吳 磊,張學(xué)洪,李寧杰,陳中維,蘭 琪,劉 潔

(1.桂林理工大學(xué) a.環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院;b.廣西環(huán)境污染控制理論與技術(shù)重點實驗室,廣西 桂林 541006; 2.南京水利科學(xué)研究院，南京 210029)

0 引 言

隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展和人類的活動,環(huán)境中重金屬污染越來越嚴重[1]。微生物對重金屬具有吸附和轉(zhuǎn)化作用,可以將其從廢水中去除,已發(fā)現(xiàn)的用于重金屬離子吸附的微生物數(shù)量眾多,主要有細菌、真菌和藻類[2-5]。

胞外聚合物(extracellular polymeric substances,EPS)是微生物在特定條件下分泌并附著在細胞表面或周圍的多聚化合物,其組分一般以多糖、蛋白質(zhì)和腐脂類等為主[6-7]。由于這些大分子物質(zhì)的存在,EPS含有豐富的官能團(如羥基、羧基、氨基等),在微生物對重金屬離子的積極防御和去除中都有重要的作用[8-9]。

由于白腐真菌對重金屬有較強的吸附能力,使其在微生物修復(fù)重金屬污染的研究中受到了廣泛的關(guān)注[10-11]。雖然EPS作為白腐真菌與環(huán)境接觸的最直接橋梁,然而目前對EPS在白腐真菌去除重金屬過程中的具體作用卻并不明確,多是引用細菌EPS的作用來解釋實驗現(xiàn)象。據(jù)曹秀芹等[12]報道,活性污泥中細菌EPS的70%～80%是由蛋白質(zhì)和多糖構(gòu)成,余下的20%～30%來自于腐殖酸、核酸和脂類等。另據(jù)陳苗苗等[13]報道,冬蟲夏草CordycepssinensisEPS中以多糖為主,含有少量其他物質(zhì)。由此可見,細菌與真菌的EPS之間有很大差別。因而有必要對白腐真菌EPS在重金屬污染修復(fù)中的作用進行詳細的研究。

本文采用白腐真菌的模式菌種——黃孢原毛平革菌進行鎘的去除試驗,通過分析胞外聚合物(EPS)去除鎘的含量占菌體去除總鎘量的比例來研究黃孢原毛平革菌EPS在鎘去除過程中的作用。重金屬脅迫會影響微生物EPS的組成[14],這可能進一步影響EPS在微生物去除重金屬過程中的作用,因而本研究將進一步分析鎘脅迫下EPS中各組分變化,并對EPS各組分含量與EPS去除的鎘含量進行相關(guān)性分析,從而得出鎘脅迫下菌體EPS各組分在去除鎘過程中發(fā)揮的具體作用。

1 材料與方法

1.1 菌種的培養(yǎng)

黃孢原毛平革菌(PhanerocheatechrysosporiumBKMF-1767)保存在葡萄糖土豆瓊脂培養(yǎng)基上。 使用微量元素液體培養(yǎng)基培養(yǎng),具體配制如下(L-1): 2 g KH2PO4、0.1 g CaCl2、0.5 g MgSO4、0.115 g FeSO4·7H2O 、0.112 g MnSO4·H2O、0.089 g ZnSO4·7H2O、0.05 g CuSO4·5H2O、0.001 g維生素B1、0.206 g C4H12N2O6、10 g葡萄糖,pH 4.5。 試驗中使用的藥劑均為分析純,溶液全部使用超純水配制。

培養(yǎng)液經(jīng)121 ℃高溫蒸汽滅菌30 min后,每200 mL接種2 mL孢子懸液,于650 nm波長下吸光度為0.5,置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(30 ℃、180 r/min),48 h后加入Cd(NO3)2溶液,使培養(yǎng)液中Cd2+濃度分別為0、10、25、50、100 mg/L,并定時取樣。 每個濃度設(shè)置3個平行樣。

1.2 EPS的提取及菌球干重的測定

采用高速冷凍離心法提取黃孢原毛平革菌EPS,培養(yǎng)得到的菌球經(jīng)超純水清洗后再加入一定體積的超純水,在高速冷凍離心機10 000 r/min下離心20 min,得到的上清液即為EPS溶液。 對提取EPS后的菌球進行真空冷凍干燥至恒重,測得菌球干重。

1.3 多糖、蛋白質(zhì)濃度的測定

EPS溶液中多糖濃度采用蒽酮硫酸比色法測定,在波長620 nm下比色,以葡萄糖作為標準物質(zhì)。EPS溶液中蛋白質(zhì)濃度采用考馬斯亮藍G250法測定,在595 nm波長下比色,以牛血清蛋白作為標準物質(zhì)。

1.4 鎘的測定

鎘濃度采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(PerkinElmer Optima 7000DV,美國)測定,測定前對樣品進行酸化預(yù)處理并經(jīng)0.45 μm濾膜過濾。

1.5 菌體掃描電鏡及X射線能譜儀分析

采用場發(fā)射掃描電鏡(Zeiss Σigma,德國)和X射線能譜儀(Oxford Inca,英國)分別對100 mg/L Cd2+脅迫下未提取EPS和已提取EPS的菌體進行形貌觀察以及微區(qū)成分分析,其中樣品鍍金膜時間為50 s。

2 結(jié)果與討論

2.1 EPS對鎘的去除作用

由圖1可知,在10和25 mg/L Cd2+實驗組中,EPS去除鎘量占菌體去除鎘量的比例最高分別為37.4%和39.3%;在50和100 mg/L Cd2+實驗組中,該比例最高僅為23.7%和7.7%。鎘初始濃度越高,黃孢原毛平革菌去除鎘過程中,菌體EPS去除的鎘量占菌體去除鎘總量的比例越低。該比例在培養(yǎng)初期呈現(xiàn)持續(xù)增長的趨勢。這表明EPS在黃孢原毛平革菌去除鎘初期發(fā)揮著更重要的作用,且在低濃度鎘的去除過程中作用更大。

