賴曉琳， 張 剛，黃建軍

(漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系,福建漳州 363000)

0 引言

單寧，又稱為五倍子單寧酸，在自然界中廣泛存在，屬于天然可再生資源，其在醫(yī)藥化工領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景.根據(jù)單寧的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征，可將其分為可水解單寧和縮合單寧.縮合單寧又稱為原花色素，其是一類黃烷醇單體及其聚合體的多酚化合物，具有C6-C3-C6的結(jié)構(gòu)特征[1].目前，縮合單寧的提取主要有水浴浸提[2]、微波輔助[3]、超聲波輔助[4]等方法.超聲波輔助提取能有效縮短提取時(shí)間，提高了提取率，因此受到了研究者的青睞.近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)香蕉葉的研究主要是蛋白的提取，多糖的提取，纖維素的提取，而對(duì)香蕉葉縮合單寧的提取鮮有報(bào)道.

響應(yīng)面優(yōu)化法是一種實(shí)驗(yàn)條件尋優(yōu)的方法，適宜于解決非線性數(shù)據(jù)處理的相關(guān)問(wèn)題.它囊括了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、建模、檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷暮线m性、尋求最佳組合條件等.通過(guò)對(duì)過(guò)程的回歸擬合和響應(yīng)曲面、等高線的繪制、可方便的求出相應(yīng)于各因素水平的響應(yīng)值.在各因素水平響應(yīng)值的基礎(chǔ)上，可以找出預(yù)測(cè)的響應(yīng)最優(yōu)值以及相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件.于正交試驗(yàn)相比其優(yōu)勢(shì)是：在實(shí)驗(yàn)條件尋優(yōu)過(guò)程中，可以連續(xù)的對(duì)實(shí)驗(yàn)的各個(gè)水平進(jìn)行分析，而正交試驗(yàn)只能對(duì)一個(gè)個(gè)孤立的試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析.

本研究以漳州市天寶鎮(zhèn)的香蕉葉為原料提取縮合單寧，并利用響應(yīng)面法優(yōu)化其超聲提取工藝，希望能為香蕉葉資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料試劑

香蕉葉：采于福建省漳州市天寶鎮(zhèn)；兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品：阿拉丁公司；無(wú)水甲醇(南京化學(xué)試劑股份有限公司)、無(wú)水乙醇(南京化學(xué)試劑股份有限公司)、濃鹽酸(南京化學(xué)試劑股份有限公司)、香草醛(阿拉丁公司)均為分析純；水為去離子水.

1.2 儀器與設(shè)備

FA1004電子分析天平(紹興市景邁儀器設(shè)備有限公司)；KEJ-1000超聲波清洗機(jī)功率480 W(張家港科凈)；T6型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司)；BJ-150中藥粉碎機(jī)(德清拜杰)；101-1A立式電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(天津通利信達(dá)).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 香蕉葉粉的制備 取新鮮香蕉葉，用去離子水洗凈，在50 ℃下烘干24 h，粉碎，過(guò)100目篩，干燥避光保存.

1.3.2 香蕉葉中縮合單寧的提取 準(zhǔn)確稱取1.0 g 的香蕉葉粉末，裝入100 mL具塞錐形瓶中，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的條件加入乙醇溶液后，在超聲波清洗器中提取，提取完畢過(guò)濾，濾液作為香蕉葉縮合單寧提取物樣液備用.

1.3.3 縮合單寧的測(cè)定 取0.5 mL香蕉葉縮合單寧提取物，加入3 mL 4 % 香草醛甲醇溶液和1.5 mL濃鹽酸，充分搖勻后在30 ℃水浴中反應(yīng)20 min[5]，在500 nm波長(zhǎng)下用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得縮合單寧質(zhì)量濃度，繼而進(jìn)行香蕉葉縮合單寧的提取量的計(jì)算.

香蕉葉縮合單寧提取量(mg/g)=( V×ρ)/ (ω×1000)

(1)

式 中：V—提取液體積，mL；ρ—待測(cè)樣液中縮合單寧的質(zhì)量濃度，mg·mL-1；ω—香蕉葉粉末的質(zhì)量，g.

圖1 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The Standard Curve of Catechin

1.3.4 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取0.5 mL兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入3 mL 4 %香草醛甲醇溶液和1.5 mL濃鹽酸，充分搖勻后在30 ℃水浴中反應(yīng)20 min[5]，在500 nm波長(zhǎng)下用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y= 2.600 02x+ 0.010 2，R2=0.999 7

1.3.5 單因素實(shí)驗(yàn)

(1)提取時(shí)間對(duì)香蕉葉縮合單寧提取量的影響

以80 %的乙醇為提取劑，液料比30 mL·g-1，超聲波功率50 %，提取時(shí)間分別為10，20，25，30，40 min.測(cè)定香蕉葉縮合單寧的提取量.

(2)乙醇濃度對(duì)香蕉葉縮合單寧提取量的影響

分別以70 %，75 %，80 %，85 %，90 %的乙醇為提取劑，在液料比30 mL·g-1，超聲波功率為50 %的條件下，提取時(shí)間25 min.測(cè)定香蕉葉縮合單寧的提取量.

