楊靜麗，葛 闖，易 琳，張海偉，林昌海，唐萬燕，陳 霞，輦偉奇

(1.重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院新生兒診治中心/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室/國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學研究中心/兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地/兒童感染免疫重慶市重點實驗室，重慶 400014；2.重慶大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤轉移與個體化診治轉化研究重慶市重點實驗室，重慶 400030)

肺癌的發(fā)病率和病死率均居我國惡性腫瘤的首位。非小細胞肺癌(NSCLC)占肺癌的80%～85%[1]。人們對NSCLC的分型認知已經邁入分子水平，越來越多的腫瘤靶向基因從基礎研究走向臨床應用，如吉非替尼、?？颂婺?、奧希替尼等酪氨酸激酶抑制劑(TKI)的靶點基因表皮生長因子受體(EGFR)[2]，克唑替尼、色瑞替尼、勞拉替尼等的靶點基因間變性淋巴瘤激酶(ALK)，達拉非尼聯(lián)合曲美替尼的靶點基因BRAF、MEK等。

高通量測序是一種大規(guī)模平行測序技術，可用作基因點突變、插入缺失突變、基因重排和基因拷貝數突變等多種突變類型的分析。臨床上，高通量測序可以針對藥物的特定靶向基因進行深度測序，從而為腫瘤患者提供更多的治療選項[3]。本研究對396例NSCLC患者的外周血循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)進行高通量測序，以分析不同類型基因突變與臨床病理資料的關系，旨在為疾病的精準化診療提供基因水平的參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集重慶大學附屬腫瘤醫(yī)院2017年1月至2018年10月396例NSCLC患者的標本。標本類型為外周血。男性患者255例，女性患者141例，年齡30～86歲。所有病例均經組織病理學檢查確診，其中腺癌患者293例，鱗狀細胞癌患者103例。本研究獲得該院醫(yī)學倫理學委員會批準，臨床資料及標本采集均獲患者知情同意。

1.2儀器與試劑 無水乙醇(分析純)、血漿游離DNA提取試劑盒購自中國天根公司；高速冷凍離心機購自韓國Genespeed公司；混勻儀、渦旋振蕩器購自中國其林貝爾公司；恒溫金屬浴購自德國Eppendorf公司；Qubit熒光計、磁力架購自美國Thermo Fisher Scientific公司；生物安全柜購自中國海爾公司；超微量分光光度計購自美國NanoDrop公司；7500熒光定量PCR儀、數字PCR儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司；Bioruptor?Pico超聲波破碎儀購自比利時Diagenode公司；真空濃縮儀購自中國北京吉艾姆公司；生物分析儀購自中國Bioptic公司；NextSeq 550基因測序儀購自美國Illumina公司。

1.3方法

1.3.1核酸提取 吸取500 μL Proteinase K于50 mL離心管底，加入5 mL制備血漿(10 mL全血，2 000 r/min離心10 min，取上清；8 000 r/min離心10 min，收集上清血漿)，加入Buffer 1 Mix，混勻30 s，瞬離；60 ℃水浴，30 min；加入Buffer 2，混勻15～30 s，冰浴5 min。將冰浴后溶液加入真空泵抽提吸附柱中進行抽吸；然后加入600 μL Buffer 3，真空抽吸；加入750 μL Buffer 4，真空抽吸；加入750 μL無水乙醇，真空抽吸；將吸附柱放入干凈套管，14 000 r/min離心3 min，丟棄套管。將吸附柱裝入潔凈的1.5 mL收集管中，開蓋，室溫靜置10 min；56 ℃烘干，1 min；懸空滴加80 μL NF-Water，室溫靜置5 min；14 000 r/min離心1 min，保留約75 μL DNA溶液；再次滴加50 μL NF-Water，室溫靜置5 min；14 000 r/min離心1 min，保留約120 μL DNA溶液。取3 μL DNA原液以Qubit 熒光計評估核酸質量及水平。剩余DNA原液如不立即使用可凍存于-80 ℃冰箱。

