趙燕，金俊杰，任敏敏，侯鳳香，劉素貞，薛成俊，肖英平*

（1.溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院動(dòng)物科學(xué)研究所，浙江 溫州 325000；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，杭州 310021；3.蒼南縣畜牧獸醫(yī)局，浙江 蒼南 325800）

我國(guó)傳統(tǒng)的水禽養(yǎng)殖模式主要是大水面放養(yǎng)或者是水面圈養(yǎng)，這不僅對(duì)水資源造成嚴(yán)重的污染和破壞，也使水禽產(chǎn)業(yè)自身的發(fā)展受到水資源承載力的約束，同時(shí)也給食品安全管控帶來(lái)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[1]。因此，近年來(lái)我國(guó)的水禽養(yǎng)殖逐漸轉(zhuǎn)變成了以旱養(yǎng)為主的養(yǎng)殖模式。目前，蛋鴨飼養(yǎng)以蛋鴨舍內(nèi)地面加水域圈養(yǎng)、網(wǎng)床飼養(yǎng)和籠養(yǎng)等多種養(yǎng)殖模式并存，飼養(yǎng)水平參差不齊，疫病發(fā)生情況也存在一定的差異[2]。

大腸埃希菌（Escherichia coli）是革蘭氏陰性菌，屬于腸桿菌科埃希菌屬，是在人和動(dòng)物腸道中大量分布的一種細(xì)菌。鴨大腸埃希菌病是由致病性大腸埃希菌引起的感染性疾病，其主要發(fā)病特征為心包炎、肝周炎和急性敗血癥等。由于大腸埃希菌種類繁多，交叉保護(hù)性差，血清型較復(fù)雜，給免疫防治帶來(lái)一定的困難，因此，藥物防治是目前控制該病的主要手段[3]。但隨著藥物大量和不合理的使用，加快了大腸埃希菌耐藥性的產(chǎn)生[4-5]，不僅影響抗菌藥物在獸醫(yī)臨床上的療效，而且其耐藥基因可通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，對(duì)人類的健康安全造成威脅。

目前，對(duì)于水禽中大腸埃希菌的研究主要集中于從病料中分離獲得大腸埃希菌，開展其致病性和耐藥性研究[6-8]，而對(duì)于從不同養(yǎng)殖模式下健康鴨群體中獲得大腸埃希菌，分析其耐藥情況的研究甚少。基于此，本文分析比較了在水養(yǎng)與旱養(yǎng)條件下蛋鴨腸道大腸埃希菌的耐藥特征，探討了其耐藥基因多態(tài)性和遺傳多樣性，以期為耐藥菌株流行病學(xué)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

大腸埃希菌分離培養(yǎng)基：緩沖蛋白胨水（buffered peptone water,BPW）、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、LB瓊脂和肉湯（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）。大腸埃希菌鑒定卡和藥敏卡（法國(guó)梅里埃公司）。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）試劑［生工生物工程（上海）股份有限公司］。

烘箱、恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；－80℃超低溫冰箱（美國(guó)Thermo公司）；VITEK 2 COMPACT全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)（法國(guó)梅里埃公司）。

1.2 樣品采集與菌株分離鑒定

在浙江省溫州地區(qū)分別選擇3家網(wǎng)床水面圈養(yǎng)和3家網(wǎng)床全旱養(yǎng)的蛋鴨場(chǎng)，飼養(yǎng)規(guī)模均為5 000只左右，蛋鴨為250～300日齡紹興麻鴨，自由飲水和采食。全旱養(yǎng)蛋鴨飲用相對(duì)流動(dòng)的自來(lái)水，水面圈養(yǎng)蛋鴨飲用游泳池水，其中游泳池水按夏天3～5 d、冬天7～9 d更換一次。依據(jù)當(dāng)?shù)匦⌒宛B(yǎng)殖場(chǎng)的飼養(yǎng)習(xí)慣和經(jīng)驗(yàn)，水面圈養(yǎng)蛋鴨通常在產(chǎn)蛋量下降時(shí)使用藥物，而全旱養(yǎng)蛋鴨通常每月用藥一次，用藥方式均為拌料飼喂，常用藥物為阿莫西林（β-內(nèi)酰胺類抗生素）。

