彭志柱，肖晶，李啟明，夏學巍，王文波

缺血性腦卒中的治療主流思想是恢復血流再通，但血流再通后會導致再灌注損傷[1]。有研究表明，缺血再灌注損傷導致多種疾病的發(fā)病率和死亡率增高，與缺血再灌注組織氧化應激、炎癥密切相關(guān)[2,3]，因此抑制炎癥反應在缺血再灌注損傷的治療中至關(guān)重要。毛蕊異黃酮是一種天然植物雌激素，Wang 等[4]報道毛蕊異黃酮在缺血再灌注損傷中具有神經(jīng)保護作用，但是目前毛蕊異黃酮對腦缺血再灌注的作用機制仍不清楚。因此，本研究探討毛蕊異黃酮對腦缺血再灌注大鼠的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 2 月齡體質(zhì)量225～285 g 的雄性SD大鼠（Ⅱ級，No.140211）80 只，購于桂林醫(yī)學院實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑 毛蕊異黃酮（分子量=284.27，純度N 98%，通過高效液相色譜驗證；購于中國Phytomarker公司）溶解在二甲基亞砜（購于天津馬克生物技術(shù)公司）中制備成200 mmol/L溶液，4 ℃儲存?zhèn)溆?。丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot，WB）相關(guān)試劑包括兔源磷酸化NF-κB單抗、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記兔抗鼠IgG和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體購于美國Santa Cruz 公司。4%多聚甲醛、辣根過氧化氫酶DAB顯色試劑盒、蛋白上樣緩沖液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜、氯化三苯四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 局灶性腦缺血再灌注模型制備 所有實驗程序均根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院實驗動物護理和使用指南進行，該方案經(jīng)桂林醫(yī)學院動物倫理委員會批準。將80 只大鼠隨機分為sham 組、I/R 組、高劑量組、中劑量組和低劑量組各16只。造模前14 d開始腹腔注射給藥毛蕊異黃酮，高劑量組給予毛蕊異黃酮20 mg/(kg·d)，中劑量組給予毛蕊異黃酮10 mg/(kg·d)，低劑量組給予毛蕊異黃酮5 mg/(kg·d)，sham 組、I/R 組則給予等量DMSO，連續(xù)給藥14 d，末次給藥后1 h后，使用10%水合氯醛麻醉大鼠，然后采用線栓法建立大腦中動脈腦缺血再灌注模型：將具有圓形尖端的4-0尼龍單絲線插入右側(cè)頸總動脈，并進入頸內(nèi)動脈直至其阻塞大腦中動脈（middle cerebral artery，MCA）的起源。在閉塞動脈2 h后，小心取出細絲恢復血流灌注實現(xiàn)組織血液再灌注24 h。sham組暴露頸動脈但不插入細絲。在整個操作過程中，監(jiān)測直腸溫度并用加熱墊保持在37 ℃～38 ℃，室溫25 ℃～27 ℃。

1.2.2 動物神經(jīng)行為學評分 將蘇醒后的大鼠放回籠內(nèi)，使其自由飲食。再灌注24 h 后評估并記錄每組大鼠神經(jīng)功能缺損評分[5]：0級為無功能障礙，1級為不能伸展左側(cè)前肢，2級為向左側(cè)旋轉(zhuǎn)，3級為向左側(cè)傾倒，4 級為無自主活動伴意識障礙，5 級為死亡（死亡的需剔除）。級別越高，表示動物神經(jīng)功能損傷越大。

1.2.3 腦梗死體積測量 TTC染色法用于測量腦梗死體積的大小[6]。神經(jīng)行為學評分后處死大鼠，將大鼠整腦從頭顱中取出并在－20 ℃下保持10 min。將冷凍腦切成連續(xù)的2 mm 冠狀切片，并在2%TTC 溶液中于37 ℃浸泡30 min，梗死腦組織染色陰性形成對比，使用具有高分辨率的數(shù)碼相機拍攝梗死區(qū)域，應用圖像分析軟件（NIH Image，National Institutes of Health，Bethesda，Version 1.63）測量腦梗死灶體積大小。

