王恩召，范分良，李艷玲，劉雄舵，盧玉秋，宋阿琳

（中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京100081）

0 引言

【研究意義】水稻在生長過程中根系能夠釋放各種信號分子，組裝特有的根系微生物群落[1]。水稻根系與微生物通過密切的聯(lián)系來實現(xiàn)互惠互利，微生物能將一些關鍵營養(yǎng)元素轉化為更有利于植物吸收的形式，同時，水稻根系分泌物為微生物生長提供必要的營養(yǎng)元素[2-3]。微生物也能夠釋放各種代謝產(chǎn)物，如植物激素、揮發(fā)性有機物（microbial volatile organic compounds，mVOCs）等，它們在水稻生長發(fā)育過程中起著重要作用，不僅能促進植物生長，也能幫助植物抵御各種脅迫、病害等[4-5]。揮發(fā)性有機物是一類具有低分子量、高蒸氣壓、低水溶性特點的物質(zhì)，在20℃、0.01 kPa下能快速揮發(fā)，進入氣相狀態(tài)[6]。植物可以通過釋放揮發(fā)性有機物來達到信息傳遞和相互作用的目的，同樣，微生物也能產(chǎn)生大量種類豐富、功能多樣的揮發(fā)性物質(zhì)[7]。微生物揮發(fā)性有機物主要包含烯烴、醇、酮、萜、苯、吡嗪、酸、酯、胺、醛類等物質(zhì)，它們在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中發(fā)揮著重要作用[8-11]。因此，研究微生物揮發(fā)性有機物對于調(diào)節(jié)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，實現(xiàn)農(nóng)業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】據(jù)文獻報道，微生物通過釋放的揮發(fā)性有機物，不僅能夠影響植物的生長發(fā)育，而且能夠在非接觸情況下，調(diào)節(jié)植物所面臨的各種生物脅迫與非生物脅迫[12-14]。例如，LEE等[15]將植物置于木霉菌株釋放的揮發(fā)性有機物中，植物的生物量和葉綠素含量顯著增加，表明木霉菌株產(chǎn)生了促進植物生長的揮發(fā)性有機物，但也有部分木霉釋放的揮發(fā)性有機物降低了植物生長量和葉綠素含量，表明不同種類的菌株釋放的揮發(fā)性有機物對植物生長的作用不同；CHOUDOIR等[16]從土壤和空氣的塵埃中分離出48種放線菌，并檢測了這些放線菌在不同培養(yǎng)基上釋放的揮發(fā)性有機物，發(fā)現(xiàn)每個菌株都產(chǎn)生獨特的揮發(fā)性有機物組合，盡管某些化合物是由許多菌株產(chǎn)生的，但大多數(shù)是菌株特異性的。重要的是，密切相關的菌株之間的揮發(fā)性有機化合物特征更為相似，通過檢測這些揮發(fā)性有機物對致病性和非致病性假單胞菌（Pseudomonas）菌株生長速率的影響，發(fā)現(xiàn)其對代表植物有益微生物和致病微生物的生長具有刺激和抑制作用；XU等[17]使用固相微萃取-氣相色譜/質(zhì)譜法鑒定了部分土壤中微生物揮發(fā)性有機化合物，并采用相對純商業(yè)化合物進行體外拮抗試驗，發(fā)現(xiàn)即使在低濃度下三甲胺、苯甲醛和N,N-二甲基辛胺也具有較強的抗真菌活性。越來越多證據(jù)表明，微生物揮發(fā)性有機物對生態(tài)環(huán)境友好，可以作為一種經(jīng)濟有效的可持續(xù)戰(zhàn)略應用于農(nóng)業(yè)實踐?！颈狙芯壳腥朦c】不同植物的根際微生物往往與眾不同，每種微生物又能產(chǎn)生獨特的揮發(fā)性有機物，前期研究大多集中在微生物通過釋放揮發(fā)性有機物影響植物或微生物生長[18-21]，而對水稻生長過程根系微生物揮發(fā)性有機物研究較少?！緮M解決的關鍵問題】篩選水稻根系能夠通過釋放揮發(fā)性有機物來抑制病原真菌小孢根霉（Rhizopus microsporus）生長的細菌，并對具有不同抑菌效果的細菌釋放的揮發(fā)性有機物進行檢測，確定具有抑菌活性的物質(zhì)并采用相應的純化學品進行驗證，以期鑒定出新的具有潛在抑菌活性的揮發(fā)性有機物。