從每個(gè)鴨場(chǎng)選取10只蛋鴨，用棉拭子采集其直腸中的微生物，置于滅菌的BPW前增菌液中，參照GB 4789.6—2016[9]的方法，分離大腸埃希菌。采用VITEK 2 COMPACT全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀器對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.3 耐藥譜測(cè)定

大腸埃希菌的耐藥譜采用VITEK 2 COMPACT全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定。

1.4 基因組DNA提取

采用煮沸法[10]提取大腸埃希菌基因組DNA，用于PCR反應(yīng)。

1.5 毒力基因檢測(cè)

以提取的大腸埃希菌基因組DNA為模板，采用GB 4789.6—2016[9]中大腸埃希菌緊密黏附素基因（gene encoding intimin for attaching and effacingEscherichia coli,eae）、侵襲性質(zhì)?？乖璈基因（invasive plasmid antigen H-gene,ipa H）、侵襲性質(zhì)粒調(diào)節(jié)基因（invasive plasmid regulator,invE）、熱不穩(wěn)定性腸毒素基因（heat-labile enterotoxin,lt）、集聚黏附菌毛調(diào)節(jié)基因（aggregative adhesive fimbriae regulator,aggR）、腸定殖因子基因（protein involved in intestinal colonization,pic）等毒力基因的引物序列（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共32個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察擴(kuò)增結(jié)果。

表1 毒力基因引物信息Table 1 Information of virulence gene primers

1.6 耐藥基因檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)從9類抗生素耐藥基因中共選取23種，包括2種磺胺類基因（sulⅠ和sulⅡ），5種喹諾酮類基因（qnrA、qnrD、qnrS、qepA和oqxB），4種四環(huán)素類基因（tetC、tetB、tetK和tetA），3種氯霉素類基因（cmlA、floR和cfr），3種大環(huán)內(nèi)酯類基因（ereA、ermB和mef），2種青霉素類基因（mecA和mecC），1種氨基糖苷類基因（aadA1），3種多黏菌素類基因（pmrA、pmrB和mcr-1）。所用引物信息[11]見表2。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共32個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并成像。

針對(duì)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrumβ-lactamases,ESBLs）的大腸埃希菌，特異性地進(jìn)行β-內(nèi)酰胺酶基因分析。參照文獻(xiàn)[12]設(shè)計(jì)引物，具體引物信息見表3。

1.7 Ⅰ型整合酶基因和Ⅰ型整合子基因盒檢測(cè)

以大腸埃希菌基因組DNA為模板，參照文獻(xiàn)[6]所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增：Ⅰ型整合酶基因（Intl）引物為5′-CCTCCCGCACGATGATC-3′和5′-TCCACGCATCGTCAGGC-3′；Ⅰ型整合子基因盒引物為 5′-GGCATCCAAGCAGCAAG-3′和 5′-AAGCAGACTTGACCTGA-3′。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃（Intl）或55℃（Ⅰ型整合子基因盒）退火30 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后，72℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表2 耐藥基因引物信息Table 2 Information of drug-resistant gene primers

基因盒插入?yún)^(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后，用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒回收純化，然后連接到pMD18-T載體上并轉(zhuǎn)入到感受態(tài)細(xì)胞中，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)在線網(wǎng)站NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）的Blast搜索進(jìn)行比對(duì)分析。

