楊萍，黃惠勇，李豐

癲癇發(fā)作系腦部神經元高度同步化異常放電所導致，以反復發(fā)作性、短暫性、刻板性的中樞神經系統(tǒng)功能失常為特征，嚴重威脅人類身心健康[1]。癲癇的發(fā)病機制復雜，主要與離子通道、遺傳、神經遞質、細胞因子及免疫、神經膠質細胞等關系密切[2]。細胞焦亡（Pyroptosis）是近年發(fā)現并證實的一種伴隨著炎癥反應的細胞程序性死亡方式[3]。核苷酸結合寡聚化結構域（Nucleotide-binding Oligomerization Domain，NOD）樣受體蛋白3（NOD-Like Receptor 1，NLRP3）炎癥小體，因在癲癇、動脈粥樣硬化、阿爾茨海默病等多種疾病無菌性炎癥反應中發(fā)揮重要作用而備受關注[4]。研究發(fā)現，當各種內源性或外源性刺激激活NLRP3炎癥小體后，NLRP3分子通過伴侶蛋白ASC 的作用與Caspase-1 的前體Pro-Caspase-1 結合成大分子結合物，Pro-Caspase-1激活并水解掉自身的一個小片段成為Caspase-1，Caspase-1蛋白活化并產生有生物活性的白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18[5]，從而介導炎癥反應。那么NLRP3 介導炎癥反應如何影響癲癇形成與發(fā)展？本研究采用氯化鋰-匹羅卡品癲癇模型，對不同時間點大鼠血清采用ELISA 檢測IL-1β、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）蛋白含量，采用免疫組化及RT-PCR 方法檢測海馬齒狀回的NLRP3、Caspase-1 表達，來闡明NLRP3在匹羅卡品致癲癇大鼠模型的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級成年雄性SD 大鼠64 只，體質量為（200±20）g，購自湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心，動物合格證號：SYXK[湘]2016-0005。

1.1.2 主要試劑與設備 BX43 型雙目生物攝像顯微鏡購于日本Olympus 公司；F50 酶標儀購于瑞士Sunrise 公司；JY92-IIN 超聲儀購于寧波新芝公司。匹羅 卡 品（ab141301）、Caspase-1（ab1872）購 于 美 國Abcam 公司，氯化鋰（1001011078）購于美國Sigma 公司，阿托品（H12020382）購于天津金耀有限公司，NLRP3（BM4490）購于武漢博士德生物工程有限公司，ELISA 試劑盒購于上海哈靈生物有限公司，PCR 引物購于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及模型制備 隨機選擇12只為對照組，其他大鼠進行造模，造模后隨機分為1 d、7 d、14 d、28 d組4 組，每組12 只。其余大鼠為補充性飼養(yǎng)。參照文獻[6]采用氯化鋰-匹羅卡品誘導癲癇模型，大鼠腹腔注射氯化鋰3 mEq/kg，18 h后再給予匹羅卡品30 mg/kg，注射匹羅卡品前30 min 注射阿托品l mg/kg 以拮抗外周膽堿能作用，若30 min 內無驚厥發(fā)作，可按每次10 mg/kg 追加匹羅卡品，追加達4次仍未達到Ⅳ級發(fā)作則不再追加。側臥位送回鼠籠。達到癲癇持續(xù)狀態(tài)后40 min 給予地西泮4 mg/kg 和10%水合氯醛3 mL/kg，終止發(fā)作。選擇Racine Ⅳ級以上并存活者入組。造模后各組均以生理鹽水1 mL/d灌胃。

1.2.2 組織取材 每組各取6只在相應的時間點（1 d、7 d、14 d、28 d）將動物麻醉，經左心室抽取動脈血5 mL用于ELISA。然后心臟灌注固定，取腦，去首尾兩端，保留海馬部分，放入4%多聚甲醛溶液中固定72 h 后，組織脫水，石蠟包埋制成石蠟切片用于免疫組化。剩余大鼠麻醉后處死，將其右側海馬立即在冰上解剖分離，保存于－80 ℃，用于RT-PCR。

