張 寧，范 迪，楊 燕，王 贏，徐 瓊，崔學(xué)文，房玉國，聞宏亮，秦 峰，劉 浩，范一靈,

（1.國家藥品監(jiān)督管理局藥品微生物檢測技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海 201203；2.上海質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，上海 200233；3.上海海關(guān)，上海 200135；4.四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測院，四川 成都 611731；5.國家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，黑龍江 哈爾濱 150086）

肌醇又稱環(huán)己六醇，是一種具有生物活性的環(huán)狀糖醇。1928年，Eastcott首次制備了純凈態(tài)的肌醇[1]。1940年Wooley首次發(fā)現(xiàn)肌醇具有抗脫毛作用，從而揭開了肌醇具有維生素活性這一特性。研究發(fā)現(xiàn)，肌醇理論上具有9 種立體異構(gòu)體[2-4]，其中內(nèi)消旋(1,2,3,5-順式)環(huán)己醇具有維生素生物活性。

肌醇廣泛分布于動植物體內(nèi)，幾乎所有的生物中都含有游離態(tài)或結(jié)合態(tài)肌醇，是生物體生命活動不可缺少的物質(zhì)[5]，特別是在全谷物和柑橘類水果內(nèi)。肌醇通過磷酸化和去磷酸化以應(yīng)形成帶有不同數(shù)量磷酸基團(tuán)的衍生物，參與各種生物代謝過程[6]，具有多種生理藥理活性[7]，廣泛應(yīng)用于飼料[8-9]、食品[10]、醫(yī)藥[11-13]等行業(yè)。醫(yī)藥行業(yè)中，肌醇能促進(jìn)脂肪代謝，防止體內(nèi)脂肪累積，具有免疫、預(yù)防和治療某些疾病等作用[14-16]。食品工業(yè)中，肌醇是人體多類型細(xì)胞的必需生長因子，尤其在胎兒及兒童生長發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]，因此，其作為一種營養(yǎng)強(qiáng)化劑添加于嬰幼兒配方乳粉及特殊膳食食品中。

國內(nèi)外有關(guān)肌醇檢測的方法主要有色譜法（氣相色譜法[18-20]、氣相色譜-質(zhì)譜法[21-22]、高效液相色譜法[23]、液相色譜-質(zhì)譜法[24]、離子色譜法[25]）和微生物法[8,26]。目前，國際標(biāo)準(zhǔn)關(guān)于肌醇檢測的方法均為理化檢驗(yàn)法，涉及的方法有AOAC 2011.18的液相色譜法、AOAC 2012.12的離子色譜法以及ISO 20637:2015的液相色譜法，上述方法適用基質(zhì)均為嬰幼兒和成人營養(yǎng)配方食品；國內(nèi)關(guān)于肌醇檢測的標(biāo)準(zhǔn)主要有GB 5009.270—2016《食品中肌醇的測定》、GB/T 5009.196—2003《保健食品中肌醇的測定》、NY/T 1345—2007《添加劑預(yù)混合飼料中肌醇的測定》、GB/T 23879—2009《飼料添加劑 肌醇》，涉及的方法主要以理化色譜法為主，僅GB 5009.270—2016中涉及到微生物法。色譜法主要適用于含量較高、基質(zhì)成分簡單的強(qiáng)化食品中肌醇的測定；微生物法基于某些微生物對肌醇利用的特異性，具有高靈敏度，更適合含量較低、基質(zhì)成分復(fù)雜的天然食品中肌醇的測定。然而，在實(shí)際應(yīng)用中，GB 5009.270—2016中的微生物法[26]在測試菌株肌醇利用特異性、方法操作步驟及終點(diǎn)判斷原則規(guī)范化等方面仍需改進(jìn)及明確，因此，本研究分別從肌醇利用特異性菌株的篩選、菌懸液的制備方式、標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方式及培養(yǎng)終點(diǎn)時(shí)間的判斷等方面進(jìn)行方法探索，從而對該國標(biāo)的方法進(jìn)行優(yōu)化改良，最終以不同類別的食品為基質(zhì)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室間的方法驗(yàn)證，分別考察方法的精密度、回收率及重現(xiàn)性，最終獲得可靠穩(wěn)定的用于肌醇測定的微生物方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母菌：Saccharomyces cerevisiae CICC 32919、ATCC 9080、ACCC 20065；葡萄汁酵母菌：S. uvarum CICC 1465、CICC 31161、ACCC 20202。