表3 β-內(nèi)酰胺酶基因引物信息Table 3 Information of β-lactamase gene primers

2 結(jié)果與分析

2.1 毒力基因分析

圖1為以毒力基因eae為代表的電泳結(jié)果。在檢測(cè)的6個(gè)毒力基因中，毒力基因eae、ipa H、pic在網(wǎng)床水面圈養(yǎng)和網(wǎng)床全旱養(yǎng)蛋鴨腸道大腸埃希菌中均有攜帶，檢出率較高的是eae和pic，二者在網(wǎng)床水面圈養(yǎng)和網(wǎng)床全旱養(yǎng)蛋鴨腸道大腸埃希菌的檢出率分別為6.67%、10.00%和6.67%、16.67%（圖2）。其中，網(wǎng)床全旱養(yǎng)蛋鴨腸道的大腸埃希菌毒力基因eae、ipa H、invE、aggR和pic檢出率均高于網(wǎng)床水面圈養(yǎng)蛋鴨，以pic為最高。

圖1 eae毒力基因的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoretogram of PCR products of eae gene

圖2 大腸埃希菌的毒力基因檢出率Fig.2 Detection percentage of virulence genes in E.coli

2.2 大腸埃希菌耐藥表型分析

通過(guò)VITEK 2 COMPACT全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)對(duì)蛋鴨腸道大腸埃希菌進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌對(duì)抗生素表現(xiàn)出不同程度的耐藥，特別是對(duì)青霉素類、頭孢菌素類、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類和磺胺類抗生素。不同養(yǎng)殖模式下蛋鴨腸道大腸埃希菌的耐藥性呈現(xiàn)一定的差異，總體表現(xiàn)為網(wǎng)床全旱養(yǎng)的蛋鴨分離株耐藥性強(qiáng)于網(wǎng)床水面圈養(yǎng)，主要體現(xiàn)于氨芐西林（網(wǎng)床全旱養(yǎng)，80%；網(wǎng)床水面圈養(yǎng)，56.67%）、環(huán)丙沙星（23.33%，6.67%）、頭孢唑啉（20%，10%）、頭孢曲松（16.67%，6.67%）、氨曲南（16.67%，6.67%）、左旋氧氟沙星（16.67%，3.33%）、頭孢匹美（6.67%，0）、慶大霉素（3.33%，0）和復(fù)方新諾明（36.67%，23.33%）。

2種不同養(yǎng)殖模式下蛋鴨大腸埃希菌多重耐藥現(xiàn)象普遍存在，其中：在網(wǎng)床全旱養(yǎng)蛋鴨腸道中分離的大腸埃希菌耐藥種類較多，耐藥性更為復(fù)雜，同時(shí)耐藥數(shù)≥3的菌株比例為23.33%；而在網(wǎng)床水面圈養(yǎng)蛋鴨腸道中分離的大腸埃希菌耐藥數(shù)≥3的菌株比例為10.00%（圖3）。

2.3 耐藥基因分析

對(duì)23種耐藥基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，蛋鴨中大腸埃希菌磺胺類藥物耐藥基因sulⅠ和sulⅡ、喹諾酮類基因qnrA和qnrS、四環(huán)素類基因tetA及氨基糖苷類基因aadA1檢出率較高，在網(wǎng)床水面圈養(yǎng)和網(wǎng)床全旱養(yǎng)蛋鴨中均在20%以上（圖4）。比較分析2種養(yǎng)殖模式下耐藥基因的總體檢出率發(fā)現(xiàn)，網(wǎng)床全旱養(yǎng)總體上高于網(wǎng)床水面圈養(yǎng)。

2.4 β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因分析

圖3 網(wǎng)床水面圈養(yǎng)和網(wǎng)床全旱養(yǎng)蛋鴨中大腸埃希菌耐藥菌株分布情況Fig.3 Drug-resistant strains of E.coli in laying ducks under net bed with pool and net bed dry-system

在分離的60株蛋鴨腸道大腸埃希菌中，7株產(chǎn)ESBLs，包括網(wǎng)床水面圈養(yǎng)蛋鴨2株，網(wǎng)床全旱養(yǎng)蛋鴨5株。為了進(jìn)一步分析其耐藥基因攜帶情況，對(duì)所有產(chǎn)ESBLs分離株的β-內(nèi)酰胺耐藥基因進(jìn)行PCR檢測(cè)。圖5為部分耐藥基因CTX-M的電泳結(jié)果。從圖6可以看出：TEM和CTX-M耐藥基因的檢出率均為100%（7/7），CTX-M-1、CTX-M-2和CTX-M-9檢出率分別為57.14%（4/7）、14.29%（1/7）和71.43%（5/7），未檢出SHV、CTX-M-8和CTX-M-25。

