張麗靜，扎羅，范蓓，李文義，付勱，王鳳忠，*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京100193；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)研究所，西藏拉薩850000）

蕪菁（Brassica rapa L.）是青藏高原上的一種古老植物，是十字花科蕓苔屬蕪菁種的兩年生草本植物，又稱為蔓菁、圓根（西藏通稱），上部膨大形成扁圓形的肉質(zhì)塊根，外形似圓蘿卜，可以當(dāng)作蔬菜食用，能夠適應(yīng)高海拔氣候，距今已有1 000多年的種植歷史[1]。據(jù)文獻(xiàn)記載，蕪菁具有抗缺氧、抗疲勞、治療水土不服等癥狀的作用[2]?，F(xiàn)代研究表明，蕪菁中含有大量的黃酮、皂苷、糖苷、生物堿、揮發(fā)油等生物活性成分[3-5]，具有降血脂、降血糖及抗菌及耐缺氧等功效[6]。

研究表明，在機(jī)體正常生理代謝過程中，自由基的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡的狀態(tài)，而當(dāng)機(jī)體受到外源性物質(zhì)干擾或內(nèi)源性損傷時，會打破這種平衡狀態(tài)，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，使活性氧在體內(nèi)堆積，干擾細(xì)胞的正常代謝，并產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，影響器官的正常生理功能[7]，并與心腦血管疾病、炎癥、癌癥等多種疾病密切相關(guān)[8]。越來越多的研究表明，通過膳食補(bǔ)充抗氧化成分有助于調(diào)節(jié)人體內(nèi)的自由基水平，從而有助于維持體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平處于平衡狀態(tài)[9]。因此，開發(fā)具有抗氧化應(yīng)激活性的功能食品逐漸受到關(guān)注[10]。

蕪菁在西藏地區(qū)有著長期廣泛的栽培歷史，有很大開發(fā)利用的空間，但目前對西藏地區(qū)蕪菁的研究大多數(shù)集中在栽培[11]以及活性成分提取分離[12-13]方面，尚未見到有關(guān)不同地區(qū)蕪菁營養(yǎng)功能成分含量和抗氧化應(yīng)激活性評估研究方面的報道。因此，本研究分析了西藏昌都9個不同地區(qū)的蕪菁中總黃酮及皂苷的含量，分析其抗氧化活性，以期挖掘藏區(qū)資源，提高資源的利用率，為開發(fā)適用于進(jìn)藏游客、高原部隊及高原地區(qū)居民等人群緩解高原反應(yīng)的抗缺氧功能產(chǎn)品提供科學(xué)理論依據(jù)及研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蕪菁樣品：西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院提供，采自西藏自治區(qū)昌都地區(qū)的9個不同產(chǎn)區(qū)，分別為察雅縣、丁青縣、類烏齊縣、洛隆縣、長若區(qū)、貢覺縣、八宿縣、江達(dá)縣、邊壩縣，樣品采回后，將塊莖進(jìn)行清洗、切片、冷凍干燥、粉碎后保存?zhèn)溆?；RAW264.7細(xì)胞：協(xié)和細(xì)胞庫購買，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所保存。

蘆丁對照品、噻唑藍(lán)[3-（4，5-dimethylthylthiazol-2-yl）-2，5 diphenyltetrazolium broide，MTT]：美國 Sigma公司；薯蕷皂苷元：北京索萊寶科技有限公司；總抗氧化能力檢測試劑盒（ABTS）：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液以及胰蛋白酶：美國Gibco公司，胎牛血清、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）：美國 Hyclone公司；活性氧DCFH-DA探針：美國Invitrogen公司；乙醇、石油醚（國產(chǎn)分析純）：北京化工廠；亞硝酸鈉、硝酸鋁（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；氫氧化鈉（優(yōu)級純）：阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Spectra Max 190酶標(biāo)儀：美國Molecular Device公司；105-18c真空冷凍干燥機(jī)：上海比朗儀器制造有限公司；AL204分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HH-1恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；DHG-9203A鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；IKA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：美國IKA公司；HERAcell CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱：美國賽默飛公司；FACS Calibur流式細(xì)胞分析儀：美國Becton-Dickinson公司。

1.3 方法

1.3.1 蕪菁提取液的制備

參考文獻(xiàn)[14]的提取液制備方法并略作修改。在燒杯中加入一定量的蕪菁干燥粉末，按照1∶50（g/mL）的料液比加入石油醚，攪拌45 min后浸泡24 h，通過旋轉(zhuǎn)蒸餾除去石油醚脫脂并抽濾，將濾渣自然揮干后備用。準(zhǔn)確稱取5 g濾渣，加入60%的乙醇后超聲處理30 min，隨后進(jìn)行離心，過濾除渣，用60%的乙醇定容至250 mL，獲得蕪菁提取液，儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品中總黃酮含量的檢測