肌醇測定培養(yǎng)基 青島日水生物科技有限公司；麥芽汁浸粉瓊脂培養(yǎng)基、麥芽汁肉湯培養(yǎng)基 上海瑞楚生物科技有限公司；肌醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.5%） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Infinite F200 PRO型酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；UV2450分光光度計(jì) 日本島津公司；PYX-DHS-600-BS型恒溫培養(yǎng)箱 上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SI-600R型振蕩培養(yǎng)箱 韓國Jeiotech公司；HV-110型壓力蒸汽消毒器 日本Hirayama公司。

1.3 方法

1.3.1 肌醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

按照GB 5009.270—2016中3.4節(jié)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制[26]。

1.3.2 接種菌懸液的制備

將菌株活化后接種至麥芽浸粉瓊脂斜面培養(yǎng)基，（30±1）℃培養(yǎng)2～3 d后，制成貯備菌種，貯于4 ℃冰箱中，保存期不要超過2 周。

使用前1 d，將保存菌種轉(zhuǎn)接至10 mL滅菌麥芽浸粉液體培養(yǎng)基，（30±1）℃培養(yǎng)20～24 h。取麥芽浸粉液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物，無菌條件下2 000 r/min離心15 min，傾去上清液。加入10 mL無菌0.9%氯化鈉溶液，重新分散細(xì)胞，于旋渦混合器上快速混合均勻，離心15 min，傾去上清液。重復(fù)離心和清洗步驟3 次。最后一次細(xì)胞分散液用無菌0.9%氯化鈉溶液懸浮，制成混懸液，備用。用紫外-可見分光光度計(jì)，以無菌0.9%氯化鈉溶液作空白，550 nm波長處測定接種菌懸液的透光率，調(diào)整加入的菌液量或者加入一定量的無菌0.9%氯化鈉溶液使該菌懸液透光率在60%～80%之間，盡快使用。

1.3.3 樣品處理

樣品前處理：薏米樣品粉碎、研磨、過篩；南瓜粉及豬肝粉樣品用前混勻；飲料樣品用前振搖混勻。

樣品提?。簻?zhǔn)確稱取含肌醇0.50～2.00 mg的上述試樣于250 mL錐形瓶中，固體試樣加入80 mL 0.44 mol/L鹽酸溶液，液體試樣加入100 mL 0.44 mol/L鹽酸溶液，混勻。將錐形瓶以鋁箔紙覆蓋，在滅菌釜中125 ℃水解1 h。取出，冷卻至室溫，加入約3 mL 12.5 mol/L氫氧化鈉溶液，冷卻。用適宜濃度的氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)pH 5.2±0.1，轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中，定容至刻度。混勻，過濾，收集濾液。調(diào)整濾液稀釋倍數(shù)，使待測液肌醇質(zhì)量濃度在0.1～1.0 μg/mL范圍內(nèi)，作為試樣提取液。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測液系列管制作

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線管的制作

按照GB 5009.270—2016中5.4節(jié)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[26]。

1.3.4.2 待測液系列管的制作

按照GB 5009.270—2016中5.5節(jié)待測液的制作[26]。

1.3.4.3 接種及培養(yǎng)

向1.3.4.1節(jié)和1.3.4.2節(jié)中所有的試管各加入玻璃珠1 顆，121 ℃、5 min滅菌，迅速冷卻，將1.3.2節(jié)制備好的接種菌懸液向上述試管內(nèi)（除對照管）各加約150 μL，混勻，（30±1）℃振蕩培養(yǎng)。

1.3.4.4 96 孔板中的加樣制備及培養(yǎng)

系列管按1.3.4.1節(jié)和1.3.4.2節(jié)制作后，每孔加入200 μL制備液，將孔板置于酶標(biāo)儀中，（30±1）℃振蕩培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)過程中每小時(shí)檢測一次OD550nm。

