潘家鈺 康剛勁 徐曼華 彭正虹 申苑莎

年齡相關(guān)性白內(nèi)障(age related cataract,ARC)已經(jīng)成為中老年群體視力損傷的常見疾病，據(jù)報道，ARC的發(fā)病與人晶狀體上皮細(xì)胞(human lens epithelial cells,HLECs)的氧化損傷和細(xì)胞凋亡有關(guān)。早期已有研究者發(fā)現(xiàn)白內(nèi)障的發(fā)病率在不同性別患者中存在著顯著差異[1]，一定濃度的雌激素能有效抑制HLECs凋亡并發(fā)揮其抗氧化功能[2]。

Sirtuins是一種高度保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸家族-依賴性組蛋白去乙?；福聊畔⒄{(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)是該家族中的成員之一,它被視為多種生物壽命的“調(diào)控因子”[3]。SIRT1的上調(diào)已被證明對各種眼部疾病，如白內(nèi)障、視網(wǎng)膜變性、視神經(jīng)炎和葡萄膜炎，具有重要的保護(hù)作用[4]，它主要通過底物組蛋白/非組蛋白的去乙?；l(fā)揮作用[5]。目前，雌激素作用于HLECs的抗凋亡機(jī)制尚無定論，其是否通過影響SIRT1/P53(腫瘤抑制蛋白)通路來實現(xiàn)抗凋亡作用在HLECs中的報道尚少。本研究通過H2O2誘導(dǎo)HLE-B3細(xì)胞氧化損傷，探討生理濃度下雌二醇(estradiol,E2)對HLE-B3細(xì)胞的作用機(jī)制，為進(jìn)一步防治ARC的發(fā)生發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料HLE-B3細(xì)胞系(ATCC，美國)，E2粉末、H2O2試劑(Sigma，美國)，DMEM高糖培養(yǎng)基(HyClone，美國)，胎牛血清、CCK-8試劑盒(Dojindo,中國)，AnnexinV FITC/PI流式細(xì)胞檢測試劑盒(BD公司，美國)，RNA提取試劑盒(Tiangen，中國)，BCA法蛋白定量試劑盒(上海碧云天公司)，PCR試劑盒(Qiagen，德國)，SIRT1、P53、乙酰化P53(acetylate P53，Ac-P53)、GAPDH抗體(Abcam，英國)。

1.2 方法

1.2.1 HLE-B3細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)將保存于-80 ℃冰箱中的HLE-B3細(xì)胞取出，立即放于37 ℃溫水浴中，待完全融化后離心取細(xì)胞懸液，置于含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，按13比例進(jìn)行傳代，每3 d傳代一次。待細(xì)胞生長穩(wěn)定后，計數(shù)鋪板，根據(jù)實驗條件加入相應(yīng)試劑進(jìn)行實驗。

1.2.2 HLE-B3氧化損傷模型中鑒定H2O2最佳濃度取生長狀態(tài)良好的HLE-B3細(xì)胞，待其生長至75%～80%，棄原有培養(yǎng)基，加入胰蛋白酶消化后重懸，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。每孔細(xì)胞取500×103個，每組設(shè)置3個復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁，分別加入不同濃度(50 μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1、400 μmol·L-1)H2O2，CCK-8試劑盒測量每組細(xì)胞增殖率，流式細(xì)胞學(xué)檢測每組細(xì)胞凋亡率。

1.2.3 實驗分組將HLE-B3細(xì)胞接種于6孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)量約500×103個，并隨機(jī)分成5組，空白對照組：含胎牛血清的DMEM改良式培養(yǎng)基培養(yǎng)HLE-B3細(xì)胞；模型組：予以含100 μmol·L-1H2O2的培養(yǎng)基作用細(xì)胞12 h；低、中、高濃度E2組：分別予以0.01 μmol·L-1、0.10 μmol·L-1、1.00 μmol·L-1E2處理后，再加入含100 μmol·L-1H2O2的培養(yǎng)基，放入含體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(分組依據(jù)參考文獻(xiàn)[6])。

1.2.4 CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活力于96孔板中接種HLE-B3細(xì)胞，每孔10×103個，根據(jù)實驗分組條件培養(yǎng)24 h，每組設(shè)置3個復(fù)孔，每孔加入CCK-8試劑10 μL，作用1.5 h，置于分光光度儀中設(shè)置波長為450 nm，測定每孔的吸光度(A)值，根據(jù)細(xì)胞活力=A處理組/A樣品對照組×100%，計算各組細(xì)胞活力。

