高仕平, 李 鋒, 查思凡

(昆明科靈生物科技有限公司, 昆明 650550)

隨著人們飲食習(xí)慣的改變, 日常生活中高脂食物攝入量增加，非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的發(fā)病率逐年上升且呈現(xiàn)低齡化，嚴(yán)重者可導(dǎo)致不同程度的纖維化并逐步演變成肝硬化甚至肝癌[1]。目前，用于NAFLD 的非人靈長類動物模型較少，建立與人類NAFLD疾病相似的動物模型對于NAFLD的發(fā)病機制研究、藥物治療和預(yù)防控制尤為重要[2-4]。食蟹猴在組織結(jié)構(gòu)、免疫、生理代謝等方面與人類高度近似，是醫(yī)學(xué)研究中理想的實驗動物。本試驗?zāi)M人類不良的飲食習(xí)慣，利用高脂飼料持續(xù)飼養(yǎng)正常食蟹猴，導(dǎo)致食蟹猴脂代謝紊亂，加快肝臟脂肪化、纖維化進(jìn)程，從而誘導(dǎo)NAFLD，分析了高脂飼料飼喂不同時間與丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(A L T)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、肝臟脂肪化及纖維化的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼料

700 只普通級健康成年雄性食蟹猴，體質(zhì)量7～9 kg，7～13 歲，由昆明亞靈生物有限公司提供[SCXK(滇)K2015-0003]。實驗在昆明科靈生物科技有限公司動物實驗設(shè)施中進(jìn)行[SYXK(滇)K2012-0002]。動物飼養(yǎng)于不銹鋼單籠內(nèi)，室溫保持在18～29 ℃，相對濕度保持30%～70%。動物自由進(jìn)食，自由飲水，光照每日12 h 晝夜循環(huán)。實驗操作符合昆明科靈生物科技有限公司實驗動物倫理委員會的規(guī)范要求。

高脂飼料由廣州市國龍科技有限公司提供[SCXK(粵)2014-0026], 配方: 15%豬油、30%糖、0.5%膽固醇、5%無營養(yǎng)物質(zhì)和49.5%基礎(chǔ)飼料。

1.2 主要試劑儀器

ALT、AST、TG、TC、HDL 和LDL 試劑盒由羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司提供。氟尼辛葡甲胺注射液(外獸藥證字14 號)購自法國靈葆雅動物保健品公司，獸用鹽酸氯胺酮注射液[獸字藥(2015)]購自江蘇中牧倍康藥業(yè)有限公司。

羅氏全自動生化分析儀(c501)，彩色B 超儀(邁瑞M9CV)，半自動活檢針(TSK 株式會社，18G)，手動石蠟切片機(RM2235)，光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS-BX-51)。

1.3 實驗方法

高脂飲食之前對700 只飼喂正常飼料的食蟹猴在空腹12～14 h 后，用鹽酸氯胺酮全身麻醉，抽取前肢靜脈血液3 mL，肝穿刺進(jìn)行組織活檢，確認(rèn)動物血液生化指標(biāo)處于正常范圍，肝臟處于健康狀態(tài)。然后，700 只食蟹猴均飼喂高脂飼料，在飼喂后1 年、2 年、3 年、4 年、5 年、6 年和7 年時，分別抽取34 只、160 只、284 只、81 只、62 只、30 只和49只食蟹猴用于相關(guān)檢測。

各時間點食蟹猴空腹12～14 h，用鹽酸氯胺酮全身麻醉后，抽取前肢靜脈采血3 mL，檢測血清中ALT、AST、TG、TC、HDL、LDL 指標(biāo)；在彩色B 超儀的協(xié)助下利用半自動活檢針對食蟹猴進(jìn)行肝組織活檢，取肝臟右葉于體積分?jǐn)?shù)10%的中性甲醛溶液中固定，脫水、石蠟包埋切片后進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色和天狼星紅染色。光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織病理學(xué)變化，判斷食蟹猴肝臟是否出現(xiàn)脂肪化和纖維化。每次肝組織活檢后, 以2 mg/kg 氟尼辛葡甲胺注射液連續(xù)3 d 肌肉內(nèi)注射止疼。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)用x- ± s 表示，用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件分析, P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義; 高脂飼料飼喂時間與ALT、AST、TG、TC、HDL、LDL、肝臟脂肪化及纖維化的相關(guān)性采用簡單相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 高脂飼料飼喂時間與肝臟脂肪化、纖維化發(fā)病率