圖1 不同培養(yǎng)時間下EPS去除鎘量占菌體去除鎘總量的比例Fig.1 Proportion of removal amount of Cd by EPS to total Cd2+ amount by Phanerocheate chrysosporium at different culture times

2.2 鎘脅迫下EPS的組分含量變化

在EPS組分中,蛋白質(zhì)含量相對較少,多糖是主要成分。 由圖2a可知,在黃孢原毛平革菌培養(yǎng)5 d后,對照組中含量為0.77 mg蛋白質(zhì)/g菌球; 10 mg/L Cd2+實驗組中含量為0.56 mg蛋白質(zhì)/g菌球; 100 mg/L Cd2+實驗組中含量僅為0.22 mg蛋白質(zhì)/g菌球,這說明Cd2+濃度越高,蛋白質(zhì)含量整體越低。 由圖2b可知,在黃孢原毛平革菌培養(yǎng)5 d后,100 mg/L Cd2+實驗組中含量為20.00 mg多糖/g菌球; 10 mg/L Cd2+實驗組中含量僅為12.16 mg多糖/g菌球; 對照組中含量最高為26.64 mg多糖/g菌球,這說明Cd2+濃度越高,EPS中多糖含量整體越高,但實驗組中多糖含量均要低于空白組。 這表明鎘脅迫會影響黃孢原毛平革菌EPS中組分的含量。 在1～100 mg/L范圍內(nèi),鎘脅迫濃度越高,單位干重菌球的EPS中蛋白質(zhì)含量越低,而多糖含量越高。

圖2 不同培養(yǎng)時間的單位干重菌球的EPS組分含量變化Fig.2 Changes in EPS composition of unit dry weight of Phanerocheate chrysosporium at different culture times

2.3 EPS與鎘去除量的相關(guān)性

分別對鎘脅迫下EPS中多糖、蛋白質(zhì)含量與鎘去除量進行線性擬合(圖3)。

由圖3a可知,EPS中蛋白質(zhì)含量與鎘去除量之間呈現(xiàn)負相關(guān),且線性關(guān)系一般;由圖3b可知,

圖3 EPS組分含量與鎘去除量的擬合Fig.3 Correlation fitting between EPS component content and Cd removal amount

EPS中多糖含量與鎘去除量之間呈現(xiàn)正相關(guān),且線性關(guān)系良好。 多糖含量與鎘去除量之間的相關(guān)性強于蛋白質(zhì)含量與鎘去除量之間的相關(guān)性,這表明在EPS去除鎘的過程中， 多糖發(fā)揮的作用較蛋白質(zhì)更大。 Cd2+初始濃度越大,誘導(dǎo)菌體分泌更多多糖(圖2),多糖中羥基羧基在EPS去除鎘過程中起關(guān)鍵作用[15]。此外，在被黃孢原毛平革菌去除的過程中Cd2+的形態(tài)可能會發(fā)生變化。黃孢原毛平革菌會產(chǎn)生有機酸,如草酸會螯合Cd2+形成草酸鎘沉淀,菌體表面EPS中多糖有粘性,能粘附沉淀達到去除鎘的效果,因而Cd2+誘導(dǎo)菌體EPS組分產(chǎn)生的變化有助于去除更多的鎘[16]。

2.4 SEM及EDS分析

對100 mg/L Cd2+實驗組獲取的菌球進行SEM形貌觀察發(fā)現(xiàn)提取EPS前、后菌絲體形態(tài)未出現(xiàn)明顯變化(圖4)。使用EDS能譜分析菌體表面元素組成,結(jié)果見表1。菌體經(jīng)提取EPS后,其表面成分中鎘含量從5.14%下降到4.42%,進一步證明了EPS在鎘去除過程中發(fā)揮著一定的作用。同時也說明菌體表面還存在其他去除鎘的方式,如重金屬離子在細胞壁表面形成絡(luò)合物、細胞壁與重金屬離子的交換等[17-19],因此去除EPS后菌體表面仍能檢測到鎘。

圖4 100 mg/L Cd2+脅迫下菌體掃描電鏡Fig.4 SEM images of Phanerocheate chrysosporium under the stress of 100 mg/L Cd2+

表1 100 mg/L Cd2+實驗組菌體微區(qū)成分及含量

Table 1 Composition and mass fraction of microzone in 100 mg/L Cd2+experimental groupwB/%

菌體類型OPSKFeCd 未提取EPS35.3115.731.7811.4328.015.14 已提取EPS37.8117.673.0310.1123.034.42

3 結(jié) 論

采用白腐真菌的模式菌種黃孢原毛平革菌進行鎘的去除試驗，得到以下結(jié)論：

(1)EPS在黃孢原毛平革菌去除鎘初期發(fā)揮著更重要的作用,且在低濃度鎘的去除過程中作用更大。

(2)鎘脅迫會影響黃孢原毛平革菌EPS中組分的含量。 Cd2+在1～100 mg/L范圍內(nèi),鎘脅迫濃度越高,單位干重菌球的EPS中蛋白質(zhì)含量越低,而多糖含量越高。

(3)多糖含量與EPS中鎘去除量之間的相關(guān)性明顯強于蛋白質(zhì)含量與EPS中鎘去除量之間的相關(guān)性,說明在EPS去除鎘的過程中多糖發(fā)揮的作用相較于蛋白質(zhì)更大。

(4)提取EPS后的菌球表面微區(qū)成分中鎘含量下降,證明了EPS在鎘去除過程中發(fā)揮著一定的作用。