1.3.2文庫構建及測序 將400 ng的DNA原液轉移至DNA剪切專用Covaris管中進行剪切后，轉移至新的1.5 mL離心管中并純化；進行DNA末端修復，加“A”操作；連接接頭序列并用AMPure XP磁珠純化連接后的DNA標本；在0.2 mL低吸附PCR管中配制PCR擴增體系，混勻、PCR擴增，用AMPure XP磁珠純化擴增后的DNA文庫；Qubit熒光計測定文庫DNA水平，吸取600 ng文庫DNA至新的0.2 mL 的PCR管?！?5 ℃環(huán)境下，將文庫濃縮至5 μL，加入配制好的Block Mix溶液、P5 Blocker、P7 Blocker各1 μL，PCR擴增；捕獲和洗脫雜交的文庫DNA；PCR擴增上一步得到的文庫DNA，并用AMPure XP磁珠進行純化；Qubit熒光計測定文庫DNA水平，文庫DNA水平應≥1 ng/μL。根據文庫DNA水平進行稀釋，稀釋液的終水平為1.5 ng/μL；qPCR精確定量文庫DNA有效水平。使用NextSeq 550基因測序儀進行高通量測序。

1.3.3生物信息學分析 使用測序數據質控軟件pk_qc_new2去除下機數據中質量較低的數據；使用序列比對軟件BWA(版本V0.7.12)將原始數據與人類參考基因組(GRCh37)進行比對；使用Samblaster_V0.1.22標記測序數據中的重復reads并進行去重；使用samtools_V0.1.19將比對文件SAM格式轉換為BAM格式，并用Sambamba_V0.5.8對BAM文件進行排序，用GenomeAnalysisTK_V3.8局部重比對及堿基質量重校正，過濾掉突變頻率0.5%以上的位點。分別使用 VarScan2.3、Mysv_V2.6.pl、ExomeCNV_V2進行SNV/Indel、SV及CNV的分析。根據dbSNP數據庫(Avsnp150)、千人基因組(1000g2015aug_all)、外顯子聚合數據庫(Exac03_EAS)、癌癥體細胞突變數據庫(Cosmic83)、Clinvar_20170905和SAOdbSNP150對基因突變位點進行注釋。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0 進行統(tǒng)計學分析。計數資料以例數和率表示，組間比較采用χ2檢驗。所有比較均為雙側檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1Panel設計及數據質量評估 本Panel設計檢測EGFR、KRAS、HRAS、NRAS、PIK3CA、ALK、ROS1、BRAF、HER2、RET、TP53、MET、MAP2K1、FGFR1、FGFR2、AKT1、PTEN、SMO、KIT、PDGFRA、DDR2、RB1、TSC1、MEK1、BRCA、TET2、DNMT3A、GNA11共28種腫瘤驅動基因的點突變、短片段缺失突變和短片段插入突變等基因突變類型，其中ALK、ROS1、RET 3個基因額外檢測基因重排；EGFR、FGFR1、FGFR2、MET、KIT 5個基因額外檢測基因拷貝數突變。

每例標本產生的數據量約為3 G，測序區(qū)域覆蓋度為100%，比對率>99%；高通量測序區(qū)域去重后平均測序深度大于2 000 X，最低測序深度1 200 X。100%測序標本的測序質量值為Q20≥90%，Q30≥85%，比對質量值≥95%。99.50%的標本文庫復雜度>25%，測序數據質量可靠。經生物信息學分析比對，排除非目標區(qū)突變、低質量突變、胚系突變及同義突變。

2.2NSCLC患者外周血基因突變分布 396例NSCLC患者的28種ctDNA基因譜表明，67.42%的標本至少檢出1個基因突變類型，其中EGFR基因突變所占比例最高為35.35%，其余的主要突變基因包括KRAS(9.85%)、ROS1(7.58%)、PIK3CA(5.56%)、ALK(5.56%)、RET(4.80%)、TSC1(4.04%)、PTEN(3.79%)、HER2(3.28%)、BRAF(2.78%)、DDR2(2.78%)、MET(2.27%)?；蛲蛔儥z出率最高的前5個基因占比為63.89%，前10個基因占比為82.58%，表現出明顯的主基因突變聚集現象。見圖1。

