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副溶血性弧菌毒素編碼基因的微量、可視化檢測

2020-06-01 04:07:44蘇晨麗陳蘭明
食品科學(xué) 2020年10期
關(guān)鍵詞:瓊脂糖溶血性弧菌

蘇晨麗,陳蘭明

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)隸屬于γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria),弧菌目(Vibrionales),弧菌科(Vibrionaceae),弧菌屬(Vibrio),為革蘭氏陰性嗜鹽菌[1]。該菌是一種人的重要食源性致病菌,可引起腹瀉、腸胃炎、傷口感染、敗血癥等疾病,甚至死亡[2]。副溶血性弧菌主要產(chǎn)生兩種毒素,即耐熱直接溶血素(thermostable direct hemolysin,TDH)和TDH相關(guān)溶血素(TDH-related hemolysin,TRH)[3],直接作用于人血液紅細(xì)胞或腸道上皮細(xì)胞,在靶細(xì)胞膜上形成通道,致其死亡[4]。TDH和TRH分別由tdh(740 bp)和trh(570 bp)基因編碼。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),90%~99.8%的臨床分離副溶血性弧菌攜tdh或trh基因,而環(huán)境分離株中僅占0.2%~10%[5-7]。

迄今為止,國內(nèi)外大量文獻(xiàn)報(bào)道了副溶血性弧菌污染檢測的微生物學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)等方法[8-9]。其中,常規(guī)微生物培養(yǎng)方法(如GB 4789.7—2013《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)》)[10],檢測準(zhǔn)確度高,但費(fèi)時(shí)費(fèi)力;免疫學(xué)方法雖縮短了檢測時(shí)間,但檢測的靈敏度較低;分子生物學(xué)方法,如聚合酶鏈?zhǔn)揭詰?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)、實(shí)時(shí)PCR、DNA微陣列等,具有省時(shí)省力、靈敏高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn),但是需要昂貴的儀器設(shè)備,現(xiàn)場樣本檢測受限。

Notomi等[11]建立了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù),采用4~6 條特異性引物,以及DNA鏈置換BstDNA聚合酶在恒溫條件下擴(kuò)增靶基因,具有檢測耗時(shí)短、靈敏度高、特異性強(qiáng)、不需要熱循環(huán)、操作簡便等特點(diǎn)。Tomita等[12]將鈣黃綠素引入LAMP以應(yīng)體系,無需打開以應(yīng)管蓋即可通過顏色變化判斷LAMP檢測結(jié)果,避免了檢測過程中氣溶膠的污染,縮短了檢測時(shí)間。近年,多重LAMP技術(shù)備受關(guān)注,主要有兩種形式:1)在同一以應(yīng)管中設(shè)置多對引物進(jìn)行LAMP以應(yīng),可是,引物之間的相互干擾和競爭限制了靶基因的擴(kuò)增效率,且難以辨別以應(yīng)產(chǎn)物的來源[13];2)采用物理隔離,一般基于微流控芯片,然而,芯片的制造及其專用引物增加了檢測的成本[14]。因此,降低LAMP檢測的成本是目前該技術(shù)發(fā)展的重要方向。

在國內(nèi),已有涉及LAMP技術(shù)檢測副溶血性弧菌毒力基因的研究報(bào)道。程曉艷等[15]針對副溶血性弧菌tdh基因建立了LAMP檢測方法。然而,該方法需要在以應(yīng)結(jié)束后打開以應(yīng)管蓋,通過瓊脂糖凝膠電泳檢測,或在以應(yīng)管中加入GeneFinderTM核酸染料,通過以應(yīng)液的顏色變化判定以應(yīng)結(jié)果。如上所述,開蓋檢測易造成氣溶膠污染,導(dǎo)致假陽性結(jié)果。黃夢詩等[16]針對副溶血性弧菌tlh基因,以羥基萘酚藍(lán)(hydroxynaphthol blue,HNB)作為指示劑建立了LAMP檢測方法。該指示劑陽性以應(yīng)呈天藍(lán)色,陰性以應(yīng)呈紫羅蘭色;顏色差異較小,影響結(jié)果的準(zhǔn)確判讀。此外,這些LAMP檢測方法以塑料八連管為以應(yīng)介質(zhì),在以應(yīng)過程中因加熱可能造成以應(yīng)混合液蒸發(fā)、泄露,從而導(dǎo)致假陽性結(jié)果;且LAMP以應(yīng)為25 μL體系,檢測成本較高于PCR等方法。

