黃夢瑤，童 昕，蔣 斌

（中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院廣東省腦功能與腦疾病研究重點(diǎn)實驗室，廣東廣州 510080）

食欲素（orexin 或hypocetin）是由下丘腦外側(cè)區(qū)食欲素神經(jīng)細(xì)胞合成和分泌的興奮性神經(jīng)肽，分為Orexin A 和Orexin B（hypocretin-1 and hypocretin-2），主要參與睡眠覺醒、能量代謝、獎賞與藥物成癮等重要生理功能的調(diào)節(jié)［1-5］。食欲素結(jié)合食欲素1 型受體（orexin 1 receptor，OX1R）或食欲素2 型受體（orexin 2 receptor，OX2R）后發(fā)揮生物學(xué)作用，在大腦皮層中以O(shè)X2R 的分布為主［6-8］。而在皮質(zhì)下，除了藍(lán)斑神經(jīng)元以O(shè)X1R 為主，OX2R 也占較大比例，食欲素與受體相結(jié)合后，通過降低鉀通道電導(dǎo)、激活鈉鈣離子交換體和非選擇性陽離子通道，提高神經(jīng)元興奮性，以及調(diào)節(jié)突觸傳遞等作用［6］。Orexin 神經(jīng)元胞體位于下丘腦外側(cè)區(qū)，以及穹隆周圍核，但其神經(jīng)纖維廣泛的投射至整個大腦皮質(zhì)區(qū)域，包括視皮層［9-11］。在小鼠的初級感覺皮層包括視皮層、體感皮層、運(yùn)動皮層的第6b 層（layer 6b，L6b）中均發(fā)現(xiàn)有一些神經(jīng)元可以被OX2R 的激動劑所激活產(chǎn)生高頻發(fā)放的動作電位，稱之為Orexin 敏感的神經(jīng)元［12］。然而皮層L6b 層的細(xì)胞種類繁多，根據(jù)神經(jīng)元的形態(tài)和電生理特性分為以下5 種類型：錐體神經(jīng)元（pyramidal neuron）、多極神經(jīng)元（multipolar spiny neuron）、水平朝向神經(jīng)元（“horizontally”oriented neuron）、倒置朝向神經(jīng)元（“inverted”neuron）、以及不定朝向神經(jīng)元（“tangentially”oriented neuron）［13］。為了明確小鼠視皮層L6b 中的Orexin敏感的神經(jīng)元的具體細(xì)胞類型，我們首先用細(xì)胞生物素（biocytin）標(biāo)記視皮層中L6b 對Orexin 敏感的細(xì)胞、外膝體注射逆行標(biāo)記熒光染料（CTB555）標(biāo)記L6b 反饋投射到外膝體的神經(jīng)元，再研究食欲素是否調(diào)控這些反饋投射到外膝體的神經(jīng)元接受第2/3 層的傳入的突觸傳遞及其機(jī)制。結(jié)果表明小鼠視皮層L6b 層中，Orexin B 敏感的神經(jīng)元主要是錐體神經(jīng)元和多極神經(jīng)元。外源Orexin B 受體的激動劑，顯著增強(qiáng)反饋投射到外膝體的神經(jīng)元接受2/3 層的神經(jīng)傳入的突觸傳遞。Orexin B通過增強(qiáng)第2/3 到L6b 錐體細(xì)胞的突觸傳遞和直接興奮L6b 層的錐體神經(jīng)元兩個途徑來強(qiáng)化L6b層細(xì)胞的活動，加強(qiáng)到外膝體的反饋控制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗所涉及的動物實驗獲得中山大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)［中山醫(yī)動倫（2018）第156號］，并嚴(yán)格遵循動物倫理要求進(jìn)行動物實驗操作。本實驗采用P19-P28 的雌雄C57BL/6J 小鼠（SPF 級，購于中山大學(xué)動物實驗中心）。分籠飼養(yǎng)，自由攝入水食，室溫控制在（22±1）℃，12-12 h晝夜循環(huán)光照。實驗動物嚴(yán)格遵守《中山大學(xué)實驗動物管理條例》，實驗后，動物尸體按照中山大學(xué)實驗動物管理辦法進(jìn)行處理。

