張王鋒 尹建威

榆林市第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科719000

通信作者：尹建威,Email:jw000000000@163.com

目前,肺癌已經(jīng)成為全球癌癥的首要死因,而非小細(xì)胞肺癌 (non-small cell lung cancer,NSCLC)約占肺癌的85%。NSCLC患者早期沒有明顯的臨床癥狀,一旦出現(xiàn)臨床癥狀,患者疾病已經(jīng)發(fā)展到中晚期,嚴(yán)重影響患者的生存期[1]。早診斷對(duì)于NSCLC 的治療至關(guān)重要。因此,尋找NSCLC的早期生物標(biāo)志物已經(jīng)成為研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)[2]。細(xì)胞外囊泡是一種納米級(jí)別的微顆粒,由細(xì)胞分泌并帶有相應(yīng)來源細(xì)胞生物遺傳信息,可以在所有體液中穩(wěn)定存在[3]。最新研究表明細(xì)胞外囊泡特異性地包含多種微小RNA (microRNA,miRNA),可作為腫瘤診斷的生物標(biāo)志物[4]。研究表明miR-191在多種腫瘤存在不同程度的表達(dá)異常[5]。為了探討外周血細(xì)胞外囊泡miR-191 表達(dá)水平在早期NSCLC 中的診斷價(jià)值,本研究對(duì)50例早期NSCLC患者進(jìn)行研究,現(xiàn)將相關(guān)內(nèi)容報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 一般資料 選取2018年1～12月榆林市第二醫(yī)院收治的60 例早期NSCLC 患者作為觀察組,所有患者經(jīng)病理診斷確診為NSCLC。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往無腫瘤相關(guān)疾病;(2)未接受過放化療;(3)TNM 分期為Ⅰ和Ⅱ期患者。排除標(biāo)準(zhǔn)： (1)妊娠、感染患者;(2)合并有肝腎功能不全、糖尿病的患者;(3)合并有心腦血管疾病的患者;(4)合并有其他腫瘤的患者。選取同期體檢的年齡和性別匹配的60名健康者作為對(duì)照組,本研究通過榆林市第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn) (20200089),所有患者及其家屬知情后簽署知情同意書。

1.2 研究方法 所有患者于入院后治療前第2天清晨采集EDTA-K2抗凝血液標(biāo)本。離心后提取血清血漿,-80 ℃保存?zhèn)溆?。將所有患者的血漿標(biāo)本室溫溶解后,3 000×g,4 ℃離心15 min,以去除血漿中雜質(zhì),轉(zhuǎn)移上清液到新EP管中,采用液壓透析濾過法收集細(xì)胞外囊泡,并進(jìn)行分離和富集,將提取的細(xì)胞外囊泡進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)蛋白定量后備用。

吸取分離純化后的細(xì)胞外囊泡懸液加于載樣銅網(wǎng)上,待網(wǎng)孔吸收干燥后,加入洗液洗滌,然后加入電鏡溶液,反應(yīng)10 min,并洗滌2 次,室溫下干燥過夜,電鏡下成像。并根據(jù)考馬斯亮藍(lán)蛋白定量結(jié)果取10μg細(xì)胞外囊泡,按照1∶1 000的比例用PBS稀釋,然后采用納米示蹤技術(shù)統(tǒng)計(jì)細(xì)胞外囊泡的粒徑和濃度。

分別采用RNA 提取試劑盒提取細(xì)胞外囊泡和血漿中的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增miR-191,采用是2-ΔΔCt法計(jì)算miR-191的表達(dá)水平。

分別采用細(xì)胞角蛋白19片段 (cytokeratin 19 fragment,CYFRA21-1)、 鱗 細(xì) 胞 癌 抗 原(squamous cell carcinoma antigen,SCCA)以及癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法)分析所有患者細(xì)胞外囊泡,以校準(zhǔn)品濃度及熒光值做成標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣本的熒光值計(jì)算樣本中CEA、SCCA、CYRRA21-1表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料采用x-±s 表示,采用t 檢驗(yàn),采用受試者工作特征 (receiver operating characteristic curve,ROC)曲線分析細(xì)胞外囊泡miR-191水平診斷效能,P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 透射電鏡和納米顆粒跟蹤技術(shù)分析分離出的細(xì)胞外囊泡 利用透射電鏡觀察分離到的早期非小細(xì)胞肺癌患者的外周血細(xì)胞外囊泡分布情況如圖1所示,大小約為40 nm,呈囊泡狀分布。納米顆粒跟蹤分析結(jié)果顯示納米顆粒粒徑,最大峰值為(167.6±10.3)nm,大多數(shù)顆粒的直徑小于200 nm (圖1),符合細(xì)胞外囊泡的粒徑范圍,與透射電鏡的結(jié)果吻合。

2.2 2組外周血游離和細(xì)胞外囊泡miR-191水平比較 2組外周血游離miR-191表達(dá)水平數(shù)據(jù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=1.230,P ＞0.05),觀察組患者細(xì)胞外囊泡miR-191水平顯著高于對(duì)照組患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t =15.686,P ＜0.05),見表1。

圖1 透射電鏡和納米顆粒跟蹤技術(shù)分析分離出的細(xì)胞外囊泡 A：透射電鏡;B：納米顆粒跟蹤技術(shù)

表1 2組患者外周血游離和細(xì)胞外囊泡miR-191相對(duì)表達(dá)水平比較(±s)