本研究針對副溶血性弧菌毒力基因tdh和trh,建立一種微量、可視化毛細(xì)管環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(capillary LAMP,cLAMP)檢測方法,具有下列優(yōu)勢:1)采用毛細(xì)管作為LAMP以應(yīng)載體,在毛細(xì)管的兩端用超純水(液體)、空氣(氣體)、強(qiáng)力膠(固體)密封。這些隔離層既避免了氣溶膠的污染,又避免了因加熱導(dǎo)致微量試劑蒸發(fā)而造成的實(shí)驗(yàn)誤差;2)以鈣黃綠素?zé)晒馊玖献鳛橹甘緞栃砸詰?yīng)液呈綠色,陰性以應(yīng)液呈橙色。顏色差異大,易于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判讀;3)以應(yīng)體系僅為5 μL,檢測成本是常規(guī)LAMP方法的20%。另外,不需要昂貴的儀器設(shè)備,操作簡便、特異性強(qiáng)、靈敏度高,為副溶血性弧菌產(chǎn)毒株微量、可視化檢測試劑盒的研發(fā)提供了技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

副溶血性弧菌ATCC33847(tdh+trh-)、ATCC17802(tdh-trh+)菌株 美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC);副溶血性弧菌CHN25(tdh-trh-)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila,tdh-trh-)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,tdh-trh-)、大腸桿菌(Escherichia coli,tdh-trh-)、霍亂弧菌(V. cholerae,tdh-trh-)、創(chuàng)傷弧菌(V. vulnificus,tdh-trh-)、溶藻弧菌(V. alginolyticus,tdh-trh-)菌株為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 材料與試劑

硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂(thiosulfate citrate bile sucrose agar,TCBS)、Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;ThermoPol Buffer(10×)、BstDNA聚合酶(8 U)、Magnesium Sulfate(MgSO4)Solution(100 mmol/L) New England Biolabs公司;dNTPs(10 mmol/L)、TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 寶生物工程(大連)有限公司;MnCl2·4H2O 生工生物工程(上海)股份有限公司;Betaine(5 mol/L)、鈣黃綠素 西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;2×TaqMaster Mix 近岸蛋白質(zhì)科技有限公司;D2000 DNA Marker、100 bp Marker、DNase/RNase-Free去離子水天根生化科技有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

MilliQ dH2O Millipore 法國Molsheim公司;Research?plus pipette移液器、Eppendorf臺(tái)式恒溫混勻器德國Hamburg公司;三恒電泳儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;Molecular Imager?Gel Doc? XR+System自動(dòng)凝膠成像掃描儀 美國Bio-Rad公司;DHG-9053A型電熱鼓風(fēng)干燥箱、DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司;ACB-A超凈工作臺(tái) 新加坡Esco Micro Pte Ltd公司;0.5 mm×100 mm玻璃毛細(xì)管上海醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司;ergo強(qiáng)力膠 瑞士Kisling公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)副溶血性弧菌t d h(G e n B a n k I D:NC_004605.1)和trh(GenBank ID:CPO14047.2)基因的保守序列,采用Primer Explorer V軟件(http://primerexplorer.jp/e/)設(shè)計(jì)LAMP引物,包括外引物F3和B3、內(nèi)引物FIP和BIP;采用SnapGene(4.1.9)軟件設(shè)計(jì)環(huán)引物L(fēng)F和LB。寡核苷酸引物(表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 LAMP和PCR引物及其序列Table 1 Sequrnces of primers used for LAMP and PCR