1.2.5 流式細(xì)胞學(xué)檢測細(xì)胞凋亡率將HLE-B3細(xì)胞接種于6孔板中 ，每孔調(diào)整細(xì)胞個數(shù)約10×106個，重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液移至離心管內(nèi)，1500 r·min-1離心10 min，棄上清液，加入Loading buffer懸浮細(xì)胞，調(diào)整每組細(xì)胞數(shù)為200×103個 ，按照AnnexinV FITC/PI流式細(xì)胞檢測試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.2.6 RT-qPCR檢測各組SIRT1 mRNA、P53 mRNA表達(dá)用Trizol裂解液裂解細(xì)胞后，按照RNA試劑盒提取細(xì)胞總RNA，于65 ℃水浴箱中變性5 min，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，選取GAPDH基因為內(nèi)參基因進(jìn)行RT-qPCR檢測。SIRT1上游引物：TAGACACGCTGGAACAGGTTG，下游引物：GGTTTCATGATAGCAAGCGG；P53上游引物：GCGCACAGAGGAAGAGAATCT，下游引物：TATGGCGGGAGGTAGACTGAC。擴(kuò)增條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，40個循環(huán)。記錄每組目的基因和內(nèi)參基因的CT值，相對表達(dá)定量(relative quantity,RQ)=2-△△Ct，結(jié)果以RQ統(tǒng)計。

1.2.7 Western blot檢測SIRT1、P53、Ac-P53蛋白的表達(dá)RIPA裂解液裂解細(xì)胞，置于低溫離心機(jī)中，12 000 r·min-1離心5 min,取上清。用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量檢測，每組加入40 μg 總蛋白進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉液室溫孵育1 h；充分洗滌后加入一抗稀釋液4 ℃孵育過夜后磷酸鹽緩沖液(PBS)洗膜，加入二抗稀釋液，室溫孵育30 min,PBS洗滌。結(jié)果用AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的灰度值/GAPDH灰度值(灰度比)。

1.2.8 共聚焦免疫熒光染色于超凈臺中將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至蓋玻片上，培養(yǎng)6 h，PBS洗滌3次，每次5 min;40 g·L-1多聚甲醛固定30 min，加入SIRT1一抗于4 ℃孵育過夜，再用PBS洗滌3次；待干后加入二抗室溫孵育50 min，PBS洗滌，加入抗熒光淬滅劑，封片，共聚焦熒光顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 光學(xué)顯微鏡下觀察HLE-B3細(xì)胞形態(tài)HLE-B3培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)。空白對照組(圖1A)細(xì)胞貼壁生長，呈長梭形、不規(guī)則橢圓形。模型組(圖1B)較空白對照組細(xì)胞密度降低，且可見部分細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)改變，胞體拉長變形，邊界不清。低、中、高濃度E2組細(xì)胞的密度(圖1C、圖1D、圖1E)均高于模型組，且隨E2濃度梯度增加，HLE-B3細(xì)胞生長狀態(tài)呈上升趨勢。

圖1 光學(xué)顯微鏡觀察各組HLE-B3細(xì)胞形態(tài)的變化 A：空白對照組；B：模型組；C：低濃度E2組；D：中濃度E2組；E：高濃度E2組

2.2 E2對HLE-B3細(xì)胞生長活力的影響模型組的細(xì)胞增殖率(63.61%)較空白對照組(100.0%)明顯降低(P<0.05)。低濃度E2組(75.78%)、中濃度E2組(82.30%)、高濃度E2組(98.40%)的細(xì)胞增殖率均高于模型組(均為P<0.05)。低濃度E2組<中濃度E2組<高濃度E2組(均為P<0.05)。

2.3 E2對HLE-B3細(xì)胞的抗凋亡作用流式細(xì)胞學(xué)檢測各組細(xì)胞的凋亡率，空白對照組的HLE-B3凋亡率(3.86±0.04)%低于模型組細(xì)胞凋亡率(15.64±1.18)%(P<0.05)。低、中、高濃度E2組細(xì)胞凋亡率依次為(9.79±0.25)%、(8.88±0.14)%、(6.00±0.47)%。細(xì)胞凋亡率比較顯示，模型組>低濃度E2組>中濃度E2組>高濃度E2組>空白對照組(均為P<0.05)。