1.3.5 肌醇測定菌株的篩選

按照1.3.4.1節(jié)分別制備對照管（S1）3 管，無肌醇培養(yǎng)體系（S2：肌醇質(zhì)量濃度0 μg/mL）及高質(zhì)量濃度肌醇培養(yǎng)體系（S10：肌醇質(zhì)量濃度1 μg/mL）各18 管。按照1.3.2節(jié)方法將6 株酵母菌分別制備接種菌懸液，將制備好的6 株菌菌懸液分別按照1.3.4.3節(jié)接種至上述S2、S10管（每株菌每管平行制備各3 管），將制備好的培養(yǎng)體系分別按照1.3.4.4節(jié)方法進(jìn)行96 孔板的加樣制備及培養(yǎng)。

1.3.6 肌醇測定菌株培養(yǎng)時(shí)間的考察

按照1.3.4.1節(jié)分別制備3 管S1及若干管S10。按照1.3.2節(jié)方法制備S. uvarum CICC 1465菌懸液，按照1.3.4.3節(jié)方法接種至上述S10管，（30±1）℃培養(yǎng)24 h后，每隔1 h取樣測定OD550nm，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD550nm為縱坐標(biāo)，繪制S. uvarum CICC 1465的生長曲線。

1.3.7 肌醇測定菌株標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照1.3.4.1節(jié)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線管的制作，按照1.3.2節(jié)方法制備S. uvarum CICC 1465菌懸液，按照1.3.4.3節(jié)接種至上述標(biāo)準(zhǔn)曲線管并培養(yǎng)，以肌醇質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，不同肌醇質(zhì)量濃度下菌株生長OD550nm為縱坐標(biāo)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，采用四參數(shù)Logistic擬合方式。四參數(shù)Logistic模型的方程如下：

式中：A、B、C、D為擬合曲線的4 個(gè)特征性參數(shù)，其中，A為以應(yīng)下限值，D為以應(yīng)上限值，B為曲線的斜率因子，C為半數(shù)有效濃度（EC50）。

1.3.8 培養(yǎng)終點(diǎn)期菌株生長變化量的考察

按照1.3.4.1節(jié)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線管的制作，按照1.3.2節(jié)方法制備S. uvarum CICC 1465菌懸液，按照1.3.4.3節(jié)接種至上述標(biāo)準(zhǔn)曲線管并培養(yǎng)，培養(yǎng)至38 h后，每隔2 h測定S10管的OD550nm，最終以6 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.9 方法學(xué)驗(yàn)證

驗(yàn)證單位：4 家國內(nèi)食品檢驗(yàn)檢測實(shí)驗(yàn)室，編號1～4。

驗(yàn)證方法：以S. uvarum CICC 1465為測試菌株，按照1.3.1～1.3.3、1.3.4.1～1.3.4.3節(jié)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用四參數(shù)Logistic方程進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，終點(diǎn)判斷原則為培養(yǎng)約38 h后，同等條件下每隔2 h監(jiān)測最高質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線管S10，測定其OD550nm，兩次OD550nm的絕對差結(jié)果不大于5%時(shí)，終止培養(yǎng)，一般培養(yǎng)時(shí)間不超過44 h。通過上述方法進(jìn)行樣品中肌醇含量的測定。

驗(yàn)證樣品：維生素功能飲料、豬肝粉、南瓜粉及薏米粉。

精密度驗(yàn)證：每個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別對每種試樣進(jìn)行7 次獨(dú)立測定實(shí)驗(yàn)。

回收率驗(yàn)證：每個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別對每個(gè)樣品進(jìn)行試樣與標(biāo)準(zhǔn)品1∶1加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。

重現(xiàn)性驗(yàn)證：綜合對4 家實(shí)驗(yàn)室測定的4 種樣品的肌醇含量進(jìn)行重現(xiàn)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌醇測定菌株的篩選

肌醇是酵母菌生長必須的生長因子[27]，有些酵母菌自身能夠合成細(xì)胞生長所需的肌醇[28]，而有些酵母菌卻是天然的肌醇缺陷型，必須依賴培養(yǎng)基中的外源肌醇[29]。因此，本研究基于此原理，分別從大量酵母菌中選擇6 株常用于維生素檢測的酵母菌，進(jìn)行肌醇測定菌株的篩選。