2.5 Ⅰ型整合子和基因盒分析

在60株大腸埃希菌中，10株含有Ⅰ型整合子，陽(yáng)性檢出率為16.67%，其中網(wǎng)床全旱養(yǎng)蛋鴨腸道大腸埃希菌Ⅰ型整合子檢出率為23.33%，高于網(wǎng)床水面圈養(yǎng)（10.00%）（圖7）。

圖4 網(wǎng)床水面圈養(yǎng)和網(wǎng)床全旱養(yǎng)蛋鴨中大腸埃希菌耐藥基因檢出率Fig.4 Detection percentage of drug-resistant genes of E.coli in laying duck under the net bed with pool and net bed dry-system

圖5 CTX-M耐藥基因的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.5 Electrophoretogram of PCR products of CTX-M gene

圖6 ESBLs陽(yáng)性大腸埃希菌β-內(nèi)酰胺酶基因檢出率Fig.6 Detection percentage of β-lactamase drug-resistant genes in ESBLs-positive E.coli

圖7 大腸埃希菌的Ⅰ型整合子檢出率Fig.7 Detection percentage of classⅠintegron in E.coli

對(duì)10株Ⅰ型整合子陽(yáng)性大腸埃希菌基因盒擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析發(fā)現(xiàn)，4株攜帶基因盒插入片段，其中：1株來(lái)源于網(wǎng)床水面圈養(yǎng)蛋鴨，其大腸埃希菌Ⅰ型整合子基因盒插入的為dfrA12-aadA2；3株來(lái)源于網(wǎng)床全旱養(yǎng)蛋鴨，均為dfrA1-aadA1。

3 討論

通過(guò)蛋鴨腸道大腸埃希菌的毒力基因分析發(fā)現(xiàn)，水面圈養(yǎng)的毒力基因eae攜帶率為6.67%、全旱養(yǎng)為10.00%。定殖因子pic使大腸埃希菌粘附于宿主腸黏膜而不被腸蠕動(dòng)和腸分泌液所清除，是大腸埃希菌致病的首要因素[13]。本研究中網(wǎng)床全旱養(yǎng)蛋鴨腸道大腸埃希菌腸定殖因子基因pic攜帶率為16.67%，說(shuō)明蛋鴨攜帶的大腸埃希菌具有一定的潛在致病性。

本研究對(duì)2種不同養(yǎng)殖模式下分離的60株蛋鴨腸道大腸埃希菌的耐藥表型分析表明，分離株對(duì)氨芐西林、復(fù)方新諾明和環(huán)丙沙星的耐藥率較高，而對(duì)頭孢西丁、亞氨培南和阿米卡星等抗生素敏感。這些結(jié)果與SOUFI等[14]從突尼斯家禽肉中分離出來(lái)的大腸埃希菌耐藥表型一致。而鄧伯雄等[15]對(duì)鴨致病性大腸埃希菌耐藥研究表明，較為敏感的環(huán)丙沙星和左旋氧氟沙星可以選擇作為鴨場(chǎng)的首選藥物，本結(jié)果與其相反，可能與養(yǎng)殖過(guò)程中使用的藥物情況有關(guān)。綜合比較網(wǎng)床水面圈養(yǎng)和網(wǎng)床全旱養(yǎng)蛋鴨大腸埃希菌耐藥表型和耐藥基因發(fā)現(xiàn)，網(wǎng)床全旱養(yǎng)蛋鴨大腸埃希菌的耐藥性和耐藥基因的檢出率均高于網(wǎng)床水面圈養(yǎng)。通過(guò)對(duì)2種養(yǎng)殖場(chǎng)的調(diào)研分析發(fā)現(xiàn)，確實(shí)存在網(wǎng)床全旱養(yǎng)用藥量和用藥種類多于網(wǎng)床水面圈養(yǎng)的情況，因?yàn)橹行○B(yǎng)殖戶認(rèn)為，蛋鴨需要生活在水中，如果養(yǎng)殖過(guò)程中缺少水面，易導(dǎo)致蛋鴨生病，故盲目地增加了藥物的使用量和種類。

