康林芝，吳居雄，唐惠妍，門戈陽，劉主

（1.韶關(guān)學院英東食品學院，廣東韶關(guān)512005；2.韶關(guān)學院英東生物與農(nóng)業(yè)學院，廣東韶關(guān)512005）

金耳（Tremellaaurantialba），因其顏色金黃又稱黃木耳，作為一種物美價廉的優(yōu)質(zhì)食用真菌，金耳除了含有珍貴的金耳多糖之外，還含有豐富的人體必需氨基酸、纖維素和微量元素等人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)，豐富的營養(yǎng)物質(zhì)賦予了其滋陰養(yǎng)肺、止咳化痰、降血糖、調(diào)節(jié)免疫功能等多種功效，其食用、藥用以及化妝品行業(yè)方面應(yīng)用的商品價值極高[1-5]。但由于金耳子實體生長形成的周期和生長條件以及技術(shù)的限制，使得金耳相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)與研究工作在很大方面受到了限制。利用生物發(fā)酵技術(shù)獲得菌絲體發(fā)酵液具有發(fā)酵周期很短、易于實現(xiàn)自動化、而且不受季節(jié)限制等優(yōu)點[6-7]。所以本研究以金耳液體發(fā)酵得到的液態(tài)培養(yǎng)物和菌絲球為原料進行相關(guān)健康產(chǎn)品的開發(fā)，即解決了金耳子實體來源問題，同時也符合了現(xiàn)代人對食品營養(yǎng)健康的追求。

酸奶作為一種深受大眾喜愛的食品，不僅口感好而且其營養(yǎng)價值豐富，可起到改善腸道菌群平衡、降血脂降膽固醇等功效，具有預防疾病的效果[8-10]。而近年來隨著人民對食品營養(yǎng)性、安全性和享受性的要求越來越高，普通酸奶其口感和營養(yǎng)價值也逐漸滿足不了消費者需求。因此本試驗利用金耳液體發(fā)酵后獲得的發(fā)酵產(chǎn)物與鮮牛奶混合，采用雙歧桿菌發(fā)酵劑發(fā)酵研究出金耳發(fā)酵液酸奶的工藝并將其進行優(yōu)化，開發(fā)出新型金耳發(fā)酵液酸奶。此酸奶不僅具有普通酸奶的營養(yǎng)價值，而且還含有金耳多糖、金耳所獨具的微量元素等多種營養(yǎng)成分。這些營養(yǎng)成分也賦予了酸奶滋陰養(yǎng)肺、調(diào)節(jié)免疫功能等多種功效以及金耳香甜氣息的特殊風味。開發(fā)出的具有獨特風味、口感和營養(yǎng)價值提升的新型酸奶具有廣闊的市場前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1）金耳一級菌種：昆明食用菌研究所；鮮牛乳：伊利集團；白砂糖（食品級）：市售；雙歧桿菌酸奶發(fā)酵劑：川秀食品有限公司。

2）金耳發(fā)酵培養(yǎng)基

一級液體菌種培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）去瓊脂培養(yǎng)基。二級液體發(fā)酵培養(yǎng)基：3%玉米粉、0.8%蛋白胨、0.2%MgSO4·7H2O、0.3%KH2PO4、0.002%VB1[9]。用檸檬酸和小蘇打調(diào)pH值為5.0。以上均為食品級。

3）試驗試劑

無水乙醇：廣東光華科技股份有限公司；氫氧化鈉、酚酞指示劑：西隴科學股份有限公司；蒸餾水；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004分析天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；BKQP-12高壓蒸汽滅菌鍋：山東博科科學儀器有限公司；0.1 mL～1mL移液槍：艾本德中國有限公司；SW-CJ-ICW超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)公司；ZHP-250型恒溫培養(yǎng)箱：上海三發(fā)科學有限公司；BCD-586WSF冰箱：山東青島海爾集團；YX-01高壓均質(zhì)機：廣州市鈺翔輕工機械設(shè)備有限公司；HH-S28s水浴鍋：金壇市大地自動化儀器廠；TGL20M-Ⅱ高速離心機：鹽城市凱特實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金耳菌絲發(fā)酵液制備

1.3.1.1 液體種子制備

取250 mL的錐形瓶，裝入100 mL PDA液體培養(yǎng)基，121℃滅菌20 min，放置冷卻，在無菌操作臺上接入3塊～5塊黃豆粒大小金耳母種，置于160 r/min搖床，25℃培養(yǎng)7 d，獲得液體種子，放置冰箱備用[11]。

1.3.1.2 菌絲發(fā)酵培養(yǎng)

取250 mL錐形瓶，裝入100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基，121℃滅菌20 min，放置冷卻，接入約7 mL的金耳液體種子，置于160 r/dmin搖床培養(yǎng)6 d，獲得金耳菌絲發(fā)酵液。