1.2 腦立體定位注射逆行標(biāo)記熒光染料CTB555

選擇P19-P21 左右的C57 小鼠，稱重，按劑量1 mL/20 kg 體質(zhì)量，腹腔注射0.5%戊巴比妥鈉溶液使之麻醉。根據(jù)小鼠大腦立體定位圖譜確定外側(cè)膝狀體（lateral geniculate nucleus，LGN）的坐標(biāo)，將Bregma 定為零點(diǎn)（0，0，0），Bregma 后2.3 mm，中線左右（2.0～2.1）mm，用顱骨鉆打磨顱骨，鉆出合適大小的骨窗。注射濃度為2 mg/mL 的CTB555（Cholera Toxin Subunit B，Alexa FluroTM555 Conjugate，Invitrogen，USA）0.2 μL，注射速度控制在0.02 μL/min。為了保證足夠的注射量和擴(kuò)散面積，在相應(yīng)位置上注射兩個點(diǎn)。注射完畢后留針5～10 min。動物蘇醒后，正常條件下飼養(yǎng)。整個實驗過程中將小鼠置于恒溫37 ℃的電熱毯上，并涂上眼膏防止小鼠眼睛干燥。

1.3 視皮層腦片制備

選用P22-28 的健康C57BL/6J 小鼠，異氟烷麻醉，快速斷頭，打開顱骨，取出大腦放入氧飽和的冰冷切片液中，1 min 后轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的裝有冰冷切片液的平板中修塊，去除小腦組織，切下大腦枕葉，以橫斷面為底座用瞬間粘合膠固定到振動切片機(jī)平臺上，隨后立即倒入冰冷切片液浸沒腦組織，通以體積分?jǐn)?shù)95%O2和5%的CO2混合氣體。調(diào)整切片機(jī)速度為3，振幅7～8，將腦組織切成8～10 片300 μm 厚度的含有視皮層的冠狀腦片，后隨即轉(zhuǎn)移至氧飽和的人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF）中，34 ℃孵育30 min，后轉(zhuǎn)移至室溫使用。

1.4 腦片上記錄細(xì)胞的自發(fā)興奮性突觸后電位

用裝有電流鉗內(nèi)液的玻璃電極（內(nèi)含0.2%Biocytin，Sigma，USA），電流鉗方式鉗住皮層第6b層（L6b）中的神經(jīng)細(xì)胞，記錄L6b 中各種細(xì)胞上的自發(fā)興奮性突觸后電位（spontaneous excitatory postsynaptic potential，sEPSP；圖1、2）。待細(xì)胞穩(wěn)定下來后（約3 min），置換成含有100 nmol/L Orexin B（Tocris Bioscience，UK）的ACSF（其中含有興奮性和抑制性突觸受體的阻斷劑），給藥灌流3 min 后，再用普通ACSF 進(jìn)行洗脫，觀察被記錄的細(xì)胞是否能被Orexin B 的激動劑所興奮。本實驗通過PClamp 軟件可以實現(xiàn)封接電阻，串聯(lián)電阻和輸入電阻的讀取，并在實驗全程對串聯(lián)電阻進(jìn)行實時監(jiān)控，對于串聯(lián)電阻前后變化不超過20%的數(shù)據(jù)才進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.5 標(biāo)記L6b 神經(jīng)細(xì)胞類型

細(xì)胞載入Biocytin 后（至少持續(xù)記錄sEPSP 5 min），緩慢移出電極，保持細(xì)胞活性狀態(tài)，即刻將腦片轉(zhuǎn)移至40 g/L 多聚甲醛溶液中固定，避光保存于4 ℃冰箱。24 h 后，取出腦片盛放在12 孔板的小孔里，用0.01 mol/L PBS 溶液漂洗3～5 次。再將腦片放入體積分?jǐn)?shù)0.3% Triton-100 的PBS 中2 h。按1∶200 稀釋度加入Avidin 555（Streptavidin，Alexa Fluro 555 conjugate，Invitrogen corporation，USA），混勻后，用錫紙包裹，放置4℃冰箱過夜。后再用0.01 mol/L PBS 溶液漂洗，雙光子顯微鏡掃描拍照，觀察細(xì)胞的形態(tài)（圖1、2）。

