潘 磊，宋麗娟，高 桐，郭 瑞，王紅波，陳禪友

（江漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/湖北省食用豆類植物自然科技資源中心/湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430056）

【研究意義】菜豆（Phas eolus vul garis L.）（2 N=2X=22）為豆科菜豆屬的一年生草本植物，是主要的食用豆類蔬菜之一。目前學(xué)術(shù)界認(rèn)為菜豆有兩個獨立起源中心，分別是“南墨西哥及中美中心”和“南美洲中心”[1]。菜豆又被稱為四季豆、蕓豆、玉豆等，在世界范圍內(nèi)廣泛種植，而我國的菜豆栽培面積和產(chǎn)量居于世界前列[2]。據(jù)記載，菜豆在15世紀(jì)傳入中國，栽培歷史較長，類型豐富，分布廣，種植面積大。截至2016年3月，經(jīng)過中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院編目入庫的菜豆（粒用類型為主）約有5 677份[3]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，依據(jù)生長習(xí)性，可將菜豆劃分為直立型和蔓生型[4]；依據(jù)用途，又可分為粒用菜豆和莢用菜豆。隨著市場需求的變化，培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)抗性好的菜豆品種，一直是菜豆育種的主攻方向。對不同種質(zhì)資源的遺傳背景進行分析，區(qū)分種質(zhì)間的差異，鑒定親緣關(guān)系，遺傳多樣性評價等，對于育種具有重要意義。因此，利用分子標(biāo)記技術(shù)進行輔助育種成為當(dāng)前育種的研究焦點之一?！厩叭搜芯窟M展】插人/缺失（InDel，insertion/deletion）標(biāo)記是指在近緣種或者同一個物種不同個體之間的基因組同一位點的序列發(fā)生的不同大小核苷酸片段的插入或缺失，是同源序列比對產(chǎn)生的空位現(xiàn)象[5-6]。InDel在基因組上數(shù)量多，分布廣。InDel分子標(biāo)記本質(zhì)上仍然屬于DNA序列長度多態(tài)性的標(biāo)記。InDel標(biāo)記作為一種共顯性的分子標(biāo)記，準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好，而且以PCR擴增技術(shù)為基礎(chǔ)，檢測方便，經(jīng)濟有效。目前，InDel標(biāo)記已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物的分子基礎(chǔ)研究中，進行基因型鑒定、遺傳多樣性分析、基因定位以及功能標(biāo)記開發(fā)等。楊雙娟等[7]采用甘藍InDel標(biāo)記進行種子純度鑒定分析。魏利斌等[8]利用InDel分子標(biāo)記進行芝麻遺傳多樣性分析，可將國內(nèi)和國外芝麻資源劃分為兩大類，且絕大多數(shù)芝麻材料的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。利用番茄粉紅色果實相關(guān)基因的InDel標(biāo)記，能有效區(qū)分紅色、粉紅色和雜合基因型，可以用于番茄苗期分子標(biāo)記輔助選擇[9]。在水稻中，采用InDel標(biāo)記能判別水稻的秈粳屬性，鑒別不同品種類型[10-12]?；?9個多態(tài)性InDel標(biāo)記，構(gòu)建了42個綠豆主栽品種的DNA指紋圖譜，能鑒定綠豆品種真?zhèn)蝃13]。【本研究切入點】然而，在菜豆的InDel分子標(biāo)記研究與應(yīng)用方面，目前知之甚少，在為數(shù)不多的研究報道中，Moghaddam等[14]基于二代測序技術(shù)在菜豆中開發(fā)了2 687InDel分子標(biāo)記，并對24個國外菜豆品種進行檢測，篩選獲得了172個多態(tài)性InDel標(biāo)記?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究嘗試將InDel標(biāo)記應(yīng)用于我國菜豆種質(zhì)資源，分析其遺傳多樣性和遺傳關(guān)系，從而為菜豆遺傳資源的保護和遺傳改良等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究中供試的25份菜豆種質(zhì)材料，均由湖北省食用豆類植物自然科技資源中心和湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)中心提供（表1）。

表1 供試25份菜豆種質(zhì)資源信息列表Tab.1 Information of 25 common bean accessions used in this study

1.2 實驗方法

1.2.1 菜豆基因組總DNA的提取純化及檢測 使用植物DNA提取試劑盒（北京天根生物科技有限公司），提取菜豆基因組總DNA，具體步驟方法參見試劑盒說明書。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測進行DNA檢測。采用mySPEC超微量分光光度計（mySPEC，奧地利）測定DNA質(zhì)量和濃度。

1.2.2 引物的設(shè)計和PCR的擴增 菜豆InDel分子標(biāo)記引物序列參考Moghaddam等[14]，引物序列見表2，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 PCR擴增體系 采用25μL反應(yīng)體系，其中2.5μL 10×buffer（含Mg2+），2.5μL dNTP（2.5 mmol/L），0.3μL Taq酶（5 U/μL），正向和反向引物各1μL（10μmol/L），DNA模板（50 ng/μL）1μL，ddH2O補足25μL。