1.3.1.3 菌絲發(fā)酵液制備

將1.3.1.2獲得的金耳菌絲發(fā)酵液置于組織搗碎機中搗碎，得勻漿菌絲發(fā)酵液。

1.3.2 酸奶發(fā)酵劑制備

在無菌工作臺內(nèi)，按比例將2 g雙歧桿菌酸奶發(fā)酵劑接種于100 mL鮮牛乳中，42℃培養(yǎng)8 h～10 h，作為后續(xù)試驗組酸奶的發(fā)酵菌種，保存?zhèn)溆茫? d內(nèi)使用。

1.3.3 金耳發(fā)酵液酸奶制備單因素試驗

1.3.3.1 金耳菌絲發(fā)酵液添加量的優(yōu)化

每瓶總體積100 mL，發(fā)酵液按0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%加入，鮮牛乳按相應(yīng)比例加入，添加7%蔗糖，10%發(fā)酵劑（一代酸奶），于42℃發(fā)酵5 h，轉(zhuǎn)入4℃冰箱后熟18 h，對成品進行感官品評以及酸度測定，確定最佳金耳菌絲發(fā)酵液添加量。

1.3.3.2 蔗糖添加量的優(yōu)化

每瓶總體積100 mL，蔗糖按5%、6%、7%、8%、9%、10%加入，添加15%金耳發(fā)酵液，10%發(fā)酵劑（一代酸奶），于42℃發(fā)酵5 h，轉(zhuǎn)入4℃冰箱后熟18 h，對成品進行感官品評以及酸度測定，確定最佳蔗糖添加量。

1.3.3.3 發(fā)酵劑接種量的優(yōu)化

每瓶總體積100 mL，添加15%金耳發(fā)酵液，7%蔗糖，將酸奶發(fā)酵劑（一代酸奶）按1%、4%、7%、10%、13%、16%、19%的比例接種于滅菌的混合基料中，于42℃發(fā)酵5 h，轉(zhuǎn)入4℃冰箱后熟18 h，對成品進行感官品評以及酸度測定，確定最佳發(fā)酵劑接種量。

1.3.3.4 發(fā)酵時間的優(yōu)化

每瓶總體積100 mL，添加15%金耳發(fā)酵液，7%蔗糖，10%發(fā)酵劑（一代酸奶），于42℃按時間發(fā)酵3、4、5、6、7 h，依次取出，轉(zhuǎn)入 4 ℃冰箱后熟 18 h，對成品進行感官品評以及酸度測定，確定最佳發(fā)酵時間[12]。

1.3.4 正交試驗

通過分析金耳發(fā)酵液添加量、蔗糖添加量、發(fā)酵劑接種量、發(fā)酵時間4個單因素試驗的結(jié)果，確定正交水平。采用L9（34）正交試驗進行優(yōu)化，確定金耳發(fā)酵液酸奶的最佳發(fā)酵工藝見表1[13]。

表1 金耳發(fā)酵液酸奶正交水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.4 品質(zhì)分析

1.4.1 感官評定

樣品由20位有感官品評經(jīng)驗的專業(yè)技術(shù)人員組成鑒評小組進行評定，采用100分制，從乳清析出狀態(tài)、組織狀態(tài)、氣味滋味、口感4個方面對成品進行綜合評價。在自然光下觀察乳清析出狀態(tài)和組織狀態(tài)，開蓋聞氣味，用溫水漱口，品嘗。分別打分，取平均分作為最后分值。金耳發(fā)酵液酸奶評分如表2。試驗中以純牛奶制得的原酸奶作為對照。

1.4.2 酸度測定

每組分別取1瓶后熟18 h的酸奶進行酸度測定，參照GB 5009.239-2016《食品安全國家標準食品酸度的測定》進行酸度滴定[14]。

表2 感官評價標準Table 2 Standard of sensory evaluation for yoghourts

1.4.3 持水力測定

分別取1瓶后熟18 h后的金耳發(fā)酵液酸奶成品和普通酸奶的酸奶進行持水力測定，取空離心管稱重，記為m1（g），作好試驗組標記；分別裝入15 g酸奶，稱量離心管和酸奶的總質(zhì)量，記為m2（g）；28℃下，在離心機3 000 r/min離心10 min，將離心管取出，靜置10 min后，去除上清液，再稱量去除上清液后的重量，記為m3（g）。每組重復測3次，代入持水力計算公式，取其平均值，即得持水力[15]。

1.4.4 乳清析出量測定

將金耳發(fā)酵液酸奶成品和普通酸奶在4℃下放置24 h，測定酸奶總高度為H，測定乳清析出層的高度為h，每組重復測3次，代入乳清析出量計算公式，取其平均值，即得乳清析出量[16]。

