鐘世歡，金建奇，葉磊海，，葉佳明，王 瀟，裘鈞陶

(1.贊宇科技集團(tuán)股份有限公司，杭州310009; 2.浙江金正檢測(cè)有限公司，義烏321000;3.浙江公正檢驗(yàn)中心有限公司，杭州310009)

失眠是一種常見(jiàn)的睡眠障礙癥，患者常常因睡眠時(shí)間、質(zhì)量不滿足而影響日間社會(huì)功能。長(zhǎng)期失眠會(huì)導(dǎo)致工作效率降低，社會(huì)成本增加[1]，甚至引發(fā)心臟病、高血壓等心腦血管疾病[2-4]，對(duì)人類的生理和心理產(chǎn)生極大的傷害。部分失眠患者為緩解失眠癥狀，會(huì)選擇助眠類保健品進(jìn)行輔助治療，認(rèn)為其具有效果溫和、不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)。但個(gè)別不法商家為了牟取暴利，將禁用安神類藥物添加至保健品中，以增強(qiáng)藥效。這些非法添加的化學(xué)藥物使患者產(chǎn)生依賴性，大量使用會(huì)引發(fā)相應(yīng)的毒副作用，抑制患者的中樞神經(jīng)[5]，影響其認(rèn)知能力[6]。在患者不知情下使用，容易引發(fā)和其他物質(zhì)相互作用[7]，甚至中毒，嚴(yán)重危害患者生命安全。因此，國(guó)家對(duì)禁用安神類藥物的添加量進(jìn)行了嚴(yán)格的規(guī)定，在保健品中禁止添加。

目前，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局在“藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件(2009024、2013002和2012004)”中提出了禁用安神類藥物的測(cè)定方法，包括薄層色譜法和液相色譜法，該方法涉及色譜體系較多，分析時(shí)間長(zhǎng)，樣品的提取過(guò)程較繁瑣，無(wú)法同時(shí)快速測(cè)定多種禁用安神類藥物的含量。國(guó)內(nèi)外報(bào)道的關(guān)于禁用安神類藥物的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法[8]、數(shù)字對(duì)照品法[9]、薄層色譜法[10]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-14]及氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15]等，但是同時(shí)測(cè)定保健品中22種禁用安神類藥物的分析方法較少。

本工作建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)同時(shí)測(cè)定助眠類保健品中22種禁用安神類藥物的含量，該方法具有快速、準(zhǔn)確和簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，可用于指導(dǎo)實(shí)際工作，可為助眠類保健品的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供技術(shù)支持。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

AB 4500型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源和Analyst數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);AR 2140型電子分析天平;KS-300EI型超聲波清洗器;Centrifug-5804R 型臺(tái)式離心機(jī);N-EVAP 11 型氮吹儀;Milli-Q 型純水儀;Oasis PRi ME HLB固相萃取柱(200 mg/6 m L)。

22 種禁用安神類藥物的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:1 000 mg·L－1，分別稱取各禁用安神類藥物標(biāo)準(zhǔn)品0.010 0 g，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 m L棕色容量瓶中，用甲醇定容，于－20 ℃下避光保存。

22 種禁用安神類藥物標(biāo)準(zhǔn)品，純度均大于98%;乙腈、甲酸和甲醇均為色譜純;試驗(yàn)用水為超純水。

試驗(yàn)選擇的助眠類保健品均由流通市場(chǎng)上隨機(jī)抽樣得到。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 Poroshell 120 EC-C18色譜柱(50 mm×3.0 mm，2.7μm);流量為0.30 m L·min－1;進(jìn)樣量2.0μL;柱溫35 ℃;流動(dòng)相A 為含0.05%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲酸的5 mmol·L－1乙酸銨溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序:0～0.5 min時(shí)，B為5%;0.5～5.0 min時(shí)，B 由5%升至90%;5.1～9.0 min時(shí)，B為90%;9.1～12.0 min時(shí)，B為5%。

2)質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子(ESI＋)和負(fù)離子(ESI－)掃描模式同時(shí)采集;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式;離子源溫度500 ℃;氣簾氣壓力278.5 k Pa，噴霧氣壓力69.0 k Pa，輔助加熱氣壓力379.2 k Pa。22 種禁用安神類藥物的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1，其中“?”為定量離子。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