在Nexus gradient梯度PCR儀（Eppendorf，德國）上進行擴增，反應(yīng)程序為：95℃，預(yù)變性3 min；35個循環(huán)（95℃，40 s，最適退火溫度，40 s，72℃，40s）；72℃延伸10 min。4℃保存?zhèn)溆?。?0 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增的產(chǎn)物，用自動凝膠成像系統(tǒng)進行拍照記錄。對于沒有出現(xiàn)電泳條帶的DNA樣本重復(fù)進行PCR擴增。若重復(fù)3次仍無擴增產(chǎn)物，則認(rèn)為擴增引物無效。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 菜豆籽粒農(nóng)藝性狀評價方法 對25個不同的菜豆種質(zhì)，每個材料每次取50粒，重復(fù)3次，觀測記錄籽粒相關(guān)的農(nóng)藝性狀指標(biāo)。用游標(biāo)卡尺測量籽粒長度、籽粒寬度、籽粒厚度，觀察種皮顏色，用天平稱量50粒質(zhì)量，再換算成百粒質(zhì)量。

表2 菜豆中12個多態(tài)性InDel分子標(biāo)記Tab.2 Twelve polymorphic InDel molecular markers in common bean

1.3.2 InDel分子標(biāo)記評價方法 將擴增產(chǎn)物的帶型錄入Excel，采用PopGen32[15]軟件計算遺傳參數(shù)分析，包括期望雜合度（He，expected heterozygosity）、觀察雜合度（Ho，observed heterozygosity）、引物多態(tài)性信息含量（PI C，polymorphism information content）、有效等位基因數(shù)（Ne，effective number of alleles per loci）和遺傳多樣性指數(shù)（I，Shannon’s Information index）。構(gòu)建25個菜豆種質(zhì)的0，1矩陣，采用NTSYS-pc 2.11軟件[16]進行UPGMA聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1 菜豆種子表型變異

供試25份菜豆種子表型變異比較結(jié)果（表3），單粒長度變異區(qū)間均在0.19 cm（SJ0182）～0.34 cm（-）（SJ0156），單粒寬度變異區(qū)間在0.12 cm（SJ0225）～0.20 cm（SJ0193），單粒厚度變異區(qū)間在0.10 cm（SJ0181）～0.19 cm（SJ0193），百粒質(zhì)量變異區(qū)間在19.06 g（SJ0187）～53.00 g（SJ0179）。種皮的顏色大致可劃分為純色和花色兩個系列。純色主要包括為黃色（7份）、黑色（5份）、白色（4份）和紅色（1份）；而種皮花色的類型包括紅色帶黃斑（4份）、黃色帶紅斑（2份）、紅色帶白斑（1份）和黃色帶白斑（1份）。

表3 25份菜豆籽粒統(tǒng)計分析Tab.3 Statistic analysis of seeds variation of 25 common bean accessions used in this study

圖1 25份菜豆種子表型Fig.2 Seeds of 25 common bean accessions in this study.Cluster of 25 common bean accessions based on UPGMA.

2.2 菜豆InDel標(biāo)記多態(tài)性分析

利用12對InDel多態(tài)性引物對25份菜豆種質(zhì)資源進行了檢測（圖2），共探測到26個InDel位點（表4），平均位點數(shù)是2.17個。引物的平均有效等位位點數(shù)為1.78個，多態(tài)信息含量P IC平均值是0.33，期望雜合度（He）平均值為0.42，觀察雜合度（Ho）平均值為0.52，群體的遺傳多樣性指數(shù)I為0.63。

圖2 InDel引物NDSU_IND_09_00.4358的多態(tài)性電泳Fig.2 Polymorphism of the amplification products using InDel primer NDSU_IND_09_00.4358

表4 12個InDel標(biāo)記在25份菜豆種質(zhì)中的多態(tài)性信息Tab.4 Genetic variation of twelve polymorphic InDel markers in 25 common bean accessions

2.3 菜豆種質(zhì)資源的聚類分析

為探尋供試菜豆資源之間的遺傳關(guān)系，對25份菜豆種質(zhì)資源進行UPGMA聚類分析（圖3）。聚類結(jié)果表明，遺傳相似性系數(shù)在0.5～0.95，相似系數(shù)為0.54時，供試的菜豆材料可分為5類。

第I類7份材料（SJ0156、SJ0185、SJ0160、SJ0227、SJ0201、SJ0203和SJ0243），第II類5份材料（SJ0180、SJ0209、SJ0181、SJ0182和SJ0215），第III類5份材料（SJ0179、SJ0225、SJ0192、SJ0193和SJ0222），第IV類4份材料（SJ0162、SJ0202、SJ0226和SJ0245），第V類4份材料（SJ0187、SJ0232、SJ0229和SJ0234）。