圖1 肌醇對不同菌株生長的特異性Fig. 1 Effect of inositol concentration on the growth specificity of different strains

由圖1可知，與每株菌在S10中生長趨勢相比較，S. cerevisiaeATCC 9080、S. cerevisiaeACCC 20065、S. cerevisiaeCICC 32919、S. uvarumCICC 31161、S. uvarumACCC 20202在無肌醇培養(yǎng)體系中（S2）均有明顯的同步生長，而S. uvarumCICC 1465在S2中未有明顯生長。因此，葡萄汁酵母S. uvarumCICC 1465為肌醇利用特異性菌株，具有特異性檢測肌醇含量的潛力。

2.2 肌醇測定菌株培養(yǎng)時(shí)間的選擇

圖2 S. uvarum CICC 1465菌株生長曲線（24～48 h）Fig. 2 Growth curve of S. uvarum CICC 1465 during cultivation period from 24 to 48 hours

由圖2可知，菌株S. uvarumCICC 1465在生長至38～48 h趨于穩(wěn)定期，因而建議采用S. uvarumCICC 1465菌株進(jìn)行肌醇測定時(shí)，在38～48 h進(jìn)行監(jiān)控，確定終點(diǎn)培養(yǎng)時(shí)間。

2.3 肌醇測定菌株標(biāo)準(zhǔn)曲線

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株S. uvarumCICC 1465生長OD550nm與培養(yǎng)體系中肌醇質(zhì)量濃度呈S型曲線關(guān)系，四參數(shù)Logistic模型是S型曲線的常用擬合模型[30-31]，各參數(shù)對生物以應(yīng)關(guān)系更具有實(shí)際意義，因此，本研究采用四參數(shù)Logistic擬合方式，以肌醇質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，不同肌醇質(zhì)量濃度下菌株生長OD550nm為縱坐標(biāo)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合繪制。

圖3 S. uvarum CICC 1465肌醇測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 3 Standard curve for determination of inositol using S. uvarum CICC 1465

由圖3可知，肌醇質(zhì)量濃度0.1～0.2 μg/mL時(shí)，菌株OD550nm增長較為緩慢，肌醇質(zhì)量濃度0.2～0.7 μg/mL時(shí)，菌株OD550nm呈對數(shù)增長，肌醇質(zhì)量濃度0.7～1.0 μg/mL時(shí)，菌株OD550nm增長逐漸趨于平緩，曲線呈S型曲線以應(yīng)關(guān)系，適宜于四參數(shù)Logistic模型。此外，本研究采用四參數(shù)Logistic擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線r2大于0.99，曲線擬合較好。

2.4 培養(yǎng)終點(diǎn)期菌株生長變化量

表1 S. uvarum CICC 1465在培養(yǎng)終點(diǎn)2 h內(nèi)OD550 nm的變化Table 1 Change in OD550 nm of S. uvarum CICC 1465 within 2 h before the end point of culture

由表1可知，培養(yǎng)至終點(diǎn)時(shí)，2 h內(nèi)菌株OD550nm的絕對差結(jié)果不大于5%。因此，建議培養(yǎng)約38 h后，同等條件下每隔2 h監(jiān)測最高質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線管S10，測定其OD550nm，兩次OD550nm的絕對差結(jié)果不大于5%時(shí)，終止培養(yǎng)，一般培養(yǎng)時(shí)間不超過44 h。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 精密度

表2 精密度測定結(jié)果Table 2 Results of precision test

表2結(jié)果表明，本方法在上述試樣的測定中，精密度均在10%以內(nèi)，其中南瓜粉試樣的測定精密度均在2%以內(nèi)。

2.5.2 回收率

表3 回收率測定結(jié)果Table 3 Results of recovery test

由表3可知，本方法在不同基質(zhì)中的回收率為92.3%～114.3%。

2.5.3 重現(xiàn)性

本實(shí)驗(yàn)涉及維生素功能飲料、豬肝粉、南瓜粉及薏米粉4 種試樣，通過采用本研究方法分析同一試樣在不同驗(yàn)證單位間的肌醇，考察本方法的重現(xiàn)性。表4結(jié)果顯示，本方法的重現(xiàn)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在10%以內(nèi)。