1.2.3 ELISA檢測血清IL-1β、TNF含量 按重量（g）：體積（mL）=1∶9的比例，加入9倍體積的生理鹽水，超聲勻漿，3 000 rpm 離心10 min，取上清進行蛋白定量。調整各管蛋白含量400 μg/mL，用于下一步ELISA。ELISA 測得各管的OD 值，通過標準品提供的回歸方程，轉化成各管IL-1β、TNF的相對含量。

1.2.4 免疫組化檢測海馬組織NLRP3、Caspase-1 表達 ①脫蠟；②加入1%H2O210 min，0.01 mmol/L PBS漂洗5 min×3；③5% BSA+0.3%TritonX-100 室溫下封閉l h；④0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3，滴加兔抗鼠一抗NLRP3、Caspase-1（1∶100）；⑤4 ℃過夜。⑥0.01 mol/L PBS 漂洗5 min×3，加入二抗（1∶200），37 ℃孵育l h；⑦0.01 mol/L PBS 漂洗5 min×3，加入ABC 復合物，37 ℃孵育l h；⑧0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3，DAB顯色試劑盒37 ℃顯色5 min；⑨蘇木素復染，二甲苯透明15 min，中性樹膠封片。計算右側海馬齒狀回光密度值。

1.2.5 RT-PCR 檢測海馬組織NLRP3、Caspase-1 表達用Triziol法提取總RNA，用反轉錄酶將mRNA反轉錄為cDNA。構建聚合酶體系；Taq酶催化，熱循環(huán)：95 ℃預熱5 min，40個循環(huán)（94 ℃20 s，退火20 s，72 ℃30 s）。采用熒光實時定量PCR 法，將閾值循環(huán)數（ct）值與不同濃度標準品的對數值擬合作圖，得出校正曲線；通過2-△△ct法計算目的基因與內參物（β-actin）Ct 值的差值，表示目的基因的相對表達水平。Caspase-1 上游引物5’-GTACACGTCTTGCCCTCATTAT-3’，下游引物5’-GCAGCAGCAACTTCATTTCTC-3’；NLRP3 上游引物5’-TCACCCAAGGAGGAAGAAGA-3’，下游引物5’-GTCTGGAAGAACAGGCAACA-3’；β-actin 上游引物5’-AGGGTGGTGGACCTCATGG-3’，下游引物5’-AGCAACTGAGGGCCTCTCTCTT-3’。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS24.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量結果以（±s）表示，所有數據均進行正態(tài)性、方差齊性檢驗，方差齊采用LSD 多重比較法，若方差不齊采用Dunnett T3，不滿足正態(tài)檢驗則使用秩和檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清IL-1β、TNF含量比較

ELISA 結果顯示，7 d、14 d、28 d 組血清中IL-1β、TNF 含量的含量較對照組增高，有顯著性差異（P＜0.01），1 d 組與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），28 d 組的IL-1β、TNF 含量均高于其他組（P＜0.01），見表1。

2.2 各組大鼠海馬組織NLRP3、Caspase-1表達

免疫組化結果顯示，大鼠海馬齒狀回細胞質可觀察到棕色或者棕褐色顆粒，為NLRP3、Caspase-1 陽性表達。7 d、14 d、28 d 組海馬齒狀回NLRP3、Caspase-1平均光密度較對照組高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），1 d 組與對照組相比無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。且28 d組NLRP3、Caspase-1 陽性表達均高于其他組（P＜0.01），見表1、圖1、圖2。

2.3 各組大鼠海馬組織NLRP3、Caspase-1 mRNA表達水平的比較

RT-PCR 結果顯示，7 d、14 d、28 d 組海馬組織NLRP3、Caspase-1 mRNA 較對照組高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），1 d 組與對照組相比無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），28 d 組NLRP3、Caspase-1 mRNA 均高于其他組（P＜0.01），見表1。