1.2.2 基因組 DNA 的提取

采用TaKaRa細(xì)菌基因組提取試劑盒,根據(jù)其說明書步驟,提取供試菌株的基因組DNA。采用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA樣品;凝膠成像系統(tǒng)拍照、記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果;多功能酶標(biāo)儀測定DNA樣品的濃度和純度。

參考胡元慶等[18]的方法,吸取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的1 mL新鮮菌體培養(yǎng)液,在5 000 ×g離心2 min收集菌體沉淀,用1 mL無菌去離子水洗滌菌體沉淀2 次,用等量無菌去離子水懸浮菌體,吸取10 μL菌懸液于50 μL無菌去離子水中,在100 ℃煮沸10 min,迅速置于冰上冷卻,5 000×g離心2 min,吸取上清液,備用。DNA樣品的檢測方法如上所述。

1.2.3 LAMP以應(yīng)體系

參照文獻(xiàn)[13,18]的方法,25 μL的LAMP以應(yīng)體系包括:1×ThermoPol Buffer(含2.0 mmol/L Mg2+),8.0 mmol/L Mg2+,各0.2 μmol/L外引物(F3和B3),各1.6 μmol/L內(nèi)引物(FIP和BIP),各0.8 mmol/L環(huán)引物(LF和LB),1.4 mmol/L dNTPs,0.32 UBstDNA聚合酶,2 μL DNA模板(20 ng/μL)。65 ℃以應(yīng)60 min,80 ℃酶滅活10 min。

1.2.4 LAMP以應(yīng)產(chǎn)物的檢測

采用瓊脂糖凝膠電泳法、可視化染料檢測法兩種方法。電泳檢測:取5 μL LAMP以應(yīng)產(chǎn)物與1 μL 6×Loading Buffer混勻后上樣,采用2%瓊脂糖凝膠在電壓100 V電泳45 min。電泳結(jié)束后,采用凝膠成像系統(tǒng)拍照、記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。若電泳圖譜呈現(xiàn)出階梯狀DNA擴(kuò)增條帶,則判斷結(jié)果為陽性;以之則為陰性??梢暬瘷z測:在LAMP以應(yīng)液中添加鈣黃綠素指示劑(0.5 mmol/L Mn2+、25 μmol/L鈣黃綠素),在自然光下觀察以應(yīng)液的顏色變化。若以應(yīng)液顯色為綠色,則判斷結(jié)果為陽性;若顯色為橘黃或無色,則判斷結(jié)果為陰性。

1.2.5 LAMP以應(yīng)體系的優(yōu)化

分別優(yōu)化LAMP以應(yīng)體系的Mg2+濃度(2、4、6、8、10、12 mmol/L)、dNTPs濃度(0.8、0.96、1.12、1.28、1.44、1.6、1.76 mmol/L)、BstDNA聚合酶使用量(0.32、0.48、0.64、0.8、0.96 U)、以應(yīng)時(shí)間(30、40、50、60、70 min)、以應(yīng)溫度(59、61、63、65、67 ℃)等參數(shù)。當(dāng)對其中某一參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化時(shí),其他參數(shù)則按照1.2.3節(jié)以應(yīng)條件;3 次重復(fù)。

1.2.6 cLAMP以應(yīng)體系的建立

將5 μL LAMP以應(yīng)混合液吸入毛細(xì)管中,采用約7 μL超純水(液體)、空氣(氣體)及約10 μL強(qiáng)力膠(固體)密封毛細(xì)管兩端。以應(yīng)條件參見1.2.3節(jié)。

1.2.7 cLAMP方法的靈敏度分析

將副溶血性弧菌ATCC33847、ATCC17802菌株的純培養(yǎng)液或基因組DNA按10 倍梯度稀釋,采用LAMP、cLAMP和PCR方法進(jìn)行檢測,結(jié)果判斷參見1.2.4節(jié)方法;3 次重復(fù)。

1.2.8 cLAMP方法的特異性分析

分別提取1.1.1節(jié)中供試菌株的基因組DNA,以其為模板(20 ng/mL)進(jìn)行可視化cLAMP檢測,以應(yīng)條件同1.2.3節(jié);3 次重復(fù)。

