常艷華，蔡 穎，鄒冰清，陳文凱

胃腺癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，臨床治療多采用手術(shù)切除和術(shù)后輔助化療。胃腺癌易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，給術(shù)后綜合治療帶來了巨大挑戰(zhàn)。研究胃腺癌的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制對提高胃腺癌的治療效果具有重要的意義。

DEK蛋白是一種廣泛存在于有機(jī)體細(xì)胞核內(nèi)可磷酸化的核蛋白[1]，有研究證明，DEK蛋白在胃癌組織中呈高表達(dá)[2]，然而，DEK在胃腺癌發(fā)生、發(fā)展中的功能及其作用機(jī)制尚不清楚。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinases, MMPs)的重要成員，可以破壞和裂解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[3-4]。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法檢測DEK與MMP-9蛋白在胃腺癌組織和癌旁正常胃黏膜組織中的表達(dá)，分析DEK和MMP-9蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征之間的關(guān)系，并進(jìn)一步分析DEK和MMP-9表達(dá)的相關(guān)性，進(jìn)而探討DEK與MMP-9蛋白在胃腺癌發(fā)生、進(jìn)展、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料選取2017年1～12月南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市人民醫(yī)院存檔的胃腺癌標(biāo)本238例，男性187例，女性51例，平均年齡65歲。所有病例臨床資料完整，術(shù)前均未接受放、化療及生物學(xué)治療。病例經(jīng)病理證實(shí)，取癌組織蠟塊為胃腺癌組，相應(yīng)的癌旁>5 cm的胃壁組織蠟塊為癌旁組。

1.2 試劑DEK兔抗人多克隆抗體(ab22826)購自英國Abcam公司，MMP-9鼠抗人單克隆抗體(EP127)購自北京中杉金橋生物公司，EnVision試劑盒和DAB顯色劑均購自福州邁新生物公司。

1.3 方法標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚切片，分別行HE染色和免疫組化染色，免疫組化染色采用EnVision兩步法。每批均設(shè)已知陽性切片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 判讀標(biāo)準(zhǔn)DEK蛋白以細(xì)胞核呈棕黃色顆粒為陽性，MMP-9蛋白以細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色顆粒為陽性。判讀采用二級計(jì)分法。(1)按染色強(qiáng)度計(jì)分：不著色為陰性，計(jì)0分；淡黃色為弱陽性，計(jì)1分；金黃色為中等陽性，計(jì)2分；棕黃色為強(qiáng)陽性，計(jì)3分。(2)按陽性細(xì)胞范圍計(jì)分：每張切片于400倍光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞：無陽性細(xì)胞為0分；陽性細(xì)胞數(shù)占1%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；76%～100%為4分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：得分<3分為陰性，≥3分為陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)；DEK與MMP-9的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃腺癌及癌旁正常胃黏膜組織中DEK及MMP-9蛋白的表達(dá)DEK蛋白和MMP-9蛋白陽性均為棕黃色顆粒，DEK定位于細(xì)胞核(圖1)，MMP-9定位于細(xì)胞質(zhì)(圖2)。DEK在胃腺癌組織中的陽性率(75.6%，180/238)高于癌旁正常胃黏膜組織(45.8%，109/238)(χ2=44.400，P<0.001)；MMP-9在胃腺癌組織中的陽性率(73.5%，175/238)高于癌旁正常胃黏膜組織(52.9%，126/238)(χ2=21.697，P<0.001，表1)。

①②

圖1胃腺癌組織中DEK的表達(dá)，EnVision兩步法圖2胃腺癌組織中MMP-9的表達(dá)，EnVision兩步法

表1 胃腺癌及癌旁正常胃黏膜組織中DEK和MMP-9蛋白的表達(dá)

2.2 胃腺癌組織中DEK及MMP-9蛋白表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系DEK及MMP-9表達(dá)與胃腺癌患者性別、年齡均無關(guān)(P>0.05)，與胃腺癌分化程度、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)(P<0.05，表2)。

表2 胃腺癌組織中DEK和MMP-9蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 胃腺癌組織中DEK與MMP-9蛋白表達(dá)的相關(guān)性在胃腺癌組織中DEK與MMP-9蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.813，P<0.05，表3)。