3 討論

鋰-匹羅卡品誘導的癲癇發(fā)作形式很接近人類慢性顳葉癲癇特征，造模28 d 左右動物將出現癲癇自發(fā)性發(fā)作，因此氯化鋰-匹羅卡品誘導的癲癇模型已被廣泛用于動物科研[7]。研究證實海馬齒狀回在癲癇神經發(fā)生中起關鍵作用[8]，筆者前期研究也發(fā)現慢性癲癇合并抑郁大鼠新生神經元減少[9]。Chugh 等[10]發(fā)現癲癇小鼠炎癥因子表達增加影響海馬齒狀回神經發(fā)生。實驗發(fā)現炎癥反應與癲癇的發(fā)作及復發(fā)有密不可分的關系[11,12]，腦內海馬區(qū)的炎癥反應可降低癇性發(fā)作的閾值、增加神經元興奮性、破壞血腦屏障、介導神經元死亡及突觸重塑[13]。目前已經發(fā)現多種炎性介質在癲癇患者或動物模型中表達升高，其中IL-1β與癲癇的發(fā)生發(fā)展密切相關。動物實驗已證實抑制IL-1β合成能降低癲癇的發(fā)病率及復發(fā)率，而IL-1β升高又能加劇癇性發(fā)作以及降低癲癇發(fā)作閾值[14]。選擇性阻斷，或敲除Caspase-1，能顯著減少癲癇發(fā)作[15]。

表1 各組大鼠血清IL-1β、TNF及海馬組織NLRP3、Caspase-1含量比較

注：與對照組比較，①P＜0.01；與1 d組比較，②P＜0.01；與7 d組比較，③P＜0.01；與14 d組比較，④P＜0.01

筆者使用氯化鋰-匹羅卡品誘導的癲癇模型，采用ELISA 檢測血清IL-1β、TNF 蛋白含量，發(fā)現癇性發(fā)作后各時間點血清IL-1β、TNF 蛋白含量明顯高于對照組，且在28 d時最高，考慮癲癇形成過程中與炎癥反應激活有關。張海清等[16]發(fā)現海馬區(qū)NLRP3參與急性癲癇模型（0～7 d）誘導的炎癥反應。NLRP3 炎性小體能使磷酸化的Caspase-1 去磷酸化，從而活化Caspase-1，促進IL-1β、IL-18炎性因子前體的成熟，因此NLRP3活化是IL-1β成熟的關鍵。焦亡在神經系統(tǒng)病變中起關鍵作用，且NLRP1在腦內神經元中高表達[17]，并與多種神經系統(tǒng)疾病相關，例如感染、無菌性腦損傷及慢性神經系統(tǒng)疾病[18]。研究顯示[19]，在匹羅卡品誘發(fā)的癲癇大鼠模型中海馬組織中的NLRP1、Caspase-1 明顯升高，IL-1β表達增加，驗證NLRP1 炎癥小體依賴的焦亡參與癲癇發(fā)病過程。這些研究表明癲癇可出現細胞焦亡現象，那么在匹羅卡品誘導的慢性自發(fā)性癲癇過程中炎癥激活是否與海馬齒狀回NLRP3 的細胞焦亡相關？本文進一步研究發(fā)現癇性發(fā)作后各時間點海馬齒狀回區(qū)NLRP3、caspase-1 陽性表達及海馬區(qū)NLRP3、Caspase-1 mRNA明顯高于對照組，在慢性自發(fā)性癲癇形成后達到頂峰，說明NLRP3與慢性自發(fā)性癲癇激活炎癥因子有關。

圖1 各組大鼠海馬齒狀回NLRP3表達（免疫組化染色，×400）

圖2 各組大鼠海馬齒狀回Caspase-1表達（免疫組化染色，×400）

綜上所述，在慢性自發(fā)性癲癇形成過程中，NLRP3可能激活Caspase-1，誘發(fā)炎癥反應，從而導致癲癇反復發(fā)作。但本實驗未設置陽性藥物干預組進行驗證，需要進一步研究。