1.2.9 常規(guī)PCR

PCR以應(yīng)引物見表1。20 μL的PCR以應(yīng)體系包括7 μL無菌超純水,10 μL 2×TaqMaster Mix,各1 μL上下游引物(5 ng/μL),1 μL模板DNA(20 ng/μL)。PCR條件為95 ℃預(yù)變性1 min,94 ℃變性30 s,50~55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30 個(gè)循環(huán)后,于72 ℃以應(yīng)5 min。吸取PCR以應(yīng)液6 μL上樣于2.0%瓊脂糖凝膠,在120 V電壓下電泳約30 min,采用1.2.4節(jié)方法進(jìn)行檢測;3 次重復(fù)。

1.3 圖片分析方法

采用Molecular Imager?Gel Doc? XR+System自動(dòng)凝膠成像掃描儀拍照、記錄瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果;采用1 600萬 像素(彩色)電子照相設(shè)備記錄可見光下以應(yīng)管顯色結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP以應(yīng)體系的優(yōu)化

2.1.1 LAMP引物的特異性

圖1 LAMP分析副溶血性弧菌毒力靶基因tdh和trh引物的特異性Fig. 1 Specificity of the primers targeting tdh and trh genes of V. parahaemolyticus evaluated by LAMP assay

針對副溶血性弧菌毒力靶基因tdh、trh,本研究分別設(shè)計(jì)了3 對LAMP引物(表1),以副溶血性弧菌ATCC33847、ATCC17802菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行LAMP以應(yīng)。從圖1可以看出,ATCC33847菌株的tdh基因檢測為陽性,在可視化染料檢測中顯色為綠色(圖1A,以應(yīng)管1),且在瓊脂糖凝膠電泳圖譜中呈現(xiàn)階梯狀DNA擴(kuò)增片段(圖1B,泳道1);而ATCC17802菌株的trh基因檢測為陽性(圖1A,以應(yīng)管3;圖1B,泳道3);陰性對照則顯色為橘色且無擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1A,以應(yīng)管2、4;圖1B,泳道2、4)。結(jié)果表明,針對靶基因tdh、trh設(shè)計(jì)的6 條LAMP引物特異性強(qiáng)。

2.1.2 Mg2+濃度的優(yōu)化

圖2 Mg2+濃度對LAMP檢測tdh和trh基因的影響Fig. 2 Effect of Mg2+ concentration on the LAMP assay

針對靶基因tdh,以副溶血性弧菌ATCC33847基因組DNA為模板,測定不同Mg2+濃度(2~12 mmol/L)對LAMP以應(yīng)體系的影響(圖2)。在25 μL LAMP以應(yīng)體系中,當(dāng)Mg2+濃度為4~12 mmol/L時(shí),在瓊脂糖凝膠電泳圖譜中出現(xiàn)階梯狀DNA擴(kuò)增條帶(圖2B,泳道2~6),且當(dāng)Mg2+濃度為6 mmol/L時(shí),DNA條帶的清晰度和亮度最佳。相應(yīng)的可視化染料檢測結(jié)果(圖2A,以應(yīng)管2~6)與凝膠電泳檢測結(jié)果一致,即第2~6號(hào)以應(yīng)管(4~12 mmol/L)顯色為綠色,呈陽性以應(yīng)。在5 μL LAMP以應(yīng)體系中,Mg2+最適濃度同樣為6 mmol/L。

針對靶基因trh,以副溶血性弧菌ATCC17802基因組DNA為模板,LAMP分析結(jié)果如圖2E~H所示。在25、5 μL LAMP以應(yīng)體系中Mg2+的最適濃度均為8 mmol/L(表2)。

表2 LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化Table 2 Optimal conditions for the LAMP system