對(duì)鴨源大腸埃希菌的多重耐藥性分析表明，在本試驗(yàn)中網(wǎng)床全旱養(yǎng)蛋鴨腸道中分離的大腸埃希菌耐藥數(shù)≥3的菌株比例為23.33%，而網(wǎng)床水面圈養(yǎng)蛋鴨腸道中分離的大腸埃希菌耐藥數(shù)≥3的菌株比例為10.00%，顯著低于從鴨病料中分離的大腸埃希菌的耐藥數(shù)[6-9]。

ESBLs是一類能水解青霉素類、頭孢菌素類及單環(huán)類抗生素的β-內(nèi)酰胺酶，其活性能被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑抑制，能產(chǎn)生ESBLs的細(xì)菌，可對(duì)上述多種抗生素產(chǎn)生耐藥性。產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌在法國(guó)、加拿大和日本等國(guó)家均有報(bào)道，尤其是CTX-M型ESBLs傳播較快[16-18]。本試驗(yàn)檢測(cè)出的β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因主要是CTX-M型，包括CTX-M、CTXM-1、CTX-M-2、CTX-M-9；水養(yǎng)和旱養(yǎng)蛋鴨 產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌陽(yáng)性率為11.67%，低于吳華等[19]對(duì)國(guó)內(nèi)7個(gè)省份臨床分離的32株鴨大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs的檢出率（21.87%）和劉保光等[20]分離的12株鴨大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs的檢出率（33%）。

大腸埃希菌的耐藥機(jī)制主要是獲得性耐藥，而獲得性耐藥的大腸埃希菌通常借助于整合子、轉(zhuǎn)座子和質(zhì)粒等可移動(dòng)元件進(jìn)行耐藥基因的傳播[21]。整合子為運(yùn)動(dòng)性的DNA分子，位于染色體和質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子等可移動(dòng)元件上，可以通過(guò)整合酶捕獲或者整合耐藥基因和介導(dǎo)多重耐藥的形成[6]。大腸埃希菌中最常見的是Ⅰ型整合子[22]，因此本研究著重分析了Ⅰ型整合子的攜帶狀況，發(fā)現(xiàn)蛋鴨腸道大腸埃希菌Ⅰ型整合子陽(yáng)性率為16.67%，但網(wǎng)床全旱養(yǎng)蛋鴨大腸埃希菌Ⅰ型整合子陽(yáng)性率為23.33%，高于網(wǎng)床水面圈養(yǎng)的陽(yáng)性率（10.00%）。4株Ⅰ型整合子陽(yáng)性大腸埃希菌含有基因盒，分別為dfrA1-aadA1和dfrA12-aadA2。dfrA編碼二氫葉酸還原酶，該酶能競(jìng)爭(zhēng)性抑制磺胺類藥物，使細(xì)菌對(duì)磺胺類藥物耐藥[6]；aadA編碼氨基糖苷腺苷酸轉(zhuǎn)移酶，對(duì)氨基糖苷類藥物關(guān)鍵位點(diǎn)具有化學(xué)修飾作用，阻斷了藥物與細(xì)菌16S rRNA結(jié)合，使細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類藥物產(chǎn)生耐藥性。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，網(wǎng)床全旱養(yǎng)蛋鴨腸道大腸埃希菌的毒力基因攜帶率、耐藥性表型及耐藥基因攜帶率均高于網(wǎng)床水面圈養(yǎng)蛋鴨，表明不同養(yǎng)殖模式的用藥情況差異會(huì)對(duì)蛋鴨腸道微生物耐藥性產(chǎn)生一定的影響。