(3)液料比對(duì)香蕉葉縮合單寧提取量的影響

以85 %的乙醇為提取劑，分別在液料比20，25，30，35，40 mL·g-1，超聲波功率50 %的條件下，提取時(shí)間25 min.測(cè)定香蕉葉縮合單寧的提取量.

(4)超聲功率對(duì)香蕉葉縮合單寧提取量的影響

以80 %的乙醇為提取劑，液料比30 mL·g-1，超聲功率分別為20 %，40 %，50 %，60 %，80 %的條件下，提取時(shí)間30 min.測(cè)定香蕉葉縮合單寧的提取量.

1.3.6 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)方案 以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，選取提取時(shí)間、乙醇濃度、液料比、超聲功率4個(gè)因素，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析方法，因素與水平如表1所示.

表1 因素水平設(shè)計(jì)Tab.1 Design of Factor Level

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 提取時(shí)間的影響Fig.2 The Effect of Extraction Time

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)香蕉葉縮合單寧提取量的影響 如圖2所示，以80% 的乙醇為提取劑，液料比30 mL·g-1，超聲功率50%的條件下，隨著提取時(shí)間的增加，香蕉葉縮合單寧的提取量在25 min內(nèi)逐漸增大，在25 min時(shí)，達(dá)最大值為6.69 mg·g-1，當(dāng)超聲波處理時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)，縮合單寧提取量呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，其原因可能是因?yàn)楫?dāng)提取時(shí)間達(dá)到25 min時(shí)，縮合單寧幾乎完全被提取出來(lái)，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，會(huì)引起縮合單寧的降解和氧化[6]，因此選取25 min為最優(yōu)的提取時(shí)間.

圖3 乙醇濃度的影響Fig.3 The Effect of Ethanol Concentration

2.1.2 乙醇濃度對(duì)香蕉葉縮合單寧提取量的影響 如圖3所示，在液料比30 mL·g-1，超聲波功率為50 %的條件下，提取時(shí)間25 min的條件下，隨著乙醇濃度的增大，縮合單寧的提取量先增大后減小，在85 % 時(shí)達(dá)到最大值，其原因可能是過(guò)高的乙醇濃度，使某些醇溶性、酯溶性雜質(zhì)溶出量增加，與縮合單寧產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性溶出，導(dǎo)致提取量的下降[7],故選擇乙醇的濃度為85 %.

2.1.3 液料比對(duì)香蕉葉縮合單寧提取量的影響 如圖4所示，以85 % 的乙醇為提取劑，超聲波功率50 % 的條件下，超聲波作用25 min的條件下，隨著液料比的增大，縮合單寧的提取量逐漸增大，在液料比為25 mL·g-1時(shí)達(dá)到最大，在增大液料比，提取量反而有所下降.這是因?yàn)橐毫媳仍龃罂稍黾蛹?xì)胞內(nèi)外質(zhì)量濃度差，有利于縮合單寧的提取，但同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)中單位體積提取液超聲能量密度的降低，不利于縮合單寧的提取[8].因此，選擇液料比為25 mL·g-1.

2.1.4 超聲功率對(duì)香蕉葉縮合單寧提取量的影響 如圖5所示，以80% 的乙醇為提取劑，液料比30 mL·g-1，提取時(shí)間30 min的條件下，隨著超聲功率的增大，縮合單寧的提取量逐漸升高，在超聲波功率為50 % 時(shí)，縮合單寧的提取量達(dá)到最大值，之后再升高超聲波的功率，提取率開(kāi)始下降.可能是因?yàn)殡S著功率的增大，超聲波的空化效應(yīng)增強(qiáng)，加速了香蕉葉中縮合單寧的溶出，但功率過(guò)大，會(huì)使溶劑溫度升高且較強(qiáng)的超聲波空化效應(yīng)會(huì)破壞縮合單寧分子的結(jié)構(gòu)，使提取量降低.因此適合的超聲波功率為50 %.

圖4 液料比的影響Fig.4 The Effect of Liquid-solid Ratio圖5 超聲功率的影響Fig.5 The Effect of Ultrasonic Power

2.2 響應(yīng)面分析結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果 以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，根據(jù)Design-Expert 8.0.6的Box-Benhnken中心組合方法設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案，共得29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中24個(gè)為析因點(diǎn)，5個(gè)為中心點(diǎn).香蕉葉縮合單寧提取量為響應(yīng)值，響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 響應(yīng)曲面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 The Experimental Design and Results of Response Surface Analysis

表3 方差分析表Tab.3 The Analysis of Variance Table

2.2.2 回歸方程擬合和方差分析 將表2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，建立回歸模型，得到香蕉葉縮合單寧的提取量(Y)與提取時(shí)間(A)、乙醇濃度(B)、液料比(C)、超聲功率(D)的二次多元回歸方程為：

Y=7.07 + 0.013 A + 0.038 B + 0.59 C + 0.17 D + 0.035 AB + 0.085 AC - 0.010 AD - 0.20 BC + 0.14 BD - 0.015 CD - 0.36 A2- 0.45 B2- 0.48 C2- 0.59 D2

由回歸方程可得出，各因素對(duì)香蕉葉縮合單寧提取量的影響大小順序?yàn)橐毫媳?超聲功率>乙醇濃度>提取時(shí)間.