1.6 自發(fā)興奮性突觸后電流和微小興奮性突觸后電流的記錄

外膝體注射CTB555 一周后的小鼠，異氟烷使之麻醉，斷頭，制作視皮層腦切片。電壓鉗模式下，鉗住經(jīng)CTB555 標(biāo)記的、反饋投射到外膝體的L6b 中的神經(jīng)元（圖3），將膜電位鉗制于-70 mv，記錄細(xì)胞的自發(fā)興奮性突觸后電流（spontaneous excitatory post synaptic current，sEPSC；圖4A），先用普通的ACSF 記錄3 min，然后換成含有100 nmol/L Orexin B（Tocris Bioscience，UK）的ACSF（其中含有興奮性和抑制性突觸受體的阻斷劑），給藥灌流3 min 后，再用普通ACSF 進(jìn)行洗脫。觀察外源Orexin B 給藥后，由LGN 逆行標(biāo)記的視皮層L6b 細(xì)胞是否產(chǎn)生內(nèi)向電流。

微小興奮性突觸后電流（miniature excitatory post synaptic current，mEPSC）與sEPSC 一樣，只是在灌流液ASCF 中分別加入Tetrodotoxin（TTX，1 μmol/L）、Picrotoxin（50 μmol/L）、CNQX（20 μmol/L）以及APV（100 μmol/L）阻斷所有突觸傳遞（圖4C）。通過比較Orexin B 加藥前后的振幅和頻率，判斷Orexin B 對Orexin B 敏感神經(jīng)元的作用是突觸前作用還是突觸后作用。

1.7 Evoked EPSC（eEPSC）的記錄

外膝體CTB555 注射一周后的小鼠，異氟烷使之麻醉，斷頭，制作視皮層腦切片。電壓鉗模式下，鉗住被經(jīng)CTB555 標(biāo)記的、反饋投射到外膝體的L6b 中的神經(jīng)元，將電極尖端直徑為125 μmol/L的雙極同心圓電極放置于視皮層的第5 層（L5），刺激來自L2/3 的傳入到該細(xì)胞的神經(jīng)傳入，記錄由電刺激L2/3 引起的AMPAR-EPSC（圖5、6）。實驗通過PClamp 軟件可以實現(xiàn)封接電阻，串聯(lián)電阻和輸入電阻的讀取，并在實驗全程對串聯(lián)電阻進(jìn)行實時監(jiān)控，對于串聯(lián)電阻前后變化不超過20%的數(shù)據(jù)才進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.8 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析

本實驗所以的電生理數(shù)據(jù)均由PClamp 軟件記錄并分析處理，mEPSC 數(shù)據(jù)由Minianalysis software 軟件分析，最后用GraphPad software 對數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗或方差分析。

2 結(jié)果

2.1 Orexin B 直接興奮小鼠視皮層第6b 層中的神經(jīng)元

為了探究小鼠視皮層L6b 中的神經(jīng)元細(xì)胞類型以及是否存在對Orexin B 敏感的神經(jīng)元，我們在P19-P28 C57BL/6J 小鼠視皮層離體腦片上，在電流鉗模式下，用含有0.2% biocytin 的記錄電極隨機(jī)鉗住細(xì)胞，記錄神經(jīng)元的興奮性突觸后電位（sEPSP）。由于哺乳動物神經(jīng)元的靜息電位離閾電位之間有一定的差值，因此我們通過改變灌流液ACSF 中的K+濃度，適當(dāng)降低神經(jīng)元的膜電位水平使細(xì)胞的膜電位接近閾電位水平。觀察Orexin B 灌流給藥3 min 后，記錄電位的變化。為了減少藥物干擾，所有實驗每個腦片只記錄一個細(xì)胞，實驗結(jié)束后立即將腦片轉(zhuǎn)移至40 g/L 的多聚甲醛中固定，后續(xù)通過免疫染色后，在雙光子顯微鏡下對細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)分析。結(jié)果顯示，小鼠視皮層L6b 中細(xì)胞的形態(tài)主要有錐體神經(jīng)元、多極神經(jīng)元、水平朝向神經(jīng)元、倒置朝向神經(jīng)元、以及不定朝向神經(jīng)元（圖1 A、D 和圖2A、D、G），結(jié)果與文獻(xiàn)報道的一致［13］。分析每種細(xì)胞對應(yīng)的電生理數(shù)據(jù)（圖1B、E 和圖2B、E、H）發(fā)現(xiàn)，小鼠視皮層中確實存在Orexin B 敏感的神經(jīng)元（圖1B、E）。通過外源激活Orexin B 受體可以直接對Orexin B敏感細(xì)胞產(chǎn)生興奮性調(diào)節(jié)效應(yīng)。其中大部分錐體細(xì)胞（58.1%）和多極細(xì)胞（52.9%；圖1 C、F）為Orexin B 敏感的神經(jīng)元。在Orexin B（100 nmol/L）作用3 min 后，細(xì)胞膜發(fā)生去極化并伴有成串的動作電位，且隨著正常的ACSF 洗脫，動作電位的頻率降低。然而水平朝向神經(jīng)元、不定朝向神經(jīng)元和倒置朝向神經(jīng)元在Orexin B（100 nmol/L）作用前后膜電位水平無明顯變化（圖2B、E、H）。說明水平朝向神經(jīng)元、不定朝向神經(jīng)元和倒置朝向神經(jīng)元為Orexin B 不敏感神經(jīng)元。