1 材料與方法

試驗于2018年6月至2019年7月在中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所完成。

1.1 供試菌株、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件

9種供試菌株耳炎假單胞菌（Pseudomonas otitidis）（編號為 3）、煙草腸桿菌（Enterobacter tabaci）（編號為26）、神戶腸桿菌（Enterobacter kobei）（編號為34）、假單胞菌（Pseudomonassp.）（編號為35）、皮氏羅爾斯通氏菌（Ralstonia pickettii）（編號為50）、阿氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）（編號為62，該菌株已申請專利，專利申請?zhí)枺?019108367651）、節(jié)桿菌（Arthrobactersp.）（編號為146）、短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）（編號為2-18）、麥克默多生孢八疊球菌（Paenisporosarcina macmurdoensis）（編號為2-60）由筆者從水稻根系篩選，均能通過釋放揮發(fā)性有機物對小孢根霉生長產(chǎn)生抑制作用。冷凍保藏的菌株采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進行活化（牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 7.2—7.4），黑暗條件、30℃恒溫培養(yǎng)48 h。將活化好的菌株接種于液體的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（不加瓊脂）中，180 r/min、30℃振蕩培養(yǎng)48 h后獲得菌株發(fā)酵液，備用。

小孢根霉由筆者實驗室在水稻根際分離、鑒定、保存。活化小孢根霉采用PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 L，自然pH），黑暗條件、30℃恒溫培養(yǎng)48 h。將活化好的菌株接種于PDB培養(yǎng)基（配方同PDA，不加瓊脂）中，180 r/min、30℃振蕩培養(yǎng)48 h后獲得菌株發(fā)酵液，備用。

1.2 細菌揮發(fā)性有機物對小孢根霉的抑制作用

取供試菌株菌液 100 μL至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，用 121℃高壓蒸汽滅過菌的涂布棒涂均勻，放到30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取小孢根霉發(fā)酵液10 μL，滴在PDA培養(yǎng)基中央，然后將培養(yǎng)24 h的供試菌株培養(yǎng)皿扣在其上，對照為將不加菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基扣上，周圍用封口膜密封，黑暗條件下30℃恒溫培養(yǎng)，每隔24 h觀察記錄一次，直到小孢根霉長滿板，培養(yǎng)結束，每處理4個重復，比較揮發(fā)性有機物的抑菌效果。抑菌率=（對照小孢根霉菌落直徑-處理小孢根霉菌落直徑）/對照小孢根霉菌落直徑×100%。

1.3 揮發(fā)性有機物的收集

取5 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基于20 mL頂空瓶中，加入0.1 g瓊脂，用牛皮紙封上瓶口，121℃、30 min滅菌，滅菌完將瓶子傾斜30°，冷卻凝固，取100 μL預先準備好的菌液加入瓶中，搖晃瓶體使菌液均勻分布在培養(yǎng)基斜面上，蓋上牛皮紙，黑暗條件、30℃恒溫培養(yǎng)48 h，去掉牛皮紙，用帶有聚四氟乙烯隔墊的中空螺旋蓋封口，同時設置只加培養(yǎng)基、不接菌的頂空瓶作為空白對照，每處理4個重復。

培養(yǎng)5 d后，采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維（購于 Supelco公司）進行萃取，萃取頭裝配于SPME手動萃取手柄上（Supelco，Bellefonte，PA，USA），在使用前先進行老化，老化按廠家說明書進行，之后在30℃恒溫條件下萃取12 h。

1.4 揮發(fā)性有機物的分析

萃取完成后立即采用安捷倫7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜分析儀（Agilent Technologies，USA）進行檢測分析。色譜條件：進樣口溫度 250℃，進樣時間 3 min；不分流模式，載氣為99.999%的高純氦氣，柱流速為1 mL·min-1。柱箱升溫程序：初始溫度50℃，保持 2 min，以 8℃·min-1的速度升溫至 180℃，再以10℃·min-1的速度升溫至240℃，保持6 min。質(zhì)譜條件：離子化方式為EI，70 eV；離子源溫度為230℃，四級桿溫度150℃，傳輸線溫度250℃；掃描模式為全掃描，掃描范圍35—450 amu。測得的揮發(fā)性有機物質(zhì)譜在NIST/EPA/NIH數(shù)據(jù)庫中進行比對鑒定。

1.5 純品體外拮抗驗證

在PDA培養(yǎng)基中加入一個滅過菌的2 mL離心管蓋子，蓋子里分別加入100 μL的3-甲基丁酸和5-甲基-2-己酮，對照組蓋子里加入100 μL滅菌水，培養(yǎng)基中央加入10 μL小孢根霉菌液，32℃黑暗條件下培養(yǎng)，觀察小孢根霉生長狀況。