1.2.4 腦水腫測量 將兩個大腦半球分別稱重（濕重），然后將其置于100 ℃下24 h后測定干重。計算腦水腫程度：水含量=（濕重－干重）/濕重×100%。

1.2.5 腦組織中MDA、SOD 活力測定 取出術(shù)側(cè)MCA供血的皮質(zhì)和尾狀殼核，儲存在－80 ℃，分別采用TBA 法、比色法測定腦組織中過氧化產(chǎn)物MDA 含量及SOD活性，均嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.2.6 腦缺血半暗帶區(qū)NF-κB含量的測定 將各組的腦組織置于裂解液中裂解30 min，12 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液，BCA 法測定蛋白濃度后行SDS-PAGE 電泳分離等量的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)至PVDF膜，使用5%脫脂奶粉封閉PVDF 膜1 h，加入單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，加入二抗，室溫孵育1 h，洗膜，加入ECL發(fā)光液，顯色，UVP凝膠成像系統(tǒng)成像記錄，利用Image J進行圖像灰度值處理。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料以（Mean±SD）表示，完全隨機秩和檢驗、方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 毛蕊異黃酮對神經(jīng)功能缺損、腦梗死率和水腫的影響

I/R 組大鼠的神經(jīng)功能評分、腦梗死體積、腦含水量明顯高于sham 組（P＜0.001），低劑量組、中劑量組、高劑量組的神經(jīng)功能評分、腦梗死體積、腦含水量均高于sham 組（P＜0.05 或P＜0.01）；與I/R 組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組的神經(jīng)功能評分、腦梗死體積、腦含水量下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；低劑量組、中劑量組、高劑量組的神經(jīng)功能評分、腦梗死體積、腦含水量隨著毛蕊異黃酮濃度升高而降低，以高劑量組下降最為明顯（P＜0.05或P＜0.01），見圖1。

圖1 各組神經(jīng)功能評分、腦梗死體積、腦含水量比較

2.2 毛蕊異黃酮對大鼠腦組織中MDA含量及SOD活力的影響

與sham組比較，I/R組的SOD活性顯著降低，有顯著性差異（P＜0.01）；低劑量組、中劑量組的SOD活性較sham 組下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05 或P＜0.01），高劑量組的SOD 活性與sham 組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與I/R 組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組的腦組織中SOD 活性顯著增加，有顯著性差異（P＜0.01）；低劑量組、中劑量組、高劑量組的SOD 活性隨著毛蕊異黃酮濃度的增加而升高（P＜0.05 或P＜0.01），見圖2A。I/R組的MDA水平顯著高于sham組，有顯著性差異（P＜0.01）；與I/R組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組的MDA 水平顯著降低，有顯著性差異（P＜0.01）；與sham 組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組的MDA 水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05 或P＜0.01）；低劑量組、中劑量組、高劑量組的MDA 水平隨著毛蕊異黃酮濃度升高而降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01），見圖2B。

2.3 毛蕊異黃酮對大鼠腦缺血再灌注NF-κB表達水平的影響

與sham組相比，I/R組的NF-κB的表達上調(diào)，有顯著性差異（P＜0.01）；與sham組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組的NF-κB的表達上調(diào)，有統(tǒng)計學差異（P＜0.05或P＜0.01）；與I/R組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組的NF-κB 的表達顯著下調(diào)，有顯著性差異（P＜0.01）；低劑量組、中劑量組、高劑量組的NF-κB的表達隨著毛蕊異黃酮濃度升高而下調(diào)，以高劑量組下調(diào)最為明顯（P＜0.05或P＜0.01），見圖3。