EGFR基因亞型同樣呈現出明顯的主次分布規(guī)律，其中最常見的突變亞型是19del、L858R，分別占45.00%、41.43%，剩余依次是T790M(22.86%)、G719X(3.57%)、S768I(2.14%)、L861Q(2.14%)、20ins(1.43%)，其他(17.14%)。在63例19del突變標本中共發(fā)現15種亞型，占比最高的前5位依次是：c.2235_2249del GGA ATT AAG AGA AGC(23.81%)、c.2236_2250del(20.63%)、c.2235_2249del(12.70%)、c.2239_2248 TTA AGA GAA G>C(9.52%)、c.2240_2257del TAA GAG AAG CAA CAT CTC(9.52%)，其余少見亞型占23.81%，同樣表現出明顯的主亞型聚集現象。見表1。

圖1 NSCLC患者外周血28種基因突變譜

表1 EGFR19號外顯子缺失突變亞型分布

續(xù)表1 EGFR19號外顯子缺失突變亞型分布

2.3NSCLC患者28種基因突變的關系 本研究結果表明，EGFR突變亞型存在明顯的互斥突變與伴隨突變現象。19del缺失突變、L858R點突變和20ins 3個亞型常表現為互斥突變。在63例19del突變病例中，僅有2例分別攜帶G719X和L861Q，其余均為單亞型突變；58例L858R突變病例中，也僅有1例攜帶S768I共突變；2例20ins病例同樣為單突變。伴隨突變則多表現在罕見突變亞型上，如32例T790M突變全部都伴隨其他突變位點；5例G719X突變病例中，發(fā)現有2例攜帶S768I突變，1例攜帶L861Q突變。

T790M突變總是伴隨EGFR敏感突變，主要是19del與L858R 2個亞型，且兩種伴隨突變形式與患者的靶向治療密切相關。32例T790M突變標本中，18例患者經靶向治療并出現一代EGFR-TKI耐藥現象，其伴隨突變是19del；14例患者未經靶向治療，其伴隨突變是L858R。獲得性T790M突變的患者發(fā)生基因突變的概率大于原發(fā)性T790M突變的患者統(tǒng)計分析結果，可能是因為NSCLC患者在靶向治療過程中，腫瘤細胞會在靶向藥物的打擊下進一步發(fā)生克隆演進，導致更多基因發(fā)生突變，形成旁路激活效應，最終導致靶向藥物耐藥。見圖2。

注:A表示T790M獲得性突變；B表示T790M原發(fā)性突變。

圖2 T790M突變狀態(tài)下的多基因突變分布

2.4陽性標本基因突變分析 140例EGFR突變標本中，檢測出存在其他基因突變類型的占36.43%；256例無EGFR突變標本中，檢出其他基因突變類型的占47.27%，提示NSCLC患者的不同基因間同樣存在強烈的基因突變互斥現象(χ2=4.33,P=0.038)。具體分析發(fā)現，EGFR突變標本發(fā)生其他類型基因突變的概率顯著低于無EGFR突變的標本，如KRAS、ALK、RET、PTEN、DDR2、MET等基因突變在EGFR突變患者中的檢出率分別為9.80%、13.73%、5.88%、3.92%、0.00%、3.92%，明顯小于無EGFR突變患者中的檢出率(分別為27.27%、12.40%、13.22%、10.74%、8.26%、5.79%)，可能是EGFR基因突變抑制了其他基因發(fā)生突變。見圖3。