響應(yīng)曲面各因素的方差結(jié)果見(jiàn)表3，由表3中的數(shù)據(jù)可得，該回歸方程模型的P<0.01模型極顯著，而失擬項(xiàng)不顯著(P=0.088 3 >0.05)，差異不顯著.模型的確定系數(shù)R2=0.994 5，調(diào)整系數(shù)RAdj2= 0.989 1，說(shuō)明建立的模型能夠解釋98.91 % 響應(yīng)值的變化，且有99.45 %來(lái)源于所選變量.除了一次項(xiàng)B，交互項(xiàng)AC影響顯著和一次項(xiàng)A，交互項(xiàng)AB、AD、CD影響不顯著之外，一次項(xiàng)C、D，交互項(xiàng)BC、BD，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2均影響極顯著.

2.2.3 響應(yīng)曲面分析 如圖6-11圖所示，香蕉葉縮合單寧提取量隨提取時(shí)間、乙醇濃度、液料比、超聲功率的增大而增大，達(dá)到各因素中心值后，香蕉葉縮合單寧提取量隨各因素的增大而減小.液料比對(duì)香蕉葉縮合單寧的提取量影響最大，表現(xiàn)為曲面較為陡峭，因此控制好液料比對(duì)于提取效果十分重要.超聲功率對(duì)于香蕉葉縮合單寧的提取量?jī)H次于液料比，再次是乙醇濃度.提取時(shí)間變化幅度平緩，說(shuō)明此因素對(duì)縮合單寧提取量影響較小.比較各圖可知，乙醇濃度與液料比及乙醇濃度與超聲功率的相互作用對(duì)縮合單寧的提取量影響較大，表現(xiàn)為響應(yīng)面圖較陡峭；而提取時(shí)間與乙醇濃度及提取時(shí)間和超聲功率的相互作用對(duì)縮合單寧的提取量影響較小，表現(xiàn)為響應(yīng)曲面較平緩.

圖6 乙醇濃度與提取時(shí)間對(duì)縮合單寧提取量的影響Fig.6 Effect of Ethanol Concentration and Extraction Time on Extraction Capacity of Condensed Tannins圖7 液料比與提取時(shí)間對(duì)縮合單寧提取量的影響Fig.7 Effect of liquid-solid Ratio and Extraction Time on Extraction Capacity of Condensed Tannins圖8 超聲功率與提取時(shí)間對(duì)縮合單寧提取量的影響Fig.8 Effect of Ultrasonic Power and Extraction Time on Extraction Capacity of Condensed Tannins圖9 液料比與乙醇濃度對(duì)縮合單寧提取量的影響Fig.9 Effect of Liquid-solid Ratio and Ethanol Concen-tration on Extraction Capacity of Condensed Tannins圖10 超聲功率與乙醇濃度對(duì)縮合單寧提取量的影響Fig.10 Effect of Ultrasonic Power and Ethanol Concen-tration on Extraction Capacity of Condensed Tannins圖11 超聲功率與液料比對(duì)縮合單寧提取量的影響Fig.11 Effect of Ultrasonic Power and Liquid-solid Ratio on Extraction Capacity of Condensed Tannins

2.2.4 最優(yōu)工藝的優(yōu)化及驗(yàn)證 響應(yīng)面提取香蕉葉縮合單寧的最優(yōu)工藝條件為：提取時(shí)間25.44 min，乙醇濃度84.64 %，液料比28.13 mL·g-1，超聲功率51.29 %，此條件下縮合單寧提取量預(yù)測(cè)值為7.27 mg·g-1.為符合實(shí)際操作，將最優(yōu)提取條件微調(diào)為：提取時(shí)間25 min，乙醇濃度85 %，液料比28 mL·g-1，超聲功率50 %，進(jìn)行平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所測(cè)得縮合單寧提取量的平均值為7.15 mg·g-1，與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差只有1.65 % ，說(shuō)明利用響應(yīng)面優(yōu)化的方法有效，具有實(shí)際應(yīng)用性.

3 結(jié)論

本文通過(guò)考察提取時(shí)間、乙醇濃度、液料比、超聲功率對(duì)香蕉葉縮合單寧提取量的影響，利用響應(yīng)面法分析獲得提取香蕉葉縮合單寧的最佳條件為：提取時(shí)間25.44 min，乙醇濃度84.64 %，液料比28.13 mL·g-1,超聲功率51.29 %，此條件下縮合單寧提取量預(yù)測(cè)值為7.27 mg·g-1；實(shí)際微調(diào)工藝條件為：提取時(shí)間25 min，乙醇濃度85 %，液料比28 mL·g-1,超聲功率50 %，實(shí)際提取率為7.15 mg·g-1，與理論值相對(duì)誤差為1.65 %，驗(yàn)證了最優(yōu)提取工藝的有效性，為香蕉葉縮合單寧資源利用與研究提供參考.