圖1 Orexin B 直接興奮小鼠視皮層第6b 層中的錐體神經(jīng)元和多極神經(jīng)元Fig.1 Orexin B directly excited the pyramidal neuron and multipolar spiny neuron in layer 6b of visual cortex

圖2 小鼠視皮層第6b 層中水平朝向神經(jīng)元、不定朝向神經(jīng)元和倒置朝向神經(jīng)元為食欲素不敏感神經(jīng)元Fig.2 Horizontally oriented neurons，inverted neurons and tangentially oriented neurons were Orexin B-insensitive neurons in layer 6b of visual cortex

2.2 逆行標(biāo)記熒光染料CTB555標(biāo)記視皮層第6b層中的神經(jīng)元

視皮層L6b 同時接收來自第2/3 層纖維自上而下的傳入，同時也接受來自外膝體纖維自下而上的傳入。因此視皮層中L6b 也是一個重要的輸出層，反饋投射到LGN 以及其它間腦核團(tuán)。為了標(biāo)記視皮層第6b 中的神經(jīng)元，我們在小鼠兩側(cè)的LGN 中注射逆行病毒標(biāo)記物CTB555（圖3A），7～10 d 后切腦片在雙光子顯微鏡下觀察病毒標(biāo)記情況。結(jié)果（圖3B）所示，病毒染料CTB555 成功標(biāo)記了視皮層L6b 中的神經(jīng)元，即第6b 層中反饋投射至LGN 的神經(jīng)元。

2.3 Orexin B 增大視皮層第6b 層中投射到外側(cè)膝狀體的神經(jīng)細(xì)胞的興奮性突觸后電流的振幅

為了研究Orexin B 對視皮層L6b 層中投射至LGN 的神經(jīng)元的興奮性突觸后電流（sEPSC）的作用，我們在電壓鉗模式下，采用全細(xì)胞記錄模式，記錄被CTB555 標(biāo)記的紅色熒光細(xì)胞的sEPSC（圖4），在被CTB555標(biāo)記的紅色熒光細(xì)胞上，直接激活Orexin B受體可以記錄到去極化電流（圖4A）。為了研究Orexin B 的濃度與去極化電流之間的關(guān)系。采用10、20、50、100 和200 nmol/L 進(jìn)行濃度梯度灌流，相關(guān)系數(shù)為0.7168，P=0.0212，發(fā)現(xiàn)兩者之間為正相關(guān)關(guān)系，且100 nmol/L時引起的去極化電流已達(dá)到最大值［10 nmol/L：（24.78±2.03）pA，n=13 cells，8 mice；20 nmol/L：（53.12±2.24）pA，n=13 cells，6 mice；50 nmol/L：（74.56±2.66）pA，n=17 cells，8 mice；100 nmol/L：（79.5±2.41）pA，n=12 cells，7 mice；200 nmol/L：（83.56±2.36）pA，n=12 cells，7 mice；圖4B；F=99.69，P＜0.000 1］。

圖3 標(biāo)記小鼠視皮層第6b 層中投射至外側(cè)膝狀體的神經(jīng)元Fig.3 Neurons in L6b of visual cortex projecting to the dorsal lateral geniculate nucleus labeled by CTB555