注:A表示EGFR突變標本中多基因突變分布；B表示無EGFR突變標本中多基因突變分布。

圖3 EGFR突變及未突變狀態(tài)下的多基因突變分布

2.5基因突變與臨床病理特征的關系 考察常見驅動基因突變與患者組織類型、組織分期、性別、年齡、吸煙史的關系。腺癌標本EGFR突變檢出率(40.96%)，顯著高于鱗狀細胞癌(19.42%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；女性患者EGFR突變檢出率(51.77%)顯著高于男性(26.27%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；無吸煙史的患者EGFR突變檢出率(46.73%)，明顯高于有吸煙史的患者(23.86%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；晚期患者(不低于3B期)的EGFR突變檢出率(36.53%)，高于早期(低于3B期)患者(14.29%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；<65歲與≥65歲的患者比較，EGFR突變檢出率差異無統(tǒng)計學意義(P=0.97)。KRAS基因突變的特征人群同樣為無吸煙史的女性晚期腺癌患者，但因為統(tǒng)計人群的規(guī)模有限，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，需繼續(xù)擴大樣本量。見表2。

表2 主要基因突變與臨床病理特征(n)

續(xù)表2 主要基因突變與臨床病理特征(n)

注:P1表示高通量測序檢出突變統(tǒng)計值；P2表示EGFR突變統(tǒng)計值；P3表示KRAS突變統(tǒng)計值。

3 討 論

隨著全球生物醫(yī)藥技術的飛速發(fā)展，以肺癌為代表的惡性腫瘤的診治已進入了以生物信息大數據為基礎的精準醫(yī)療時代[4]。高通量測序技術可以對標本的核酸序列進行大規(guī)模的檢測，快速得到患者個體化的全景式基因信息譜，為惡性腫瘤的精準化診治提供支撐，并以其檢測通量大、信息全面、靈敏度高的優(yōu)勢逐步從實驗室研究階段邁入臨床應用階段[5]。在高通量測序臨床應用方面，以美國紀念斯隆凱特琳癌癥研究中心的MSK-IMPACT和美國Foundation Medicin公司的FoundationOne CDx最為引人關注。2018年，中國國家藥品監(jiān)督管理局先后批準燃石醫(yī)學、諾禾致源、世和基因及艾德生物的4款腫瘤高通量測序檢測試劑盒，有效地規(guī)范了腫瘤診斷領域的臨床選擇。本研究對美國國立綜合癌癥網絡推薦的8個基因及20個NSCLC常見的驅動基因進行高通量測序，研究了患者中這些基因突變的特征。

根據396例NSCLC患者的測序結果繪制基因突變圖譜，發(fā)現EGFR的突變檢出率為35.35%，與東亞人群中NSCLC人群30%～40%的EGFR突變檢出率一致[6]。從組織類型看，EGFR基因突變在肺腺癌患者中的檢出率為40.96%；肺鱗狀細胞癌患者中的檢出率為19.42%，高于目前研究報道關于肺鱗狀細胞癌EGFR突變的檢出率，也反映出高通量測序技術相對于傳統(tǒng)檢測方法的靈敏度優(yōu)勢[6]。同時發(fā)現，無論是NSCLC患者的多基因之間，還是EGFR亞型之間，均有明顯的突變聚集現象，主要表現是基因突變檢出率最高的前10個基因占高通量測序檢出突變總數的82.58%，EGFR基因的19del與L858R突變2個亞型占據EGFR突變的86.43%。同時，EGFR基因的19del缺失突變、L858R點突變和20ins 3個亞型上大多為單突變，很少有與其他基因亞型發(fā)生共突變的現象，表現出明顯的互斥突變效應。T790M、G719X、S768I、L861Q等亞型則常常有共突變現象，表現出顯著的伴隨突變效應。本研究進一步豐富了程亞楠等[7]關于EGFR 19del與L858R呈現出明顯的互斥現象的理論，而所有T790M突變都與上述2個突變位點伴隨出現。