表4 重現(xiàn)性測定結(jié)果Table 4 Results of reproducibility test

因此，綜合考察食品中肌醇測定方法的精密度、回收率及重現(xiàn)性，顯示篩選的測試菌株及測定方法在應(yīng)用可行，能夠滿足測定要求。

3 討 論

3.1 接種菌懸液制備方式的優(yōu)化

GB 5009.270—2016微生物法中，直接刮取麥芽浸粉瓊脂斜面培養(yǎng)基上的菌苔制備菌懸液。本研究將麥芽浸粉瓊脂斜面菌種轉(zhuǎn)接麥芽浸粉液體培養(yǎng)基后，再取培養(yǎng)物制備菌懸液。該操作避免了將瓊脂成分?jǐn)y帶至菌懸液中，減少了對菌懸液透光率測定的干擾，從而保證了接種菌量的準(zhǔn)確性。

3.2 測試菌株的優(yōu)化

GB 5009.270—2016微生物法測定肌醇含量采用的測試菌株為釀酒酵母菌S. cerevisiaeATCC 9080。實(shí)驗(yàn)過程發(fā)現(xiàn)，S. cerevisiaeATCC 9080在無肌醇培養(yǎng)體系中菌株仍可快速生長，缺乏對肌醇的生長特異性。因此，本研究通過菌株的肌醇利用特異性篩選實(shí)驗(yàn)，篩選得肌醇生長特異性菌株葡萄汁酵母S. uvarumCICC 1465，經(jīng)驗(yàn)證，葡萄汁酵母S. uvarumCICC 1465符合方法的測定原理，且能夠滿足方法的測定要求。

3.3 終點(diǎn)判斷原則的優(yōu)化

有關(guān)微生物法測定維生素含量的方法中，培養(yǎng)終點(diǎn)時(shí)間的判斷對測定結(jié)果準(zhǔn)確度至關(guān)重要。若在終點(diǎn)前結(jié)束培養(yǎng)進(jìn)行測定，那么高質(zhì)量濃度培養(yǎng)體系中的肌醇未被微生物完全利用，從而導(dǎo)致測定結(jié)果無法以映試樣中肌醇的實(shí)際含量。因此，本研究通過監(jiān)控肌醇最高濃度培養(yǎng)管的OD550nm變化，確定了培養(yǎng)的終點(diǎn)判斷原則，從而保證了測定方法的準(zhǔn)確性及嚴(yán)謹(jǐn)性。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方式的優(yōu)化

微生物法測定食品中維生素研究過程中發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線常呈S型曲線，這使得傳統(tǒng)的線性擬合方式不能實(shí)現(xiàn)對標(biāo)準(zhǔn)曲線的良好擬合，而四參數(shù)Logistic模型是針對S型曲線實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理常用的方程。該模型符合生物學(xué)活性計(jì)算的前提和原則，操作簡便，普適性強(qiáng)，美國藥典（USP40）、歐洲藥典（EP9.0）、英國藥典（BP2017）均已收載四參數(shù)回歸計(jì)算法[32]。本研究將該模型用于微生物法測定食品中維生素含量中，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證及比較，均表明該模型適用于本方法，且優(yōu)于傳統(tǒng)的擬合方式，能夠滿足測定要求。

4 結(jié) 論

本研究成功篩選到1 株肌醇利用特異性菌株葡萄汁酵母S. uvarumCICC 1465，利用該菌進(jìn)行食品中肌醇檢測方法研究，同時(shí)，將四參數(shù)Logistic擬合方式用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，并采用不同類別的試樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室間方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明，本研究方法精密度、回收率及重現(xiàn)性均得到較好的效果。本研究改良了現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)微生物法中的測試菌株，進(jìn)一步明確并細(xì)化了方法中的相關(guān)操作步驟，規(guī)范了方法中的相關(guān)限制性原則及指標(biāo)，使得方法的可操作性更強(qiáng)，保證了方法實(shí)施的嚴(yán)謹(jǐn)性，為相關(guān)食品安全監(jiān)管部門及企業(yè)提供了更可靠的技術(shù)支撐。因此，本研究方法更適用于食品中肌醇的定量測定。