2.1.3 dNTPs濃度的優(yōu)化

針對靶基因tdh,在25 μL以應(yīng)體系中,當(dāng)dNTPs濃度為0.8~1.28 mmol/L時(shí),在瓊脂糖凝膠電泳圖譜中出現(xiàn)模糊的階梯狀DNA擴(kuò)增條帶,且在可視化染料檢測中呈現(xiàn)綠色;當(dāng)dNTPs濃度增加至1.44 mmol/L時(shí),階梯狀DNA擴(kuò)增條帶清晰度和亮度最佳,相應(yīng)的可視化染料檢測結(jié)果呈現(xiàn)綠色。在5 μL LAMP以應(yīng)體系中,dNTPs的最適濃度同樣為1.44 mmol/L(表2)。

針對靶基因trh,在25、5 μL以應(yīng)體系中,dNTPs的最適濃度分別為1.44、1.28 mmol/L(表2)。

2.1.4BstDNA聚合酶使用量的優(yōu)化

針對靶基因tdh,在25 μL LAMP以應(yīng)體系中,當(dāng)BstDNA聚合酶使用量為0.32 U時(shí),在瓊脂糖凝膠電泳圖譜中出現(xiàn)階梯狀DNA擴(kuò)增條帶清晰度和亮度最佳,相應(yīng)的可視化染料檢測結(jié)果與凝膠電泳檢測結(jié)果一致。在5 μL LAMP以應(yīng)體系中,BstDNA聚合酶的最適使用量為0.48 U(表2)。

針對靶基因trh,在25、5 μL LAMP以應(yīng)體系中,BstDNA聚合酶最適使用量分別為0.32、0.48 U(表2)。

2.1.5 以應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

針對靶基因tdh,在25 μL以應(yīng)體系中,當(dāng)以應(yīng)時(shí)間為50~70 min時(shí),在瓊脂糖凝膠電泳圖譜中出現(xiàn)較為清晰的階梯狀DNA擴(kuò)增條帶,相應(yīng)的可視化染料檢測結(jié)果與凝膠電泳檢測結(jié)果一致。同樣,在5 μL LAMP以應(yīng)體系中,最適以應(yīng)時(shí)間為60 min。針對trh靶基因,在25、5 μL以應(yīng)體系中最適以應(yīng)時(shí)間均為60 min(表2)。

2.1.6 以應(yīng)溫度的優(yōu)化

其次,有的學(xué)生做題時(shí)一旦遇到疑惑,便馬上翻開書本查找,這樣容易形成一種心理暗示,沒復(fù)習(xí)好不要緊,反正待會(huì)兒做的時(shí)候看書就可以了。在這種情況下,事先進(jìn)行的復(fù)習(xí)也不過是走走形式而已,所以,做題要一氣呵成,如果確實(shí)遇到了難以解決的問題,先不要急著翻書,而是等著這部分練習(xí)全部做完后,再去查找、補(bǔ)查復(fù)習(xí)不到位的地方。這樣,就能借助練習(xí)找到自己的弱點(diǎn),進(jìn)行有針對性的復(fù)習(xí),補(bǔ)足知識(shí)上的缺陷。

針對靶基因tdh,考察以應(yīng)溫度(59~67 ℃)對LAMP以應(yīng)體系的影響。在25 μL LAMP以應(yīng)體系中,當(dāng)以應(yīng)溫度為65 ℃時(shí),在瓊脂糖凝膠電泳圖譜中出現(xiàn)階梯狀DNA擴(kuò)增條帶清晰度和亮度最佳,相應(yīng)的可視化染料檢測結(jié)果與凝膠電泳檢測結(jié)果一致。在5 μL LAMP以應(yīng)體系中最適以應(yīng)溫度也為65 ℃。針對靶基因trh,在25、5 μL LAMP以應(yīng)體系中最適以應(yīng)溫度均為65 ℃(表2)。

2.2 cLAMP以應(yīng)體系的建立

圖3 副溶血性弧菌ATCC17802及ATCC33847菌株的cLAMP檢測結(jié)果Fig. 3 cLAMP analysis of V. parahaemolyticus ATCC 17802 and ATCC 33847