T790M是第一代EGFR-TKI藥物的耐藥突變[8]，但ZHENG等[9]研究表明，在影像學檢查顯示病情有發(fā)展前的2.2個月即可在血漿中檢測到T790M突變。本研究表明，T790M伴隨L858R突變常常是原發(fā)性突變，T790M與19del共突變則常是獲得性突變。獲得性T790M突變的患者發(fā)生基因突變的概率大于原發(fā)性T790M突變的患者，可能是因為NSCLC患者靶向治療過程中，腫瘤細胞會在靶向藥物的打擊下進一步克隆演進，導致更多基因發(fā)生突變，最終形成旁路激活。EGFR突變標本發(fā)生多基因突變的頻率顯著低于無EGFR突變標本，如KRAS、ALK、RET等基因突變在EGFR突變患者中的檢出率分別為9.80%、13.73%、5.88%，明顯小于無EGFR突變患者中的27.27%、12.40%、13.22%，可能是因為EGFR基因突變抑制了其他基因發(fā)生突變。

本研究中的ALK在NSCLC中的突變檢出率為5.56%，與張緒超等[10]報道的3%～7%的中國肺癌人群ALK突變檢出率相一致。SOLOMON等[11]研究證實了第一代ALK抑制劑克唑替尼在ALK陽性晚期NSCLC一線治療中的作用。在對克唑替尼的耐藥機制研究中發(fā)現，ALK酪氨酸激酶結構域獲得性突變約占 20%，ALK擴增占8%[12]。ASCEND-4研究中第二代ALK抑制劑色瑞替尼一線治療ALK陽性NSCLC的無進展生存期長達16.6個月，顯著優(yōu)于化療組的8.1個月。無論有無ALK基因激酶區(qū)域的2次突變現象，患者都能從色瑞替尼治療中獲益[13]。目前第三代ALK抑制劑勞拉替尼已在歐洲獲批上市，第四代靶向藥物已處于臨床試驗階段。

BRAF在惡性腫瘤中的突變檢出率約為8%，主要見于黑色素瘤(50%)、甲狀腺乳頭狀癌(30%～70%)，而在NSCLC中的突變檢出率為3%～5%[14]。本研究中BRAF突變檢出率為2.78%，與張海燕等[15]報道的中國人群4.4%的突變檢出率基本一致。BRAF基因突變類型中，約90%的BRAF突變是第15號外顯子的密碼子600處的纈氨酸被谷氨酸替代，即V600E突變。KRON等[16]認為在無針對性的治療時，非 V600E突變型肺癌患者的預后優(yōu)于V600E突變型肺癌患者，提示V600E可能是NSCLC預后不良的獨立影響因素。JOSHI等[17]認為聯(lián)合使用BRAF和MEK靶點抑制劑達拉非尼、曲美替尼對攜帶V600E的NSCLC具有良好治療效果。

近年來，間質-上皮細胞轉化在NSCLC中的臨床應用是研究的熱點，其中MET基因第14號外顯子跳躍突變可作為NSCLC患者治療的新靶點已經得到越來越廣泛的證實[18]。MET基因第14號外顯子跳躍突變總發(fā)生率為3%～6%，多發(fā)于肺肉瘤樣癌(22%)和肺腺癌(3%～4%)[19-20]。但LIU等[21]分析了968例中國NSCLC患者的基因信息，發(fā)現MET基因第14號外顯子跳躍突變僅占腺癌患者的0.9%。MET基因的靶向藥物多為腺苷三磷酸的選擇性競爭抑制劑，通過抑制MET的活性進而阻止下游相關激酶的磷酸化，從而實現對腫瘤細胞增殖、轉移的調控。YAP等[22]研究了21例MET基因第14號外顯子突變的晚期NSCLC患者，經克唑替尼靶向治療，部分緩解率為44%，疾病控制率為50%，顯示了良好的臨床療效。

4 結 論

本研究采用高通量測序技術對NSCLC患者28種靶向治療相關驅動基因的突變信息進行全景檢測，證實EGFR基因亞型間的分布規(guī)律及EGFR基因對其他基因突變的抑制作用，為臨床醫(yī)生制訂NSCLC患者的精準診療方案提供了有力的保障。從更高層面上看，高通量測序技術的臨床應用可以加快對未知病因或病因復雜的家族性腫瘤的研究與評估，也有利于發(fā)現新的致病基因，使腫瘤的預防更精準、有效。