表1 2組患者外周血游離和細(xì)胞外囊泡miR-191相對(duì)表達(dá)水平比較(±s)

組別 例數(shù) 游離miR-191 細(xì)胞外囊泡miR-191對(duì)照組 60 4.3±1.0 5.1±1.1觀察組 60 5.3±1.2 12.3±2.1 t值 1.230 15.686 P 值 0.248 ＜0.001

2.3 ROC曲線分析細(xì)胞外囊泡miR-191水平對(duì)早期NSCLC的診斷價(jià)值 ROC 曲線分析結(jié)果顯示,細(xì)胞外囊泡miR-191水平預(yù)測(cè)早期NSCLC的曲線下面積為83.6% (P ＜0.05),95%CI：0.734～0.928。當(dāng)miR-191 水平為9.7時(shí),可得出最佳敏感度 (76%)和特異度 (84.3%),細(xì)胞外囊泡miR-191 水平的曲線下面積顯著高于CEA(50.1%)、SCCA (62.1%)、CYFRA21-1 (60.0%)以及三項(xiàng)聯(lián)合(71.5%),見圖2。

2.4 早期NSCLC 患者外周血細(xì)胞外囊泡miR-191 表達(dá)水平與臨床病理相關(guān)性分析 早期NSCLC患者外周血細(xì)胞外囊泡miR-191表達(dá)水平與TNM 分期有關(guān) (t=3.126,P ＜0.05),與年齡、性別、吸煙史、病理分期及病理分型均無關(guān)(P 值均＞0.05),見表2。

3 討論

在機(jī)體內(nèi)所有細(xì)胞均分泌細(xì)胞外囊泡,但腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞外囊泡的釋放量遠(yuǎn)超正常細(xì)胞,因此,腫瘤患者外周血的細(xì)胞外囊泡絕大部分來自于腫瘤細(xì)胞,其組成成分,包括蛋白質(zhì)、DNA、mRNA以及miRNA 等,與腫瘤母細(xì)胞保持高度一致性[6]。提取外周血細(xì)胞外囊泡進(jìn)行相關(guān)癌癥研究,為腫瘤細(xì)胞特征的分析提供了一個(gè)新的思路。在多種腫瘤進(jìn)程中,miRNA 作為關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用,參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲、血管生成和細(xì)胞凋亡等[7]。

圖2 受試者工作特征曲線分析miR-191、CEA、SCCA 以及CYRRA21-1對(duì)早期非小細(xì)胞肺癌的診斷價(jià)值

表2 早期非小細(xì)胞肺癌患者外周血細(xì)胞外囊泡miR-191表達(dá)水平與臨床病理相關(guān)性分析 (x-±s)

本研究對(duì)60例早期NSCLC 的進(jìn)行研究,結(jié)果顯示2組外周血游離miR-191 表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05),觀察組患者細(xì)胞外囊泡miR-191水平顯著高于健康對(duì)照組患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。表明外周血細(xì)胞外囊泡miR-191是NSCLC的高危預(yù)測(cè)因素。而兩組患者的外周血游離miR-191數(shù)據(jù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)于miRNA 而言,人體外周血的酸堿度、溫度以及各種酶類等物質(zhì)共同營造的環(huán)境使得大量游離miRNA 被降解,因此,外周血中游離miR-191的表達(dá)量個(gè)體差異很大,不能準(zhǔn)確反映NSCLC患者腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞中miR-191的表達(dá)情況[8-9]。相關(guān)研究也表明miR-191在多種腫瘤組織中呈不同程度的表達(dá)升高,并與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲遷移、凋亡以及細(xì)胞周期密切相關(guān)[10]。有研究表明miR-191 在NSCLC 表達(dá)水平顯著升高,且與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者的生存期密切相關(guān)[11]。本研究還發(fā)現(xiàn)NSCLC患者外周血細(xì)胞外囊泡的miR-191的表達(dá)水平與病理分期相關(guān),表明miR-191的表達(dá)水平隨著NSCLC腫瘤細(xì)胞惡性程度的增高而升高。其機(jī)制可能是miRNA191參與誘導(dǎo)細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化,最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生,惡性程度越高的腫瘤組織及細(xì)胞,釋放出更多的細(xì)胞外囊泡[12]。

目前,臨床上NSCLC風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)的有效的血清標(biāo)志物包括CEA、SCCA、CYRRA21-1等[13]。本研究結(jié)果顯示細(xì)胞外囊泡miR-191 水平預(yù)測(cè)早期NSCLC的曲線下面積為83.6% (P ＜0.05),顯著 高 于 CEA (50.1%)、SCCA (62.1%)、CYFRA21-1 (60.0%)以及三項(xiàng)聯(lián)合 (71.5%)。從常規(guī)上講CEA、SCCA、CYRRA21-1可以作為NSCLC的診斷指標(biāo),但是由于在臨床上實(shí)際操作起來需要復(fù)雜的運(yùn)算、缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的診斷界點(diǎn)[14],此外對(duì)于早期NSCLC,這三種的診斷效能明顯低于外周血細(xì)胞外miR-191 的表達(dá)水平,所以本研究推薦采用外周血細(xì)胞外miR-191 的表達(dá)水平來替代CEA、SCCA、CYRRA21-1作為早期NSCLC的診斷[15]。

綜上所述,早期NSCLC患者外周血細(xì)胞外囊泡miR-191表達(dá)水平顯著增高,可以作為臨床檢測(cè)早期NSCLC的潛在標(biāo)志物之一,具有重要的臨床意義。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突