表3 胃腺癌組織中DEK與MMP-9蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性

3 討論

DEK是一個(gè)原癌基因，是一個(gè)高度保守的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色。腫瘤形成前期和腫瘤進(jìn)展時(shí)，其可以通過參與干擾DNA修復(fù)、細(xì)胞分裂，促進(jìn)瘤細(xì)胞生長和自我更新，抑制腫瘤細(xì)胞成熟前的衰老和凋亡，促進(jìn)瘤細(xì)胞增殖[5-7]。

Liu等[8]利用ONGene數(shù)據(jù)庫對DEK基因在多種腫瘤中的突變情況進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌中DEK的突變率高達(dá)34%，DEK在子宮內(nèi)膜、皮膚、胃和肺等的原發(fā)性腫瘤中也有較高的突變率；Gao等[9]發(fā)現(xiàn)，DEK在卵巢癌中有較高的擴(kuò)增率，達(dá)12%。已有研究表明[10]，DEK的高表達(dá)與胃癌患者的不良預(yù)后有關(guān)，然而其機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法檢測238例胃腺癌及癌旁正常胃黏膜標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)DEK陽性定位于細(xì)胞核，其在胃腺癌組織中的陽性率達(dá)75.6%，高于癌旁正常胃黏膜組織(45.8%，P<0.001)，證實(shí)了DEK在胃癌組織中呈高表達(dá)。

Liu等[11]的Meta分析結(jié)果表明，DEK過表達(dá)與人實(shí)體腫瘤的總生存期短有關(guān)。Piao等[12]采用免疫組化和免疫熒光技術(shù)研究了DEK蛋白在胃癌組織中的表達(dá)，結(jié)果提示DEK表達(dá)與腫瘤體積、分化、臨床分期、無瘤生存率和總生存率有關(guān)，認(rèn)為DEK高表達(dá)提示不良預(yù)后。本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DEK蛋白表達(dá)與胃腺癌浸潤深度、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)，與Piao等的報(bào)道一致。

DEK對瘤細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，涉及調(diào)節(jié)染色質(zhì)、轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程的多個(gè)信號通路[12]，關(guān)于DEK表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，目前仍知之甚少。凋亡的細(xì)胞核在磷酸化調(diào)節(jié)和多聚ADP-核糖化作用下，可釋放DEK，并作用于細(xì)胞外基質(zhì)，DEK被細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞攝取，進(jìn)入這些細(xì)胞的胞核，DEK的分泌、攝取介導(dǎo)的瘤細(xì)胞與周圍基質(zhì)的對話，可能是DEK作用于細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的可能機(jī)制[13]。

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移受多種因子調(diào)控，研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外基質(zhì)降解、腫瘤細(xì)胞突破基膜是造成腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移的主要原因?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是降解細(xì)胞外基質(zhì)的最為關(guān)鍵的蛋白水解酶，MMP-9是MMPs家族中重要的基質(zhì)金屬蛋白酶，是一類Zn2+依賴的細(xì)胞外蛋白水解酶，可降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[14-15]。有研究顯示[16]，MMP-9在胃癌組織的陽性率與其臨床分期、分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MMP-9在胃腺癌組織中的陽性率達(dá)73.5%，高于癌旁正常胃黏膜組織(52.9%，P<0.001)，且其表達(dá)與胃腺癌浸潤深度、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)(P<0.05)。本實(shí)驗(yàn)分析了胃腺癌組織中DEK和MMP表達(dá)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)兩者的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.813，P<0.05)，提示兩者在胃腺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中可能起作用。

已有研究證實(shí)，DEK可通過調(diào)節(jié)MMP-9的表達(dá)來影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[17]。DEK高表達(dá)可促進(jìn)子宮頸癌的生成和轉(zhuǎn)移，其作用是通過DEK/p-Ser9-GSK-3β/p-Tyr216-GSK-3β/β-catenin軸實(shí)現(xiàn)的。體外實(shí)驗(yàn)提示，DEK基因沉默后，癌細(xì)胞增殖、浸潤、遷移受抑，β-catenin降解，MMP-9表達(dá)下調(diào)[18]。

聯(lián)合檢測DEK與MMP-9，可能有助于對胃腺癌惡性程度的判定及侵襲轉(zhuǎn)移能力的評估，進(jìn)而為胃腺癌的預(yù)后分析和臨床治療提供有效的依據(jù)。