根據(jù)優(yōu)化的5 μL LAMP以應(yīng)體系,以毛細(xì)管為以應(yīng)載體,以副溶血性弧菌ATCC33847、ATCC17802菌株的基因組DNA為模板,cLAMP可視化染料的檢測結(jié)果如圖3所示。含有tdh、trh基因的第1、第3根毛細(xì)管均顯色為綠色,呈現(xiàn)陽性以應(yīng);陰性對照顯色為橘色或無色(第2、4號(hào)毛細(xì)管)。結(jié)果表明,本研究建立的微量cLAMP以應(yīng)體系(5 μL)能夠正確擴(kuò)增目標(biāo)基因tdh、trh。

2.3 cLAMP方法的特異性

分別以副溶血性弧菌ATCC33847、ATCC17802、CHN25菌株,以及6 種常見致病菌基因組DNA為模板,分析cLAMP的特異性,結(jié)果如圖4所示。針對靶基因tdh,僅副溶血性弧菌ATCC33847菌株的以應(yīng)毛細(xì)管顯色為綠色(圖4E,毛細(xì)管9),且在相應(yīng)的瓊脂糖凝膠電泳中檢測到階梯狀DNA條帶(圖4B、D,泳道9),呈現(xiàn)陽性以應(yīng);而副溶血性弧菌ATCC17802、CHN25菌株,以及嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌菌株的以應(yīng)毛細(xì)管均顯色為橘色或無色(圖4E,毛細(xì)管1~8、10),呈現(xiàn)陰性以應(yīng),相應(yīng)的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果與可視化染料檢測結(jié)果一致(圖4B、D,泳道1~8、10)。針對trh基因,分析結(jié)果顯示,僅副溶血性弧菌ATCC17802菌株的以應(yīng)毛細(xì)管顯色為綠色(圖4J,毛細(xì)管9),且在對應(yīng)的瓊脂糖凝膠電泳中檢測到階梯狀DNA條帶,呈現(xiàn)陽性以應(yīng);而不含有trh基因的毛細(xì)管均顯色為橘色或無色,且相應(yīng)地?zé)o特異性DNA條帶產(chǎn)生。研究表明,針對靶基因tdh和trh的LAMP引物具有高度特異性,對副溶血性弧菌非毒力菌株,以及其他6 種常見的致病菌均不產(chǎn)生交叉以應(yīng)。

圖4 cLAMP方法檢測靶基因tdh和trh的特異性Fig. 4 Specificity of the cLAMP assay for the tdh and trh genes

2.4 cLAMP方法的靈敏度

2.4.1 檢測副溶血性弧菌基因組DNA

圖5 cLAMP方法檢測基因組DNA靶基因的靈敏度Fig. 5 Sensitivity of the cLAMP assay for genomic DNA

針對靶基因tdh,以副溶血性弧菌ATCC33847基因組DNA為模板,在cLAMP以應(yīng)體系中加入DNA模板的質(zhì)量濃度為3×102~3×10-7ng/μL,研究結(jié)果顯示,cLAMP的最低檢測限為3 fg/μL(圖5E),與25 μL(圖5A、B)及5 μL(圖5C、D)LAMP以應(yīng)體系檢測限一致,是普通PCR方法(圖5F)最低檢測限(3 pg/μL)的1/1 000。

由圖5可以看出,針對靶基因trh,以副溶血性弧菌ATCC17802基因組DNA為模板,在cLAMP以應(yīng)體系中加入DNA模板質(zhì)量濃度為3.4×102~3.4×10-7ng/μL,cLAMP最低檢測限為34 fg/μL,是普通PCR方法(圖5L)最低檢測限(34 pg/μL)的1/1 000。

2.4.2 檢測副溶血性弧菌純培養(yǎng)物

圖6 cLAMP方法檢測純培養(yǎng)物的靈敏度Fig. 6 Sensitivity of the cLAMP assay for bacterial culture

從圖6可以看出,針對靶基因tdh和trh,分別以副溶血性弧菌ATCC33847、ATCC17802菌株純培養(yǎng)物為模板,cLAMP方法最低檢測限分別為9.85×103、8.25×105CFU/mL,與25、5 μL LAMP以應(yīng)體系的檢測限一致,分別是常規(guī)PCR檢測方法最低檢測限(9.85×105、8.25×106CFU/mL)的1/100和1/10。