為了進(jìn)一步研究Orexin B 引起的去極化效應(yīng)是源于突觸前還是突觸后，我們在ACSF 中分別加入Tetrodotoxin（TTX，1 μmol/L），Picrotoxin（50 μmol/L）、CNQX（20 μmol/L）以及APV（100 μmol/L）阻斷所有突觸傳遞并記錄微小興奮性突觸后電流（mEPSC），將細(xì)胞鉗制于-70 mv，穩(wěn)定記錄3～5 min，后切換含Orexin B 的灌流液，記錄5～8 min，用mini-analaysis 分析統(tǒng)計mEPSC 的振幅和頻率（圖4C）。發(fā)現(xiàn)Orexin B 增加了mEPSC 的振幅［Ctr：（9.36±0.034）pA，Orexin B：（11.51±0.036）pAn=19 cell from 7 mice，pairedt-test，P=0.03］但其頻率沒有變化［Ctr：（1.48±0.08）Hz，Orexin B：（1.55±0.09）Hz，n=19 cell from 7 mice，pairedt-test，P=0.67］，該結(jié)果說明Orexin 增強(qiáng)突觸傳遞是通過突觸后效應(yīng)（圖4D）。

2.4 Orexin B 增強(qiáng)視皮層第6b 層中投射到LGN的神經(jīng)細(xì)胞接受第2/3 層神經(jīng)傳入的突觸傳遞

為了探究Orexin B 是否調(diào)節(jié)L6b 的Orexin B敏感神經(jīng)元接受第2/3 神經(jīng)傳入的突觸傳遞，用金屬電極刺激來自第2/3 的神經(jīng)傳入，電壓鉗鉗住L6b 中被CTB555 標(biāo)記的熒光細(xì)胞，記錄興奮性突觸后電流（eEPSC）。將細(xì)胞膜電阻變化前后不超過10%，系列電阻變化不超過15%的記錄細(xì)胞數(shù)據(jù)納入分析（圖5A）。Orexin B 加入后，EPSC 逐漸增大，到藥物開始洗脫時EPSC 達(dá)到最大值，隨著洗脫減小，最后趨于平緩（圖5A、C）。EPSCs的記錄為每15 s 給予一對刺激，刺激時間間隔為0.1 s（圖5A），通過對配對脈沖比率（paired-pulse ratio，PPR）的值（PPR=P2/P1，P1 和P2 分別為第1個刺激和第2 個刺激誘發(fā)EPSC 的振幅大?。?。

Orexin B 加藥之前PPR 為1.21±0.05，加藥后PPR 為1.17±0.05（n=20 cells，pairedt-test，P=0.64；圖5B），加藥前后PPR 無顯著變化，因此Orexin B 對L6b 中其敏感神經(jīng)元上來自第2/3 層的輸入纖維突觸傳遞的增強(qiáng)作用是突觸后效應(yīng)。為了探究Orexin B 對L6b 層中來自2/3 層傳入纖維的突觸傳遞的增強(qiáng)是否也存在劑量依賴性效應(yīng)，我們分別用不同濃度的Orexin B 20、50 和100 nmol/L 的Orexin B 重復(fù)上述實驗。發(fā)現(xiàn)Orexin B濃度越大，加藥后突觸后電流（EPSC）增大越明顯［加入Orexin B并洗脫后20～25 min，100 nmol/L：（130±2.5）%，n=19 cells，8 mice；50 nmol/L：（117±2.7）%，n=10 cells，5 mice；20 nmol/L：（105±1.8）%，n=9 cells，5 mice；圖5D，F(xiàn)=19.86，P＜0.000 1］。

圖4 Oreixn B 在視皮層第6b 層中投射至LGN 的Orexin B 敏感神經(jīng)元的sEPSC 和mEPSC 的效應(yīng)Fig.4 The effects of Orexin B on the sEPSC and mEPSC in Orexin-sensitive neurons in layer 6b of visual cortex

圖5 Orexin B 增強(qiáng)視皮層L6b 層中Orexin 敏感神經(jīng)元上接受第2/3 層神經(jīng)傳入通路的突觸傳遞Fig.5 Orexin B enhanced the synaptic transmission onto Orexin B-sensitive neurons in layer 6b from layer 2/3 input