精密稱取蘆丁對照品10 mg，加入60%的乙醇定容至50 mL容量瓶中，搖勻，制備蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為 200 μg/mL），保存?zhèn)溆肹15]。分別量取 0、0.5、1、2、3、4 mL蘆丁對照品溶液置于25 mL容量瓶中，分別加入10 mL 60%乙醇和1 mL 5%NaNO2溶液，搖勻后放置5 min，隨后加入1mL 10%AlCl3溶液，搖勻后避光放置5 min，最后加入10 mL 5%NaOH溶液，搖勻后用60%的乙醇定容，放置6 min后檢測吸光值，檢測波長為510 nm。根據(jù)吸光值檢測結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為y=0.007 65x-0.003，R2=0.999 4。取5 mL蕪菁提取液，根據(jù)上述方法進(jìn)行顯色后，在波長510 nm處檢測吸光值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算黃酮的含量，結(jié)果以mg蘆丁當(dāng)量/100 g鮮果表示，重復(fù)3次計算平均值[16]。

1.3.3 樣品中總皂苷含量的檢測

將蕪菁提取液進(jìn)行濃縮干燥，精密量取5 mg，加甲醇定容至10 mL容量瓶中，獲得樣品溶液（0.5 mg/mL）。精密量取薯蕷皂苷元對照品2.5 mg，加甲醇定容至25 mL容量瓶中，獲得對照品溶液（0.1 mg/mL）。分別量取對照品溶液 0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL，揮干溶劑后加入5%新鮮配制香草醛冰醋酸0.2mL和高氯酸0.8 mL，在65℃的水浴中加熱10 min，冷卻后加5 mL冰醋酸，測定吸光度，檢測波長為550 nm，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程y=0.082 8x-0.004 1，R2=0.999 2。取5 mL蕪菁樣品溶液，根據(jù)上述方法進(jìn)行顯色后，在波長550 nm處檢測吸光值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算皂苷的含量[17-18]。

1.3.4 DPPH自由基清除活性檢測

取DPPH適量，加無水乙醇配制成0.5 mg/mL的溶液。取蕪菁粉末約1.0 g，分別取2 mL蕪菁提取液樣品及2 mL DPPH溶液放在10 mL容量瓶中，搖勻后在室溫25℃條件下避光靜置30 min，在515 nm處檢測吸光值（Ai），按以下公式計算清除率：

式中：Ac為無水乙醇加等體積DPPH溶液的吸光度；Ai為樣品加等體積DPPH溶液的吸光度；Aj為樣品加等體積乙醇溶液的吸光度。根據(jù)DPPH自由基清除率計算不同地區(qū)蕪菁提取物樣品清除DPPH自由基的EC50值。

1.3.5 ABTS+自由基清除活性檢測

使用碧云天總抗氧化能力檢測試劑盒（ABTS）檢測不同地區(qū)蕪菁提取物樣品的抗氧化活性，按照說明書進(jìn)行操作，在96孔板中加入20 μL過氧化物酶工作液，在空白組中加入10 μL PBS溶液；在樣品組中加入10 μL不同地區(qū)蕪菁提取物樣品，在標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測組中加入10 μL不同濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液；輕輕混勻后每孔加入170 μL的ABTS工作液，混勻，在室溫25℃下孵育6 min，在414 nm處測定吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品的抗氧化活性。

1.3.6 細(xì)胞培養(yǎng)

使用DMEM培養(yǎng)基（含有10%的胎牛血清和1%的青鏈霉素混合液）培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2，2 d～3 d傳代一次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗。

1.3.7 H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷模型的建立

取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸去培養(yǎng)基，加入不同濃度的H2O2，培養(yǎng)12 h進(jìn)行氧化應(yīng)激刺激，棄掉上清液，用預(yù)冷的PBS洗2遍，每孔加10 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄掉上清液。每孔加入200 μL的二甲基亞砜（dimethylsulfoxicle，DMSO），用酶標(biāo)儀檢測吸光值，檢測波長為570 nm，計算細(xì)胞的存活率。

1.3.8 MTT檢測蕪菁提取物對氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞增殖的作用影響

取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸去培養(yǎng)基，試驗組中加入不同濃度的蕪菁提取物，劑量分別為20、40、80 mg/mL，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，加入終濃度為400 μmol/L的H2O2培養(yǎng)12 h，用酶標(biāo)儀檢測吸光值，檢測波長為570 nm，計算細(xì)胞的存活率，方法同1.3.7。