1.3 試驗(yàn)方法

稱取樣品1.000 g，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至25 m L容量瓶中，渦旋混勻，超聲15 min，冷卻至室溫，用甲醇稀釋至刻度，混合搖勻，離心，取上清液5.00 m L經(jīng)過(guò)Oasis PRi ME HLB 固相萃取柱，收集流出液，用甲醇2 m L淋洗固相萃取柱2次，合并收集的流出液，于40 ℃下吹氮濃縮至近干，再用體積比為1∶1的0.05%甲酸-甲醇混合溶液1.00 m L重復(fù)溶解殘?jiān)?，?jīng)過(guò)0.22μm 濾膜過(guò)濾，得到的濾液按照儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法的選擇

2.1.1 提取劑

部分不法廠商將禁用藥物摻雜在片劑包衣或膠囊殼中，以逃避抽查檢測(cè)，試驗(yàn)將樣品連同片劑包衣和膠囊殼一起研碎后取樣。22種禁用安神類藥物的物理、化學(xué)性質(zhì)不同，試驗(yàn)考察了分別以甲醇、乙醇和乙腈為提取劑時(shí)，對(duì)膠囊類、口服液類、片劑類保健品中22 種禁用安神類藥物提取效率的影響。結(jié)果表明:甲醇、乙醇和乙腈提取劑對(duì)口服液類保健品中22種禁用安神類藥物的提取效率相當(dāng);膠囊類和片劑類保健品富含天然產(chǎn)物、蛋白質(zhì)與脂肪類化合物，用乙醇提取時(shí)，基質(zhì)干擾物較多，受基質(zhì)抑制效應(yīng)的影響嚴(yán)重，而用甲醇、乙腈提取膠囊類保健品和片劑類保健品時(shí)基質(zhì)影響較乙醇小?？紤]到甲醇比乙腈更安全經(jīng)濟(jì)，試驗(yàn)選擇的提取劑為甲醇。

2.1.2 固相萃取柱

為了進(jìn)一步減小基質(zhì)干擾，試驗(yàn)比較了C18固相萃取柱、DisQu E凈化粉及Oasis PRi ME HLB固相萃取柱對(duì)22種禁用安神類藥物的凈化效果，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同種類的固相萃取柱對(duì)22種禁用安神類藥物凈化效率的比較Fig.1 Comparison of efficiency of purification of the 22 forbidden sedative-hypnotics by different kinds of solid phase extraction columns

由圖1可知:Oasis PRi ME HLB固相萃取柱對(duì)22種禁用安神類藥物的凈化效果最好，可有效降低基質(zhì)效應(yīng)。試驗(yàn)選擇Oasis PRi ME HLB固相萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱

試驗(yàn)考察了Poroshell 120 EC-C18色譜柱(50 mm×3.0 mm，2.7μm)和RSLC 120 C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，2.2μm)對(duì)22種禁用安神類藥物測(cè)定的影響。結(jié)果表明:這2種色譜柱對(duì)22種禁用安神類藥物的分離效果相當(dāng)，且在基線噪聲方面沒(méi)有太大差別，但Poroshell 120 EC-C18色譜柱(50 mm×3.0 mm，2.7μm)的系統(tǒng)壓力較小，試驗(yàn)選 擇Poroshell 120 EC-C18色 譜 柱(50 mm ×3.0 mm，2.7μm)對(duì)22 種 禁 用 安 神 類 藥 物 進(jìn) 行分離。

2.2.2 流動(dòng)相

試驗(yàn)考察了分別以0.1%甲酸溶液、含0.05%甲酸的5 mmol·L－1乙酸銨溶液為流動(dòng)相A 時(shí)對(duì)22種禁用安神類藥物分離效果的影響。結(jié)果表明:流動(dòng)相中加入甲酸溶液可增加離子化效率，使信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度增強(qiáng);乙酸銨調(diào)節(jié)流動(dòng)相的酸度且具有緩沖作用，可防止色譜峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，有效改善峰形，其中對(duì)巴比妥類禁用安神類藥物的出峰情況改善最為明顯。試驗(yàn)選擇的流動(dòng)相A 為含0.05%甲酸的5 mmol·L－1乙酸銨溶液。以含0.05%甲酸的5 mmol·L－1乙酸銨溶液為流動(dòng)相A 時(shí)，巴比妥類禁用安神類藥物的總離子流色譜圖見(jiàn)圖2。