1.4.5 乳酸菌活菌數(shù)測定

分別取后熟18 h后的金耳發(fā)酵液酸奶成品和普通酸奶進行乳酸菌活菌數(shù)的測定，參照GB 4789.35-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》進行測定[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 金耳發(fā)酵液添加量對酸奶風味的影響

金耳發(fā)酵液添加量對酸奶品質(zhì)的影響見圖1。

圖1 金耳發(fā)酵液添加量對酸奶品質(zhì)的影響Fig.1 Influence of liquid fermentation of Tremella aurantialba additive on yogurt fermentation

酸奶中的酸度主要來源于乳酸菌將乳中的乳糖發(fā)酵分解成的乳酸。乳酸可降低胃的pH值，促進乳蛋白質(zhì)的消化吸收，抑制腸道內(nèi)有害菌的生長，有益人體的健康。另外，酸奶的酸度能增進產(chǎn)品的風味，增加人們的食欲。酸奶的最佳酸度在70°T～90°T之間，消費者可根據(jù)個人的不同口味選擇不同酸度的酸奶。

金耳菌絲發(fā)酵液添加量不同會對酸奶的感官和酸度造成一定的影響，由圖1可以看出，感官評分隨著金耳發(fā)酵液添加量的增加出現(xiàn)先升高又降低的情況，當金耳發(fā)酵液添加量為20%時，乳酸菌以酸奶和金耳發(fā)酵液的混合物為發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵，條件最為適宜，因此此時的酸奶感官得分最高，酸度也較高，酸奶的顏色均勻一致，無分層，持有濃郁的酸奶香氣和柔和的金耳清香風味。當發(fā)酵液添加量超過30%時，酸奶和發(fā)酵液的比例不適宜，金耳發(fā)酵液的味道太濃烈，掩蓋了酸奶的風味，口感粗糙，評分較低。

2.1.2 蔗糖添加量對酸奶風味的影響

蔗糖添加量對酸奶品質(zhì)的影響見圖2。

圖2 蔗糖添加量對酸奶品質(zhì)的影響Fig.2 Influence of sucrose additive on yogurt fermentation

由圖2可以看出，蔗糖添加量為5%時，酸奶的甜味不足且產(chǎn)酸量過低，使得酸奶味道寡淡；當蔗糖添加量達10%時，酸奶偏甜，導致口感不佳，甜味掩蓋了酸奶的風味和金耳發(fā)酵液的清香味；而當添加量為7%時，乳酸菌發(fā)酵可利用的碳源量適宜，所得的酸奶酸甜適口，得分最高。蔗糖添加量對酸度影響不明顯。

2.1.3 發(fā)酵劑接種量對酸奶風味的影響

發(fā)酵劑接種量對酸奶風味的影響見圖3。

圖3 接種量對酸奶品質(zhì)的影響Fig.3 Influence of inoculation amount on yogurt fermentation

由圖3可以看出，酸奶的酸度隨著接種量的增加而不斷升高，當接種量為10%時，經(jīng)發(fā)酵得到的酸奶酸甜適口，口感最佳；接種量超過10%時，乳酸菌數(shù)過多，使得糖類過度轉(zhuǎn)化為乳酸，使得酸奶過酸不適口，口感差，接種量少于10%時，產(chǎn)酸量過低所以出現(xiàn)酸奶凝固性不好，組織狀態(tài)不佳，因此，選擇接種量為10%。酸度隨接種量的增加而增加，但考慮到口感，仍以接種量為10%為最佳接種量。

2.1.4 發(fā)酵時間對酸奶風味的影響

發(fā)酵時間對酸奶風味的影響見圖4。

圖4 發(fā)酵時間對酸奶品質(zhì)的影響Fig.4 Influence of fermentation time on yogurt fermentation

由圖4可以看出，酸奶的酸度隨著發(fā)酵時間的延長而逐漸升高，當發(fā)酵時間到達5 h時，酸奶完全凝固，酸甜適口，既有金耳的清香味又有酸奶的風味；當發(fā)酵時間少于5 h時，酸奶沒有完全凝固，酸味較淡，品質(zhì)相對較差，說明發(fā)酵時間不足沒有足夠的乳酸產(chǎn)生；當發(fā)酵時間超過5 h時，酸奶發(fā)酵時間過長，產(chǎn)酸過多，口味偏酸，且有一些其他次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生使酸奶味道有點苦澀，質(zhì)量較差。