1.3.9 氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞引起的ROS水平變化檢測

取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞接種于6孔板中，按照1.3.8部分的方法處理細(xì)胞后，收集細(xì)胞，在1 500 r/min的條件下離心5 min，加入DCFH-DA熒光探針，在室溫25℃下避光染色30 min，用預(yù)冷的PBS離心洗2遍，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的變化。

1.3.10 統(tǒng)計分析

本試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Graph－Pad Prism 5.0及OFFICE EXCEL 2013繪圖，使用t檢驗對試驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地區(qū)蕪菁總黃酮的含量分析

不同地區(qū)蕪菁總黃酮的含量見圖1。

圖1 不同地區(qū)蕪菁總黃酮的含量Fig.1 Total flavonoids contains in turnips from different regions

由圖1可知，西藏昌都不同地區(qū)蕪菁中黃酮含量有所差別，總黃酮的含量依次為：貢覺縣＞洛隆縣＞察雅縣＞丁青縣＞類烏齊縣＞邊壩縣＞長若區(qū)＞八宿縣＞江達(dá)縣，在9個地區(qū)中，貢覺縣蕪菁的總黃酮含量最高，江達(dá)縣蕪菁中的黃酮含量最低。黃酮類是植物界中水果、花和種子中最廣泛的次生代謝產(chǎn)物，植物中黃酮類化合物的積累過程受到遺傳及環(huán)境因素的影響[20]，9個地區(qū)蕪菁中黃酮含量的差異可能與產(chǎn)地等因素相關(guān)，這與雷霖國等、譚亮等[21-22]的研究結(jié)果一致。黃酮類化合物是天然的抗氧化物質(zhì)，經(jīng)常食用富含黃酮類化合物的食物能夠有助于清除體內(nèi)活性氧自由基，預(yù)防腫瘤、心腦血管疾病等慢性病的發(fā)生[23-24]。

2.2 不同地區(qū)蕪菁總皂苷的含量分析

不同地區(qū)蕪菁總皂苷的含量見圖2。

圖2 不同地區(qū)蕪菁總皂苷的含量Fig.2 Total saponins contains in turnips from different regions

由圖2可知，西藏昌都不同地區(qū)蕪菁中皂苷含量有所差別，總皂苷的含量依次為：貢覺縣＞八宿縣＞洛隆縣＞察雅縣＞類烏齊縣＞長若區(qū)＞丁青縣＞江達(dá)縣＞邊壩縣。在9個地區(qū)中，貢覺縣蕪菁的總皂苷含量最高，邊壩縣蕪菁中的皂苷含量最低。皂苷是植物的糖苷類次生代謝物[25]，西藏昌都地區(qū)蕪菁含量的積累與青藏高原獨特的光照、輻射、溫度及水分等環(huán)境因子有關(guān)，這與楊仕兵等[26]的研究結(jié)果一致。

2.3 不同地區(qū)蕪菁提取物的自由基清除率分析

不同地區(qū)蕪菁對DPPH自由基的清除率見圖3。

圖3 不同地區(qū)蕪菁對DPPH自由基清除活性分析Fig.3 The analysis of DPPH scavenging activity of turnips from different regions

可以看出，不同地區(qū)蕪菁提取物的濃度與DPPH自由基清除率存在著量效關(guān)系，隨著提取物濃度的增高，DPPH自由基清除率逐漸提高。當(dāng)蕪菁提取物濃度為100 μg/mL時，不同地區(qū)樣品DPPH自由基清除率的大小依次為貢覺縣＞丁青縣＞八宿縣＞類烏齊縣＞洛隆縣＞長若區(qū)＞察雅縣＞江達(dá)縣＞邊壩縣。

不同地區(qū)蕪菁提取物對DPPH自由基和ABTS+自由基清除的EC50結(jié)果見表1。

表1 不同地區(qū)蕪菁提取物抗氧化活性的EC50值Table 1 EC50of turnips from different regions mg/mL

由表1可知，其中貢覺縣、丁青縣和八宿縣的DPPH自由基EC50結(jié)果顯著低于察雅縣，江達(dá)縣和邊壩縣。其中貢覺縣、丁青縣和八宿縣的ABTS+自由基EC50結(jié)果顯著低于察雅縣，江達(dá)縣和邊壩縣。