2.4 E2對HLE-B3細(xì)胞SIRT1 mRNA、P53 mRNA表達(dá)的影響RT-qPCR檢測各組HLE-B3細(xì)胞中SIRT1、P53mRNA的表達(dá)，模型組細(xì)胞中SIRT1 mRNA(RQ)(2.24±0.05)表達(dá)較空白對照組(1.01±0.02)明顯升高(P<0.05)，SIRT1 mRNA表達(dá)水平模型組(2.24±0.05)<低濃度E2組(2.58±0.11)<中濃度E2組(3.7±0.13)<高濃度E2組(3.88±0.12)(均為P<0.05)?？瞻讓φ战MP53 mRNA(RQ)(1.02±0.04)表達(dá)明顯低于其他各組(均為P<0.05)，模型組(1.73±0.1)、低濃度E2組(1.82±0.16)、中濃度E2組(1.76±0.12)、高濃度E2組(1.74±0.14)組間P53 mRNA表達(dá)水平兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。

2.5 Western blot檢測細(xì)胞中SIRT1、P53、Ac-P53蛋白表達(dá)

2.5.1 Western blot檢測E2對HLE-B3細(xì)胞中SIRT1蛋白表達(dá)的影響SIRT1蛋白表達(dá)(灰度比)在空白對照組(0.040)中呈現(xiàn)弱陽性，SIRT1蛋白表達(dá)組間比較：空白對照組<模型組(0.138)<低濃度E2組(0.250)<中濃度E2組(0.486)<高濃度E2組(0.712)(均為P<0.05)。

2.5.2 Western blot檢測Ac-P53蛋白表達(dá)Ac-P53(灰度比)空白對照組(0.071)表達(dá)與高濃度E2組(0.070)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Ac-P53表達(dá)比較：模型組(0.564)>低濃度E2組(0.317)>中濃度E2組(0.129)>高濃度E2組(均為P<0.05)。

2.5.3 Western blot檢測E2對HLE-B3細(xì)胞中P53蛋白表達(dá)的影響P53(灰度比)在空白對照組(0.394)表達(dá)低于模型組(0.705)和其他各組(均為P<0.05)，組間P53表達(dá)兩兩比較結(jié)果顯示，模型組與各濃度E2組(低濃度E2組灰度比0.718，中濃度E2組灰度比0.710，高濃度E2組灰度比0.705)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。見圖2。

圖2 Western blot檢測各組HLE-B3細(xì)胞SIRT1、Ac-P53、P53蛋白表達(dá)情況 A：空白對照組；B：模型組；C：低濃度E2組；D：中濃度E2組；E：高濃度E2組

2.6 免疫熒光染色檢測SIRT1表達(dá)與定位共聚焦顯微鏡下觀察E2對HLE-B3細(xì)胞中SIRT1免疫熒光的影響，特異性抗體與SIRT1結(jié)合后，在熒光顯微鏡下觀察可呈現(xiàn)綠色熒光(見圖3)，熒光染色著染細(xì)胞核，SIRT1分布于HLE-B3細(xì)胞的細(xì)胞核上，空白對照組(429.30±80.66)熒光強(qiáng)度較模型組(1776.53±285.48)弱(P<0.05)；組間兩兩比較，模型組<低濃度E2組(2541.10±489.43)<中濃度E2組(3400.25±645.86)<高濃度E2組(8442.82±1059.35)(均為P<0.05)。

圖3 免疫熒光檢測各組HLE-B3細(xì)胞SIRT1表達(dá)(×600) A：空白對照組；B：模型組；C：低濃度E2組；D：中濃度E2組；E：高濃度E2組

3 討論

據(jù)預(yù)測，至2050年發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家65歲及以上人口比例將會持續(xù)上升，隨著預(yù)期壽命的增加，衰老的慢性疾病將會越來越普遍[7]。目前白內(nèi)障仍是全球首位致盲性眼病，也是中老年群體視力損傷的常見疾病。ARC是白內(nèi)障中最常見的類型，它易引起致盲與視覺功能障礙，其中HLECs在維持晶狀體透明中起重要作用。本研究予以不同濃度的H2O2作用于HLE-B3細(xì)胞模擬HLECs氧化損傷，CCK-8和流式細(xì)胞學(xué)檢測選出H2O2體外造模最佳濃度為100 μmol·L-1，作用時間為12 h。Wang等[8]用不同濃度H2O2作用于LECs 24 h，濃度在75 μmol·L-1以下時HLE-B3細(xì)胞活力輕微下降，濃度高于75 μmol·L-1時細(xì)胞存活率急劇下降，與本研究H2O2最佳濃度不一致，這可能與不同檢測方法和細(xì)胞培養(yǎng)條件相關(guān)。