2.2 正交試驗

正交試驗結(jié)果分析見表3。

表3 正交試驗結(jié)果分析Table 3Results of orthogonal experiment L9（34）

由表3可知，對金耳發(fā)酵液酸奶品質(zhì)的影響中主次因素排序為B＞C＞A＞D，由此可得出，蔗糖添加量是影響金耳發(fā)酵液酸奶品質(zhì)的重要因素，其次是接種量、金耳發(fā)酵液添加量、發(fā)酵時間；由極差分析可以得出金耳發(fā)酵液酸奶的最佳組合是A1B2C3D1，為驗證正交試驗結(jié)果，將培養(yǎng)條件為A1B2C3D1重新設(shè)定試驗，試驗設(shè)置3個重復，經(jīng)過驗證試驗結(jié)果可知此條件下感官評分94，與正交試驗結(jié)果較為一致。因而金耳發(fā)酵液酸奶的最佳工藝條件為金耳發(fā)酵液添加量15%，蔗糖添加量7%，接種量13%，發(fā)酵時間4 h，獲得的酸奶品質(zhì)最佳。

2.3 金耳發(fā)酵液酸奶與普通發(fā)酵酸奶品質(zhì)分析比較

按照正交試驗確定的最佳金耳發(fā)酵液酸奶配方進行加工制作酸奶，以正交試驗確定的最佳工藝條件制作普通發(fā)酵酸奶（空白對照組不加金耳發(fā)酵液），后熟后通過對成品進行感官評分以及持水力、酸度、乳清析出量、乳酸菌活菌數(shù)的測定，比較金耳發(fā)酵液酸奶與普通發(fā)酵酸奶的品質(zhì)。結(jié)果如表4所示。

通過乳清析出狀態(tài)、組織狀態(tài)、氣味滋味、口感4個方面對成品進行感官綜合評定。由表4可以看出，金耳發(fā)酵液酸奶的感官評分為93.4分，普通發(fā)酵酸奶為82.6分，說明金耳發(fā)酵液的加入可以改善酸奶感官品質(zhì)。持水力是影響組織狀態(tài)的一個重要指標，金耳發(fā)酵液酸奶的持水性為90.72%，比普通發(fā)酵酸奶的持水性高出5.05%，這主要是因為金耳菌絲發(fā)酵液中含有大量的金耳多糖，菌體細胞通過絲狀的多糖與周圍的蛋白質(zhì)凝塊相連形成復雜而穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。這種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成有利于改善發(fā)酵乳的流變特性，減少酸奶乳清析出[18]。金耳發(fā)酵液酸奶的滴定酸度為89.4°T，普通發(fā)酵酸奶的酸度為78.1°T，兩種酸奶的酸度接近但含有金耳發(fā)酵液的酸奶酸度仍略高于普通酸奶，主要是因為金耳發(fā)酵液中含有一些可以促進乳酸菌生長繁殖的成分，使得乳酸轉(zhuǎn)化率較高。根據(jù)發(fā)酵乳的食品安全國家標準規(guī)定，發(fā)酵乳的酸度值≥70°T，金耳發(fā)酵液酸奶酸度和普通酸奶的酸度都達到國標發(fā)酵乳酸度值的要求。從表4中看出兩種酸奶乳清析出量差別不大，沒有達到顯著差異。金耳發(fā)酵液酸奶中的乳酸菌活菌數(shù)量顯著高于普通發(fā)酵酸奶的乳酸菌活菌數(shù)量，這可能是由于金耳發(fā)酵液中不僅含有多糖，還可能肽類、核苷酸、氨基酸等小分子化合物，這些成分是酸奶發(fā)酵劑菌種的促生長因子，都有利于促進乳酸菌的生長繁殖，因此使得金耳發(fā)酵液酸奶中活菌數(shù)高于普通酸奶[8]。

表4 金耳發(fā)酵液酸奶與普通酸奶品質(zhì)分析對比Table 4 Quality Analysis between control yoghurt and Liquid Fermentation of Tremella aurantialba Yoghurt

3 結(jié)論

本文單因素試驗及四因素三水平正交法試驗，預測金耳發(fā)酵液酸奶的最佳配方條件并進行驗證。得出金耳發(fā)酵液酸奶的最佳工藝條件為：金耳發(fā)酵液添加量為15%，蔗糖添加量為7%，乳酸菌接種量為13%，發(fā)酵時間為4 h，在此工藝參數(shù)下發(fā)酵的金耳發(fā)酵液酸奶品質(zhì)最佳。金耳發(fā)酵液能夠提高酸奶的持水能力和降低乳清的析出量，改善酸奶的質(zhì)地，使酸奶口感更加細膩，從而提高酸奶的品質(zhì)。對所得的酸奶進行指標測定，乳酸菌活菌數(shù)達到6.50×108CFU/mL。

金耳發(fā)酵液酸奶集酸奶與金耳的營養(yǎng)于一體，具良好的保健價值，酸甜適口，易為大眾接受。該產(chǎn)品的開發(fā)既會彌補市售酸奶的品種不足，又會為人參果的深加工利用開辟一條新路，相信將有有廣闊的開發(fā)前景。