研究表明，食物的抗氧化活性與植物次生代謝產(chǎn)物的含量有很大關(guān)系[16，27]。在本研究，DPPH自由基清除活性與總黃酮、總皂苷的含量顯著相關(guān)（r值分別為0.547，0.539，p＜0.01），ABTS+自由基清除活性與總黃酮、總皂苷的含量顯著相關(guān)（r值分別為0.605和0.663，p＜0.01）。不同地區(qū)蕪菁提取物的抗氧化活性不同，可能是由于生長環(huán)境影響了蕪菁中黃酮和皂苷等活性物質(zhì)的含量，從而影響了蕪菁的抗氧化活性。在本研究中，貢覺縣蕪菁中的總黃酮和總多酚的含量均為最高，DPPH自由基和ABTS+自由基清除活性也顯著高于其他地區(qū)的蕪菁。

2.4 H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型濃度研究

不同濃度的H2O2對RAW264.7細(xì)胞存活率的影響見圖4。

由圖4可知，與空白組相比，不同濃度的H2O2對RAW264.7細(xì)胞的增殖具有抑制作用，并且隨著H2O2濃度的逐漸升高，細(xì)胞的存活率逐漸降低。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)H2O2的濃度達(dá)到400 μmol/L時，細(xì)胞的存活率為56.43%。濃度小于400 μmol/L時，觀察到H2O2對細(xì)胞造成的損傷不明顯，濃度大于400 μmol/L時，觀察到H2O2會造成大量的細(xì)胞死亡，影響試驗結(jié)果。因此本研究選擇400 μmol/L濃度的H2O2來建立細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，開展后續(xù)試驗。

圖4 不同濃度的H2O2對RAW264.7細(xì)胞存活率的影響Fig.4 Effects of different concentrations of H2O2on the survival of RAW264.7 cells

2.5 不同地區(qū)蕪菁提取物對氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞增殖的作用影響

氧化應(yīng)激會對細(xì)胞造成損傷進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞的存活率能夠直觀反映外界環(huán)境對細(xì)胞的損傷程度[10]。H2O2是一種重要的活性氧分子，性質(zhì)相對穩(wěn)定，常作為體外氧化應(yīng)激損傷的造模藥物，造成細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)和組織損傷[28]。不同地區(qū)蕪菁提取物對氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞增殖影響的試驗結(jié)果見圖5。

由圖5可知，與正常對照組相比，H2O2氧化應(yīng)激損傷模型組細(xì)胞的存活率顯著下降，為56.43%，與模型組相比，其中貢覺縣、八宿縣、類烏齊縣蕪菁樣品的中、高劑量組以及察雅縣的高劑量組能顯著提高細(xì)胞存活率，并且具有量效關(guān)系。表明這幾個地區(qū)蕪菁對H2O2誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有一定程度的保護(hù)作用。

2.6 氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞引起的細(xì)胞內(nèi)活性氧水平變化檢測

正常細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成和清除處于動態(tài)平衡的過程，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時，清除ROS的機(jī)制則會失調(diào)，細(xì)胞中的ROS會出現(xiàn)過量累積，從而對細(xì)胞造成氧化損傷甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[29-30]。不同地區(qū)蕪菁提取物對H2O2誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)活性氧水平影響的試驗結(jié)果見圖6。

由圖6可知，與正常對照組相比，H2O2氧化應(yīng)激損傷模型組細(xì)胞ROS水平顯著上升；與模型組相比，貢覺縣蕪菁樣品的低、中、高劑量組及八宿縣、類烏齊縣的中、高劑量組能降低細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，并且具有量效關(guān)系。表明這幾個地區(qū)蕪菁對H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷RAW264.7細(xì)胞中活性氧的累積具有一定程度的清除作用，從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激損傷的作用。

3 結(jié)論

本研究主要分析了西藏昌都不同地區(qū)蕪菁中總黃酮、總皂苷的含量以及其抗氧化應(yīng)激活性。結(jié)果表明，不同地區(qū)蕪菁中總黃酮和總皂苷的含量具有差異，體外DPPH自由基及ABTS+自由基清除活性試驗結(jié)果表明，貢覺縣、丁青縣和八宿縣的抗氧化活性優(yōu)于江達(dá)縣和邊壩縣的蕪菁樣品。通過構(gòu)建H2O2誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷模型，結(jié)果表明貢覺縣、八宿縣、類烏齊縣的蕪菁樣品能夠顯著改善氧化應(yīng)激模型中細(xì)胞存活率的降低，促進(jìn)細(xì)胞增殖，清除自由基，降低細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，緩解氧化應(yīng)激對細(xì)胞所造成的損傷，改善機(jī)體對外界氧化應(yīng)激刺激的調(diào)控能力。本研究為西藏地區(qū)蕪菁的營養(yǎng)物質(zhì)分析與抗氧化活性評估提供了科學(xué)依據(jù)，同時也為蕪菁抗缺氧功能性食品的開發(fā)提供了參考。