已有研究者調(diào)查發(fā)現(xiàn)，月經(jīng)初潮年齡越早、絕經(jīng)年齡越大、絕經(jīng)后使用雌激素替代療法的人群，白內(nèi)障發(fā)病的風(fēng)險會越低[9]。目前，研究雌激素對HLECs的保護(hù)作用主要通過抗氧化損傷和減少細(xì)胞凋亡來實現(xiàn)。Skiljic等[10]通過雌激素作用體外培養(yǎng)HLECs驗證了雌激素通過非基因組機(jī)制介導(dǎo)抗氧化應(yīng)激作用。Ganatra等[11]研究表明，雌激素可抑制山羊LECs骨架蛋白的解聚和細(xì)胞凋亡。王杰等[12]用不同濃度的E2作用體外培養(yǎng)的HLECs，表明E2通過上調(diào)HLECs中的端粒酶活性而抑制細(xì)胞凋亡。Roy等[13]研究表明，雌激素具有雙相效應(yīng)，不同濃度的雌激素對HLECs的作用不盡相同，國內(nèi)外對其作用機(jī)制也尚無定論。本研究參照文獻(xiàn)[6]將E2濃度組設(shè)置為生理狀態(tài)下的濃度梯度(0.01 μmol·L-1、0.10 μmol·L-1、1.00 μmol·L-1)，探討不同濃度E2對HLECs保護(hù)作用及其作用機(jī)制。

SIRT1是依賴性組蛋白去乙?；?，也是Sirtuins家族中的成員之一，有助于調(diào)節(jié)多種生物的壽命。SIRT1具有去乙?；傅淖饔?，可以調(diào)節(jié)許多轉(zhuǎn)錄因子，如P53，叉頭形蛋白O，轉(zhuǎn)錄因子E2F1，核因子κB，過氧化物酶體增殖物受體輔助激活因子1，成肌分化抗原等[14]。有研究表明在癌細(xì)胞中，SIRT1過表達(dá)可以阻斷細(xì)胞的凋亡和衰老，并促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管的生成[15]，體外培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)E2通過雌激素受體α轉(zhuǎn)錄復(fù)合物直接影響促進(jìn)SIRT1表達(dá)[16]。眼部組織中，SIRT1定位于角膜、晶狀體、虹膜、睫狀體和視網(wǎng)膜在內(nèi)的組織細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中[4]，氧化應(yīng)激條件下，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中也存在SIRT1表達(dá)增加及其抗氧化作用[17]。本研究通過共聚焦免疫熒光化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)SIRT1多定位于HLEC細(xì)胞核上，且隨著E2濃度的增加，SIRT1蛋白表達(dá)逐漸增加。P53是一種觸發(fā)細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)，泛素化、磷酸化和乙酰化是P53的翻譯后修飾，它對P53的穩(wěn)定性及活性有重要的影響[18]。乙?；腜53促進(jìn)細(xì)胞凋亡，它已被證明是SIRT1的下游靶點[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著E2濃度增加，SIRT1表達(dá)增加，Ac-P53減少，表明E2在某種程度上促進(jìn)了SIRT1表達(dá)，其發(fā)揮去乙?；饔茫种芇53乙?；柚筆53依賴性的凋亡通路，使細(xì)胞免于凋亡，并且在一定范圍內(nèi)隨著E2濃度的增加，抗凋亡作用越顯著，與王杰等[12]研究結(jié)果一致。Agaoglu等[20]發(fā)現(xiàn)，在ARC患者晶狀體前囊膜及血液中SIRT1的表達(dá)較正常人明顯增加。Xu等[21]在糖尿病性白內(nèi)障大鼠的前囊膜中發(fā)現(xiàn)SIRT1表達(dá)較正常大鼠增加，與本研究SIRT1在模型組中表達(dá)高于空白對照組的結(jié)果相一致，表明SIRT1的表達(dá)水平在白內(nèi)障的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。另外，本研究結(jié)果中P53表達(dá)在模型組，低、中、高濃度E2組間比較無顯著差異，原因可能與其翻譯后修飾的功能性P53相關(guān)，SIRT1使P53去乙?；笠种屏思?xì)胞凋亡程序，降低了細(xì)胞凋亡。E2對HLECs的保護(hù)作用可通過多種途徑實現(xiàn)，其他途徑的存在可能影響本研究結(jié)果的分析，這也是本研究的不足之處，后期仍需進(jìn)一步完善實驗以排除相關(guān)干擾因素的影響。

綜上所述，本研究證明了生理濃度下E2對HLE-B3細(xì)胞的作用為抗凋亡作用，并進(jìn)一步探討了E2可能通過SIRT1/P53通路保護(hù)HLECs免于凋亡。但在HLECs中E2影響SIRT1/P53通路可能存在更多的作用靶點與調(diào)控機(jī)制，目前尚未完全清楚，仍需進(jìn)一步探索。