度的提高，細(xì)胞增殖率增加，第二天則呈相反趨勢(shì)，但只有FBS 體積分?jǐn)?shù)為20%的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞第二天細(xì)胞增殖率低于第一天，這是由于經(jīng)過一天的生長(zhǎng)，F(xiàn)BS 體積分?jǐn)?shù)為20%的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞已具有較高的細(xì)胞密度，在第二天的培養(yǎng)過程中較早產(chǎn)生了競(jìng)爭(zhēng)以及接觸抑制效應(yīng)，抵消了較高血清濃度帶來的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，進(jìn)而使細(xì)胞增殖率降低。這表明提高基質(zhì)血清體積分?jǐn)?shù)有利于微通道中細(xì)胞的生長(zhǎng)，這與Su 等[18]對(duì)微通道中人胚腎細(xì)胞的研究結(jié)果一致。

2.4 不同換液頻率對(duì)HepG2 細(xì)胞芯片上生長(zhǎng)的影響

傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)模式中培養(yǎng)皿/瓶?jī)?nèi)預(yù)留足量的培養(yǎng)基提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，一般經(jīng)過2～4 d 進(jìn)行培養(yǎng)基更換。微通道中的培養(yǎng)體系具有較大的比表面積，單位體積培養(yǎng)基質(zhì)內(nèi)細(xì)胞密度相對(duì)較高，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗較快，代謝廢物易于積累，因此，必須明確芯片上培養(yǎng)基更換時(shí)間間隔以維持細(xì)胞微環(huán)境的穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)采用微通道內(nèi)靜態(tài)培養(yǎng)的方式，培養(yǎng)基間歇式更換，設(shè)置了8，16，24 h 這3 個(gè)換液時(shí)間間隔，細(xì)胞在微流控芯片上的增值曲線以及增殖率如圖6 所示。

在不同的換液頻率條件下，細(xì)胞經(jīng)過24 h 培養(yǎng)后附著鋪展于通道內(nèi)，但仍未鋪滿整個(gè)通道，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h 各組細(xì)胞均覆蓋整個(gè)通道底面，并且可以看出，隨著換液頻率的增高，細(xì)胞密度略微升高。從圖6 中可以看出，經(jīng)過48 h 培養(yǎng)后，每8 h換液組的細(xì)胞數(shù)顯著高于每16，24 h 換液組的細(xì)胞數(shù)，而后兩組無顯著差異，這是因?yàn)檩^高的換液頻率能夠?yàn)橥ǖ纼?nèi)的細(xì)胞及時(shí)提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并及時(shí)清除微環(huán)境中積累的代謝廢物，進(jìn)而有利于細(xì)胞增殖，但換液時(shí)間間隔超過一定限度后，由于代謝廢物積累產(chǎn)生的不利因素平衡了基質(zhì)更換帶來的促進(jìn)因素，故后兩組無顯著差異。這一結(jié)果驗(yàn)證了Young 等[6]通過模型分析芯片上換液時(shí)間所得出的結(jié)論。

圖6 不同換液時(shí)間間隔條件下的細(xì)胞數(shù)與增殖率圖Fig.6 Number of cells and proliferation rate under different medium exchange interval

2.5 微流控芯片與傳統(tǒng)孔板上HepG2 細(xì)胞生長(zhǎng)的比較

在上述實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進(jìn)行芯片上HepG2 細(xì)胞的培養(yǎng)，并與傳統(tǒng)的6 孔板細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行比較。芯片采用纖連蛋白包被、基質(zhì)血清的體積分?jǐn)?shù)為20%、換液時(shí)間為8 h；孔板細(xì)胞培養(yǎng)在常規(guī)條件下進(jìn)行。兩組細(xì)胞分別在第2 h，1，2，3，4 d 時(shí)進(jìn)行明場(chǎng)/熒光拍照記錄，細(xì)胞明場(chǎng)形態(tài)如圖7 所示。

圖7 6 孔板/微流控芯片上HepG2 細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)（2 h，1，2，3，4 d）的明場(chǎng)形態(tài)圖Fig.7 Brightfield morphology of HepG2 cells on 6-well plates and microfluidic chip at different time point（2 h, 1, 2, 3, 4 d）

根據(jù)細(xì)胞熒光染色獲得孔板/芯片細(xì)胞增值曲線與增殖率如圖8 所示，芯片上細(xì)胞增值曲線位于孔板細(xì)胞增值曲線之下，表明在培養(yǎng)起始階段芯片上細(xì)胞的生長(zhǎng)速率較孔板為低，但兩曲線在第4 天時(shí)近乎相交，即兩種培養(yǎng)方式最終產(chǎn)生相近的細(xì)胞密度，這一現(xiàn)象與細(xì)胞明場(chǎng)形態(tài)相吻合。第一天芯片上細(xì)胞密度下降是由于較小細(xì)胞密度下部分細(xì)胞凋亡壞死并在基質(zhì)更換時(shí)被流體帶走所致。從兩種培養(yǎng)方式下每天的細(xì)胞增殖率可以看出，孔板中的細(xì)胞增殖率先增大后降低，這與經(jīng)典的細(xì)胞增殖曲線相吻合；芯片上的細(xì)胞增殖率則不斷增加，這是由于實(shí)驗(yàn)觀測(cè)時(shí)間較短，細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期還未完全結(jié)束所致，預(yù)計(jì)后期增殖率會(huì)回落。Yu 等[24]將芯片上與傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的Sf9 細(xì)胞生長(zhǎng)行為進(jìn)行了對(duì)比，觀察到了與本文相似的結(jié)果。

圖8 6 孔板和微流控芯片上細(xì)胞的增殖曲線與增殖率圖Fig.8 Proliferation curve and proliferation rate of cells on 6-well plates and microfluidic chip

3 結(jié) 論

微流控芯片上細(xì)胞的培養(yǎng)是芯片上細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的前提之一。本文設(shè)計(jì)制作了一種簡(jiǎn)單高通量的PDMS-玻璃微流控芯片，并進(jìn)行了芯片上人肝癌細(xì)胞HepG2 培養(yǎng)條件的研究，主要考察了芯片材料的表面包被、細(xì)胞接種密度、培養(yǎng)基血清濃度與更換頻率這4 個(gè)因素對(duì)芯片上HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用纖連蛋白（FN）進(jìn)行通道表面包被，調(diào)整細(xì)胞接種密度在1.0×106～2.0×106個(gè)/ml 之間，提高培養(yǎng)基中血清體積分?jǐn)?shù)到20%，并控制培養(yǎng)基更換時(shí)間在8～16 h 之內(nèi)，能夠形成優(yōu)化的芯片上HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)方案，且該方案與傳統(tǒng)孔板中的HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)具有相同的增殖趨勢(shì)、增殖率。與其他芯片上肝癌細(xì)胞培養(yǎng)與分析的報(bào)道相比，本研究采用的芯片結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，能進(jìn)行多通道平行實(shí)驗(yàn)，并且能夠更全面地對(duì)影響芯片上細(xì)胞培養(yǎng)的因素進(jìn)行分析，為芯片上肝癌細(xì)胞以及其他類型細(xì)胞的培養(yǎng)提供了參考，對(duì)芯片上肝癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的開展具有潛在促進(jìn)作用。