2.5 Orexin B 的突觸傳遞增強(qiáng)效應(yīng)由ORX2 介導(dǎo)，mGluR5 的參與，并激活PLC 引起胞內(nèi)Ca2+上調(diào)而產(chǎn)生

為探索Orexin B 增強(qiáng)第2/3 層傳遞到Orexin B敏感神經(jīng)元的突觸傳遞的具體機(jī)制，我們首先加入OX2R 受體的阻斷劑TCS OX2R 29（10 μmol/L），發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)現(xiàn)象被阻斷［加入Orexin B 并洗脫后20～25 min，（Ctr：（119.33±2.51）%，n=15 cells，7 mice；TCS OX229：（103.17±2.75）%，n=30 cells，10 mice）；圖6A；unpairedt-test，P=0.000）］。為了研究OX2R 受體激活后引起的細(xì)胞內(nèi)分子機(jī)理，我們加入磷脂酶C（phospholipases C，PLC）的阻斷劑U173332 后，Orexin B 的增強(qiáng)作用也被阻斷［Ctr：（125.51±1.4）%，n=11 cells，5 mice；U173332：（103.89±1.04）%，n=10 cells，5 mice；圖6B，unpairedt-test，P=0.000］，表明OX2R 受體激活后，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的PLC 活性上調(diào)。在電極內(nèi)液中加入BAPTA（胞內(nèi)Ca2+的螯合劑10 mmol/L），細(xì)胞破膜形成全細(xì)胞模式5 min 后開始記錄，以使BAPTA 擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞。在BAPTA 存在的情況下，Orexin B 的增強(qiáng)效應(yīng)也完全被阻斷［Ctr：（125.54±1.53）%，n=11 cells，5 mice；BAPTA：（102.86±1.7）%，n=9 cells，4 mice；圖6C；unpairedt-test，P=0.000）］。因此，Orexin B 的增強(qiáng)作用需要胞內(nèi)Ca2+水平升高。加入受體mGluR5 的拮抗劑，MPEP（10 μmol/L），Orexin B 的增強(qiáng)效應(yīng)也被阻斷［Ctr：（126.14±3.87）%，12 cells，5 mice；MPEP：（106.32±2.65）%，n=12 cells，6 mice，unpairedttest，P=0.000］，表明Orexin B 調(diào)控第2/3 層傳入到L6b 中的orexin 敏感神經(jīng)元的突觸增強(qiáng)效應(yīng)是由ORX2 介導(dǎo)，mGluR5 的參與，并激活PLC 引起胞內(nèi)Ca2+上調(diào)而引起。

圖6 Orexin B 增強(qiáng)食欲素敏感神經(jīng)元接受第2/3 層神經(jīng)傳入的突觸傳遞的機(jī)制Fig.6 The mechanisms of Orexin B to enhance synaptic transmission onto Orexin B-sensitive neurons from layer2/3 inputs

3 討論

大腦皮層由6層組成，各層中呈現(xiàn)出不同的神經(jīng)細(xì)胞類型以及不同的神經(jīng)連接。作為多形細(xì)胞層的第6 層又分為位于淺部的第6a 層（L6a）和深部臨近白質(zhì)（white matter，WM）的6b 層（L6b）［14-16］。盡管有報道［12］發(fā)現(xiàn)視皮層L6b 亞層中的一些細(xì)胞對Orexin 敏感，即激活Orexin B 可以直接興奮L6b中的一些神經(jīng)元。但沒有明確具體的神經(jīng)細(xì)胞類型。本研究發(fā)現(xiàn)Orexin B 能直接興奮第6 層中的大部分的錐體神經(jīng)元和多極神經(jīng)元，但Orexin B不直接興奮L6b 中的水平朝向神經(jīng)元，倒置朝向神經(jīng)元和不定朝向神經(jīng)元。我們還發(fā)現(xiàn)在L6b 中由CTB555 標(biāo)記的、反饋投射到外膝體的神經(jīng)元92.5%為錐體神經(jīng)元，且這些錐體神經(jīng)元中有63.3%對Orexin 敏感［17］，因此，Orexin B 除了直接興奮由外膝體逆行標(biāo)記的錐體神經(jīng)元和多極神經(jīng)元外，還增強(qiáng)第2/3 層傳入到位于L6b 中由CTB 555 標(biāo)記的，反饋投射到外膝體的錐體神經(jīng)元之間的突觸傳遞。