高脂飲食可誘發(fā)食蟹猴肝臟發(fā)生脂肪變性和纖維化變性，且隨著時間延長，發(fā)病率總體呈現(xiàn)上升趨勢，表明高脂飲食可以推進(jìn)食蟹猴肝臟脂肪化和纖維化進(jìn)程(表1)。

2.2 食蟹猴血液生化指標(biāo)

高脂飲食誘導(dǎo)后食蟹猴各項生化指標(biāo)與誘導(dǎo)前自身對照，ALT、TG、TC、LDL 在飼喂高脂飼料1 年大部分指標(biāo)顯著上升，隨后均維持在較高水平；HDL 先上升后下降，在飼喂7 年時低于實驗前(表2)。

2.3 食蟹猴肝組織病理學(xué)觀察

圖1a和圖1b為高脂飲食誘導(dǎo)前食蟹猴正常肝臟組織HE染色后鏡下20倍和40 倍的圖片，肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝竇清晰，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，肝細(xì)胞無脂肪變性。之后圖片為飼喂高脂飼料后食蟹猴肝臟組織不同程度病理變化。圖1c為輕度脂肪肝，少量肝細(xì)胞脂肪變性，少量肝細(xì)胞腫大變圓呈氣球樣變，形態(tài)不規(guī)則，并且伴有炎性細(xì)胞浸潤(HE); 圖1d 為中度脂肪肝，大量肝細(xì)胞脂肪變性，肝細(xì)胞腫大氣球樣變更加明顯，并伴隨明顯炎性細(xì)胞浸潤，肝竇不明顯，已可見部分纖維化(HE); 圖1e 為重度脂肪肝，幾乎所有肝細(xì)胞都呈脂肪變性，胞質(zhì)被大泡型和小泡型脂泡占據(jù)，細(xì)胞核大量消失，肝竇消失，肝索解(HE);圖1f為重度脂肪肝，幾乎所有肝細(xì)胞都呈脂肪變性，胞質(zhì)被大泡型和小泡型脂泡占據(jù)，細(xì)胞核大量消失，肝竇消失，肝索解離，炎性細(xì)胞浸潤更加明顯，纖維化明顯(HE); 圖1g 為血管周圍肝臟細(xì)胞脂肪變性，且伴有少量纖維，呈淡紅色(天狼星紅染色); 圖1h 為變性的肝臟脂肪細(xì)胞(除血管外)，可見淡紅色增粗纖維(天狼星紅染色);圖1i 為中度纖維化，可見靜脈壁周圍和竇周周圍纖維增粗，且伴有小泡型脂肪變性(天狼星紅染色); 圖1j 可見靜脈周圍和竇周纖維明顯增粗增多，延伸至肝臟組織其他部位，形成纖維橋，纖維化發(fā)生部位常見于靜脈及匯管區(qū)周圍，且伴有大泡型和小泡型脂肪變性(天狼星紅染色); 圖1k可見匯管區(qū)周圍細(xì)胞胞質(zhì)被大泡型和小泡型脂泡占據(jù)，纖維從匯管區(qū)延伸至其他氣球樣變細(xì)胞，纖維增粗，連接成纖維橋(天狼星紅染色); 圖1l 為重度纖維化，可見纖維從匯管區(qū)彌漫至整條肝臟組織，周圍肝臟細(xì)胞被大泡型脂泡占據(jù)，炎性細(xì)胞浸潤顯著, 細(xì)胞核變少(天狼星紅染色)。

表1 食蟹猴高脂飼喂時間與肝臟脂肪化、纖維化發(fā)病率Table 1 High-fat diet feeding time and liver fatty, fibrotic morbidity in cynomolgus monkeys