3 討 論

副溶血性弧菌引起的食物中毒事件位居我國沿海地區(qū)微生物性食物中毒事件的首位,且逐年呈上升趨勢[19-20]。近年來,國內(nèi)外有大量研究報(bào)道涉及水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的污染,如比目魚(Pleuronectiformes)、牡蠣(Ostrea gigas thunberg)、貽貝(Mytilus edulis)、羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)、藍(lán)蟹(Callinectes sapidus)等水產(chǎn)品中均檢出副溶血性弧菌污染[21-27]。傳統(tǒng)的微生物學(xué)方法和常規(guī)PCR技術(shù)成熟,但是存在耗時(shí)耗力,需要專門的儀器設(shè)備等不足之處。LAMP是一種新型核酸體外擴(kuò)增技術(shù),但是其檢測成本較高,LAMP以應(yīng)中的BstDNA聚合酶價(jià)格相對昂貴。本研究針對副溶血性弧菌毒力靶基因tdh和trh,建立了微量(5 μL)cLAMP檢測方法,檢測成本縮減至常規(guī)LAMP方法的五分之一。

LAMP以應(yīng)通常受多個(gè)因素影響,如Mg2+濃度、BstDNA聚合酶使用量、dNTPs濃度、以應(yīng)時(shí)間、以應(yīng)溫度等。本研究針對tdh和trh基因,分別設(shè)計(jì)了6 條特異性引物,并對以應(yīng)體系中上述各因素分別進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化,確定微量LAMP以應(yīng)體系(5 μL)中各因素最適條件分別為:6 mmol/L(tdh)或8 mmol/L(trh)Mg2+、1.44 mmol/L(tdh)或1.28 mmol/L(trh)dNTPs、0.48 UBstDNA聚合酶、以應(yīng)溫度65 ℃、以應(yīng)時(shí)間60 min。針對tdh、trh靶基因,本研究建立的cLAMP方法檢測副溶血性弧菌基因組DNA的最低檢測限分別為3、34 fg/μL;檢測純培養(yǎng)物的最低檢測限分別為9.85×103、8.25×105CFU/mL。吳家林等[28]對副溶血性弧菌tdh基因的LAMP檢測靈敏度為101CFU/ml;張?jiān)柒萚29]建立的三重PCR方法檢測致病性副溶血性弧菌的靈敏度為102CFU/PCR以應(yīng)。這些研究報(bào)道的檢測限均低于本研究方法對副溶血性弧菌純培養(yǎng)物的檢測。

鈣黃綠素需要通過與錳離子結(jié)合實(shí)現(xiàn)通過以應(yīng)混合液顏色變化的判讀[30],因此,鈣黃綠素與錳離子濃度的配比至關(guān)重要,直接影響最終判讀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。探索開發(fā)陰性、陽性顏色差異大,易于區(qū)分的染料更適于本研究建立的cLAMP檢測方法。

4 結(jié) 論

針對副溶血性弧菌主要毒素編碼基因tdh和trh,本研究設(shè)計(jì)了特異性LAMP檢測引物;系統(tǒng)優(yōu)化了微量LAMP以應(yīng)體系(5 μL)中各因素的最適以應(yīng)條件:6 mmol/L或8 mmol/L Mg2+、1.44 mmol/L或1.28 mmol/L dNTPs、0.48 UBstDNA聚合酶、內(nèi)外引物比8∶1、以應(yīng)溫度65 ℃、以應(yīng)時(shí)間60 min;建立了微量(5 μL)、特異性高、靈敏度強(qiáng)、低成本、可視化的快速檢測副溶血性弧菌產(chǎn)毒株的cLAMP方法,基因組DNA的最低檢測限分別為3、34 fg/μL,純培養(yǎng)物的最低檢測限分別為9.85×103、8.25×105CFU/mL。本研究結(jié)果為副溶血性弧菌產(chǎn)毒株微量、可視化檢測試劑盒的研發(fā)提供了技術(shù)支撐。

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