探索L6b 中Orexin 敏感細(xì)胞的形態(tài)和神經(jīng)連接以及Orexin 在視皮層內(nèi)部突觸傳遞中的效應(yīng)對理解Orexin 在視覺處理中的作用至關(guān)重要。視覺信號由視網(wǎng)膜傳送到丘腦的外膝體，信號經(jīng)處理后主要傳遞到視皮層第4 層，少量傳至到第2/3 層以及第5/6 層［18-19］，而視皮層的第6 層也將接受視皮層第2/3 層的信號反饋傳遞給丘腦背側(cè)外膝體（dLGN）和丘腦側(cè)后核群（LP），從而形成重要的反饋環(huán)路［20-21］。第6 層到外膝體的反饋環(huán)路在視覺信息的篩選和精練中起重要作用。第6 層細(xì)胞的活動加強(qiáng)，即加強(qiáng)了L6b 細(xì)胞到外膝體的反饋控制可以銳化LGN 的視覺信息并傳到第4 層，因此，第6 層細(xì)胞是外膝體信息傳入的監(jiān)控器，放大或減弱LGN 到視皮層的信息輸入［22］。研究結(jié)果提示：Orexin B 通過增強(qiáng)第2/3 到第6 層錐體細(xì)胞的突觸傳遞和直接興奮第6 層的錐體神經(jīng)元兩個途徑來強(qiáng)化第6 層細(xì)胞的活動，加強(qiáng)到外膝體的反饋控制。由于Orexin 的主要作用是維持動物的覺醒狀態(tài)［1-2］，據(jù)此推測動物在清醒的狀態(tài)，投射到視皮層的Orexin 系統(tǒng)激活后強(qiáng)化第6 層細(xì)胞的活動，可使動物在清醒、警覺的狀態(tài)下更為有效地對視覺信息有效的篩選，增強(qiáng)視皮層對視覺信息的分辨率。

食欲素直接興奮大腦中的某些神經(jīng)元，特別是在感覺皮層的機(jī)制已有詳細(xì)的報道［12］，Orexin使神經(jīng)元產(chǎn)生緩慢而持久的去極化，這種變化足以使神經(jīng)元爆發(fā)動作電位，若神經(jīng)元已經(jīng)爆發(fā)動作電位，Orexin 則可以提高其放電頻率。概括起來，Orexin 對神經(jīng)元的去極化可歸因于三個機(jī)制：①在靜息電位時關(guān)閉鉀離子通道［23］；②Na+/Ca2+交換器的激活［24-25］；③非選擇性陽離子通道（NSCCS）的激活［26-27］。我們的結(jié)果表明在視皮層，Orexin B 選擇性地作用于L6b 中的錐體神經(jīng)元。Orexin B 增加了mEPSC 的振幅，但頻率卻不受影響，表明Orexin B 對L6b 中的錐體神經(jīng)元的作用是通過直接的突觸后作用。第6 層錐體細(xì)胞膜上的OX2R 在Orexin B 的激活下發(fā)揮作用。

盡管已有研究表明初級視皮層第6b 是對Orexin有反應(yīng)的唯一亞層［12］。然而Orexin B參與對第6b層其敏感的神經(jīng)元接受的傳入纖維的突觸傳遞的調(diào)控至今未見報道。本文研究了Orexin B 調(diào)節(jié)小鼠視皮層L6b 層錐體神經(jīng)元接受來自L2/3 信息傳入的突觸傳遞的效應(yīng)以及生理學(xué)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)Orexin B 增強(qiáng)L6b 的錐體神經(jīng)元接受第2/3 層傳入纖維的突觸傳遞，這種突觸增強(qiáng)效應(yīng)由ORX2 介導(dǎo)，mGluR5 的參與，并激活PLC 引起胞內(nèi)Ca2+上調(diào)而引起。在視覺信息傳遞過程中，通過接收L2/3的前饋傳入，從而增強(qiáng)第6b 錐體細(xì)胞的興奮性。