表2 飼喂高脂飼料食蟹猴生化指標(biāo)Table 2 The biochemistry indicators of cynomolgus monkey with high-fat diet

圖1 高脂飼料飼喂食蟹猴肝組織病理學(xué)觀察

2.4 高脂飼料飼喂時間與生化指標(biāo)和肝脂肪化、纖維化相關(guān)性

高脂飼料飼喂時間與AL T、AS T、TG、TC、脂肪化、纖維化在0.01 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)(r 值分別為0.127、0.121、0.246、0.128、0.306、0.220)，與HDL 呈負(fù)相關(guān)(r=-0.298，P<0.05)，與LDL 在0.05 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)(r=0.081)。

3 討論

由于人體各組織器官的復(fù)雜性和實驗動物的種族差異性，且受動物年齡、性別、當(dāng)?shù)貧夂颉暳线x擇、造模時間限制，以及模型判定指標(biāo)仍然缺乏相對標(biāo)準(zhǔn)，使任何一種實驗動物模型都不能全面、準(zhǔn)確地反映脂肪肝的本質(zhì)，因此，建立一個完全能夠反映人類脂肪肝的動物模型比較困難[5]。供選擇的實驗動物模型的種類很多，但各種造模方法各有其不足，所以應(yīng)該依據(jù)不同的實驗來選擇相應(yīng)的實驗動物。楊威等[6]給大鼠喂食單純高脂飼料, 6 周后大鼠表現(xiàn)為典型的NAFLD，呈現(xiàn)顯著的肝臟脂肪浸潤，但是肝臟纖維化及炎癥改變較輕。王昀等[7]使用乙硫氨酸灌胃法，劉峰等[8]使用四氯化碳腹腔注射法，均可以導(dǎo)致小鼠脂質(zhì)代謝出現(xiàn)障礙，肝細(xì)胞形成明顯脂滴，但他們建立的小鼠模型與人類的脂肪肝和纖維化發(fā)病機制和病程變化存在較大差異， 并且藥物毒性強，動物死亡率高。高脂誘導(dǎo)NAFLD的研究水平和層次在不斷提高和深入，但其發(fā)病機制目前尚不明確。高脂飲食顯著增加脂質(zhì)異常，是高脂血癥的主要誘因[9]。Wong 等[10]研究證實，在非肥胖人群中，老齡與 NAFLD 顯著肝纖維化的發(fā)生率增加呈正相關(guān)。而本研究選用中年食蟹猴進(jìn)行實驗，排除了老齡對實驗結(jié)果的影響。本試驗中高脂飼料導(dǎo)致食蟹猴血清T G、TC、LDL-C 含量升高，導(dǎo)致肝臟大量脂質(zhì)堆積，進(jìn)而發(fā)生脂肪肝；而且隨著長期大量脂肪的攝入，肝組織損傷逐漸加重，ALT、AST 活性升高。綜合多年以來的研究，NAFLD 是一種多因素作用下產(chǎn)生的疾病，進(jìn)一步深入研究其發(fā)病機制和自然病程，將有助于篩選高?；颊?。

血脂含量受生活地區(qū)、膳食、年齡、性別、職業(yè)以及代謝等因素的影響，波動范圍較大。血脂異常往往伴隨著冠心病、心肌梗死、腦梗死、動脈粥樣硬化的發(fā)生，導(dǎo)致食蟹猴死亡率上升。血清中TC、HDL、LDL、TG 的含量可在一定程度上反映機體脂肪代謝狀況，是監(jiān)測血脂變化的重要指標(biāo)；ALT 主要分布在肝細(xì)胞質(zhì)，AST 主要分布在肝細(xì)胞質(zhì)和肝細(xì)胞線粒體中，對食蟹猴肝功能的監(jiān)測具有重要意義。

綜上所述，應(yīng)加大對血脂水平異常偏高人群的健康教育力度，鼓勵人們及時監(jiān)測自己的身體狀況，積極發(fā)現(xiàn)和治療疾病，并且注意調(diào)整飲食結(jié)構(gòu)，避免高脂飲食，防止和糾正過度肥胖，倡導(dǎo)健康的生活方式。