圖2 各組腦組織SOD、MDA比較

圖3 各組腦缺血半暗帶NF-κB蛋白表達比較

3 討論

腦缺血再灌注可引起神經(jīng)血管損傷，導致腦水腫、腦出血和神經(jīng)元死亡。腦缺血再灌注損傷涉及各種機制，例如能量衰竭、細胞內(nèi)Ca2+水平升高、興奮性神經(jīng)遞質(zhì)釋放、氧自由基產(chǎn)生、炎癥和細胞凋亡等[7]。有些學者認為炎癥反應是缺血性腦卒中后最主要的繼發(fā)性損傷機制之一[8-10]。腦缺血再灌注時，缺血、缺氧后的神經(jīng)細胞會重新獲得血供，同時會產(chǎn)生在腦損傷中起主要作用的活性氧（reactive oxygen species，ROS）。ROS 可由多種活化細胞產(chǎn)生，包括內(nèi)皮細胞、血小板、白細胞和成纖維細胞，由于腦組織中抗氧化酶的活性較低，因此缺血再灌注損傷產(chǎn)生的ROS非常容易導致腦組織受到氧化損傷，從而導致腦水腫及加重梗死。

目前，在臨床中預防和治療腦缺血再灌注損傷的藥物非常有限。令人欣慰的是，雌二醇和植物雌激素的神經(jīng)保護作用在腦局灶性和全腦性缺血中引起了極大的關(guān)注[11,12]。有研究證明[8]，毛蕊異黃酮具有顯著的抗氧化活性，因此本研究選擇毛蕊異黃酮作為陽性對照藥物。本研究中，通過大鼠體征異常變化判斷神經(jīng)功能缺損的程度、運用干濕重法計算大鼠腦含水量，并且TTC染色能夠直觀地顯示模型大鼠腦梗死的區(qū)域。結(jié)果提示，毛蕊異黃酮能顯著降低大鼠的神經(jīng)病學評分、減輕腦細胞的水腫和腦組織梗死體積，提示其對腦缺血再灌注有保護作用。

因為ROS可攻擊神經(jīng)細胞的不飽和脂肪酸，引發(fā)的脂質(zhì)過氧化作用會產(chǎn)生大量的MDA，所以腦組織中的MDA 含量高低可間接反映神經(jīng)細胞脂質(zhì)過氧化反應的程度[9,10]。同時腦組織中的SOD 是ROS 的特殊底物誘導酶，能將腦缺血再灌注時產(chǎn)生的ROS 歧化為H2O2和O2，所以腦組織中SOD活性的高低也可在一定程度上反映出機體氧自由基的清除能力[11]。本研究中，SOD的含量在缺氧缺血后明顯降低；而經(jīng)毛蕊異黃酮給藥后，腦組織中SOD含量明顯增加，MDA水平顯著下降，并且隨著治療劑量的增加神經(jīng)細胞的缺血再灌注損傷逐漸減少。這提示毛蕊異黃酮是一種有效的自由基清除劑和抗氧化劑，其作用機制可能是通過增加腦細胞中超氧化物歧化酶的含量，有效清除羥自由基和超氧陰離子。

NF-κB蛋白是機體細胞中廣泛存在的一種轉(zhuǎn)錄因子，不僅在正常生理狀態(tài)下發(fā)揮著重要的生理作用，同時也參與炎性反應等病理生理過程。一些抗炎藥物作用機理就是通過抑制NF-κB蛋白的活化達到減輕炎性反應作用[17,18]。本研究結(jié)果顯示，缺血再灌注組NF-κB表達水平顯著增加，提示NF-κB參與調(diào)節(jié)炎性反應，炎性反應加重腦缺血再灌注的損傷，導致神經(jīng)細胞的死亡[12]，同時高表達的NF-κB 還可以通過啟動細胞凋亡途徑導致神經(jīng)細胞的凋亡，這是腦缺血再灌注損傷的另一重要途徑[13]。毛蕊異黃酮組NF-κB 表達顯著下調(diào)，說明毛蕊異黃酮對大鼠腦缺血再灌注損傷的腦組織NF-κB 的表達有抑制作用，毛蕊異黃酮可能通過抑制大鼠腦組織NF-κB表達，下調(diào)腦組織的炎性反應，進而在神經(jīng)保護中發(fā)揮作用。

綜上所述，毛蕊異黃酮具有神經(jīng)保護作用，可能與抑制缺血再灌注腦組織的炎癥反應有關(guān)，為以后研究毛蕊異黃酮在腦缺血再灌注損傷作用機制提供研究方向。