試驗(yàn)進(jìn)一步考察了分別以乙腈、甲醇為流動(dòng)相B對(duì)22種禁用安神類藥物測(cè)定的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):以甲醇為流動(dòng)相B時(shí)，22種禁用安神類藥物的峰形扁平甚至分叉，且分離度較差;以乙腈為流動(dòng)相B時(shí)，基線平穩(wěn)且22種禁用安神類藥物的峰形良好。綜合考慮，試驗(yàn)選擇的流動(dòng)相為含0.05%甲酸的5 mmol·L－1乙酸銨溶液-乙腈混合溶液。

圖2 4種禁用安神類藥物的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion flow chromatogram of 4 forbidden sedative-hypnotics

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

配制5 mg·L－1的22種禁用安神類藥物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用針泵取樣后，在手動(dòng)調(diào)節(jié)模式下，通過(guò)針泵以10μL·min－1的流量進(jìn)樣來(lái)確定母離子;再通過(guò)手動(dòng)調(diào)節(jié)去簇電壓值，使母離子的信號(hào)強(qiáng)度只有最強(qiáng)碎片離子信號(hào)強(qiáng)度的三分之一左右，選擇兩個(gè)最強(qiáng)的碎片離子作為子離子;再優(yōu)化碰撞電壓，提供離子共振能量，有效防止溶劑分子吸附從而實(shí)現(xiàn)去簇，同時(shí)預(yù)防離子共振碎裂導(dǎo)致源內(nèi)裂解;最后對(duì)離子源溫度、氣簾氣壓力、噴霧氣壓力和輔助加熱氣壓力等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使目標(biāo)物的響應(yīng)信號(hào)達(dá)到較大。在ESI＋模式下18 種禁用安神類藥物的色譜圖見(jiàn)圖3，在ESI－模式下4種巴比妥類禁用安神類藥物的色譜圖見(jiàn)圖2。

圖3 18種禁用安神類藥物的總離子流色譜圖Fig.3 Total ion flow chromatogram of 18 forbidden sedative-hypnotics

在巴比妥類禁用安神類藥物的質(zhì)譜條件優(yōu)化時(shí)，發(fā)現(xiàn)均有質(zhì)荷比(m/z)為85 碎片離子，根據(jù)4種巴比妥類化合物結(jié)構(gòu)式及碎片信息推測(cè)，其斷裂方式見(jiàn)圖4。

圖4 禁用安神類藥物的裂解方式Fig.4 The cracking mode of the forbidden sedative-hypnotics

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測(cè)定下限

按照儀器工作條件對(duì)22種禁用安神類藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定，以22種禁用安神類藥物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，與其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。22種禁用安神類藥物的線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。

表2 線性參數(shù)、檢出限和測(cè)定下限Tab.2 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

表2(續(xù))

以3倍信噪比和10倍信噪比計(jì)算方法的檢出限(3S/N)和測(cè)定下限(10S/N)，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5 精密度和回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對(duì)空白膠囊類、片劑類和口服液類保健品樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)量為3，10，100倍的檢出限，每個(gè)加標(biāo)樣品平行測(cè)定6次，計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果表明:22 種禁用安神類藥物的回收率為81.2%～98.9%，RSD 為3.1%～9.7%。

2.6 樣品分析

按照試驗(yàn)方法對(duì)市場(chǎng)上流通銷售的膠囊類、片劑類和口服液類等30 種助眠類保健品進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明:有1種樣品中檢出褪黑素，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.10 mg·g－1。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.170－2003中關(guān)于保健品中褪黑素的測(cè)定方法為高效液相色譜-紫外檢測(cè)法，采用該方法對(duì)該陽(yáng)性樣品進(jìn)行測(cè)定，褪黑素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.15 mg·g－1，說(shuō)明本工作建立的方法準(zhǔn)確可行。

本工作建立了UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定助眠類保健品中22種禁用安神藥物的分析方法。優(yōu)化了前處理方法和儀器工作條件，減少了前處理時(shí)間及成本，避免了復(fù)雜前處理過(guò)程導(dǎo)致的目標(biāo)物損失。該方法具有快速、靈敏度高、專屬性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。針對(duì)目前助眠類保健品種類繁多，市場(chǎng)情況復(fù)雜的情況，可用于實(shí)際檢測(cè)工作，實(shí)現(xiàn)樣品中各種禁用安神類藥物的快速分析篩查，可為助眠類保健品安全突發(fā)事件的快速處理工作提供技術(shù)支持。