進一步分析發(fā)現(xiàn)，聚類結(jié)果與其種皮顏色存在一定相關(guān)性。第I類的7份材料中大多數(shù)純色類型，其中黃色3份（SJ0227、SJ0201、SJ0243、SJ0185）、黑色2份（SJ0160、SJ0203）、紅色1份（SJ0156）；第II類5份材料中以純色類型為主，籽粒多為白色，其中白色3份（SJ0180、SJ0181、SJ0215），黑色1份（SJ0182），SJ0209的種皮雖然是花色，但也存在白色斑點區(qū)域；第III類5份材料的籽粒以花色類型為主，共有4份花色材料（SJ0179、SJ0225、SJ0192、SJ0193），種皮具有紅斑、黃斑或者白斑；第IV類4份材料的籽粒以花色類型為主，大多與黃色相關(guān)，其中3份材料的種皮為全黃色（SJ0162）或部分黃色（SJ0202、SJ0226）；第V類的4份材料的籽粒都為純色，多為黃色類型（SJ0232、SJ0229、SJ0234），另有一份黑色類型（SJ0187）。綜上，純色系列包括第I、II、V類（黃色、黑色、白色、紅色），花色系列包括第III、IV類（黃色帶紅斑、紅色帶黃斑、紅色帶白斑）。這種色系的遺傳差異可能是由于在進化過程中受到人工選擇的影響而造成的。

此外，在遺傳相似系數(shù)為0.95時，有兩份菜豆材料雖然種皮顏色不同（SJ0180為白色和SJ0209為黃色帶白斑），但是本研究中的InDel標(biāo)記無法區(qū)分兩者，可能是由于兩者的親緣關(guān)系較近，InDel標(biāo)記數(shù)量不夠而造成的。

圖3 25份菜豆種質(zhì)資源的UPGMA聚類分析Fig.3 Cluster of 25 common bean accessions based on UPGMA

3 討論

InDel標(biāo)記是一種共顯性分子標(biāo)記，在基因組上分布廣泛，密度大，適宜于進行全基因組分子標(biāo)記的發(fā)掘[17]。當(dāng)前隨著高通量測序技術(shù)的不斷進步，InDel標(biāo)記開發(fā)成本逐漸降低[18]。InDel標(biāo)記的實質(zhì)是一種DNA片段長度多態(tài)性遺傳標(biāo)記，能利用PCR擴增進行基因型分型，檢測技術(shù)快捷經(jīng)濟，可在電泳平臺上進行。因此，InDel標(biāo)記是近年來一種較為熱門的DNA分子標(biāo)記技術(shù)，廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源分析、分子輔助遺傳育種、群體遺傳分析、圖位克隆、基因定位及遺傳圖譜的構(gòu)建等研究[12][19]。在農(nóng)作物研究領(lǐng)域，InDel分子標(biāo)記技術(shù)已在水稻[20]、玉米[21]、油菜[22]、黃瓜[23]等作物研究中進行了報道。但是，在菜豆中的In-Del研究還十分有限，尤其是針對菜豆種子遺傳變異的InDel標(biāo)記研究尚未見報道。

然而，評價菜豆種子的遺傳多樣性，揭示個體間的遺傳背景差異和親緣關(guān)系，對于菜豆育種而言是十分重要而且必要的。因此，本研究引入InDel標(biāo)記技術(shù)，用于分析我國菜豆種子的遺傳變異特點。通過多個遺傳多樣性參數(shù)（觀測雜合度、期望雜合度、有效等位數(shù)、引物多態(tài)信息含量等）分析，反映出供試菜豆種質(zhì)資源具有中等水平的遺傳多樣性。其中，P IC值是評判基因片段多態(tài)性的重要參數(shù)之一。12對InDel引物的平均P IC＞0.3，多態(tài)性程度較高，能有效區(qū)分基因型之間的差異，其中兩個InDel引物（NDSU_IND_09_00.4358和NDSU_IND_01_05.0609）的PI C＞0.5，將有利于應(yīng)用在菜豆的遺傳多樣性分析和遺傳圖譜構(gòu)建等研究中。為研究不同菜豆材料之間的遺傳關(guān)系，基于12對InDel多態(tài)性引物對25分菜豆種質(zhì)材料的結(jié)果，進行UPGMA聚類分析，可將其分為5類。聚類結(jié)果表明供試種質(zhì)的地區(qū)間分類界限不明顯，但是絕大多數(shù)材料的聚類與種皮顏色有關(guān)，可大致區(qū)分純色和花色的種皮，推測這種種皮顏色的遺傳差異，可能是受到人工選擇的影響。此外，有兩個菜豆材料無法區(qū)分開來，可能需要更多的多態(tài)性InDel分子標(biāo)記。

綜上，本研究將12對菜豆InDel多態(tài)性引物成功應(yīng)用于25份菜豆材料的分子標(biāo)記研究。研究結(jié)果不僅揭示了供試菜豆種質(zhì)的中等遺傳多樣性水平，也反映出了不同種質(zhì)之間的遺傳關(guān)系，還能用于品種DNA指紋圖譜的構(gòu)建。因此，本研究將為菜豆遺傳資源的評價、鑒定和保護利用等提供分子依據(jù)。