2 結果

2.1 揮發(fā)性有機物對小孢根霉的抑制作用

9株供試細菌菌株分別對小孢根霉產(chǎn)生了不同程度的抑制作用，3、26、34、35、50、62和2-60號菌株的抑菌率相差不大，分別為 29.38%、26.88%、26.88%、33.13%、28.75%、29.38%和 26.25%，抑菌率相對高于菌株146（14.38%）和2-18（15.00%）號（圖1）。

2.2 供試菌株釋放揮發(fā)性有機物的定性分析

每個供試菌株都產(chǎn)生了不同種類的揮發(fā)性有機物，這些物質(zhì)有菌株獨有的，也有共同產(chǎn)生的（表1），且每種菌產(chǎn)生的揮發(fā)性有機物數(shù)量以及濃度也不同，其中3號菌釋放7種物質(zhì)、26號菌釋放17種物質(zhì)、34號菌釋放21種物質(zhì)、35號菌釋放30種物質(zhì)、50號菌釋放10種物質(zhì)、62號菌釋放29種物質(zhì)、146號菌釋放10種物質(zhì)、2-18號菌釋放18種物質(zhì)、2-60號菌釋放33種物質(zhì)。

2.3 揮發(fā)性有機物的定量分析

供試菌株釋放的揮發(fā)性有機物主要包括酯、烯烴、烷、酮、酸、噻吩、醛、萘、硫化物、酚、醇、吡嗪、吡咯、苯類，其中所有菌株都釋放醇類物質(zhì)，3、35、50、146、2-60號菌株釋放的硫化物占比最大，26號菌株釋放的烷類物質(zhì)占比最大，34、62號菌株釋放的醇類物質(zhì)占比最大，2-18號菌株釋放的酮類物質(zhì)占比最大（圖2）。

圖1 不同細菌對小孢根霉的抑菌率Fig. 1 Inhibition rate of different bacteria against R. microsporus

圖2 不同細菌釋放的揮發(fā)性有機物組成Fig. 2 The composition of VOCs emitted from different bacteria

表1 微生物揮發(fā)性有機化合物的組成Table 1 Composition of mVOCs

續(xù)表1 Continued table 1

續(xù)表1 Continued table 1

2.4 揮發(fā)性有機物的數(shù)量組成分析

所有供試菌株共檢測到90種物質(zhì)，雖然每種菌都能釋放自己獨特的揮發(fā)性有機物，但是它們釋放的物質(zhì)也存在著一定的交集，2-60號菌獨有的物質(zhì)有15種，35號獨有6種，62號獨有7種，34號獨有6種，2-18號獨有5種，26號獨有8種，50號獨有6種，146號獨有2種，3號獨有3種。其中8種菌同時釋放的有1種物質(zhì)，7種菌同時釋放的有1種物質(zhì)，6種菌同時釋放的有5種物質(zhì)，5種菌同時釋放的有3種物質(zhì)，4種菌同時釋放的有3種物質(zhì)，3種菌同時釋放的有7種物質(zhì)，其余為2種菌同時釋放的物質(zhì)（圖3）。

2.5 揮發(fā)性有機物與抑菌率之間的關系

通過相關性分析，發(fā)現(xiàn)有6種物質(zhì)（2-庚酮、5-甲基-2-己酮、2-壬酮、5-甲基-3-己酮、3-甲基丁酸和甲基異丁基酮）在質(zhì)譜上的峰面積和相對應菌株的抑菌率呈顯著正相關，其中有3種物質(zhì)（5-甲基-2-己酮、5-甲基-3-己酮和 3-甲基丁酸）文獻中暫未報道（表2）。

2.6 純品體外檢測

選取能購買到的其中2種物質(zhì)（5-甲基-2-己酮和3-甲基丁酸）做體外驗證，發(fā)現(xiàn)3-甲基丁酸嚴重影響小孢根霉生長，5-甲基-2-己酮對小孢根霉具有致死作用（圖4）。

3 討論

大量文獻報道細菌能通過釋放揮發(fā)性有機化合物來抑制病原菌的生長[22-23]，王靜等[24]在煙草根際分離到一株短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）AR03，該菌株能產(chǎn)生多種揮發(fā)性有機物，且揮發(fā)物對煙草黑脛病菌（Phytophthora parasiticavar.nicotianae）和赤星病菌（Alternaria alternata）均具有抑制作用。本研究通過對扣熏蒸法，發(fā)現(xiàn)有9株細菌能夠在不接觸小孢根霉的情況下抑制其生長，并且抑制效果不同（圖 1），說明這些細菌釋放了能夠抑制病原菌生長的揮發(fā)性物質(zhì)，雖然文獻里有較多相關報道，但對于水稻根系細菌釋放的揮發(fā)性有機物卻鮮有報道。

圖3 不同菌株釋放不同和相同揮發(fā)性有機物數(shù)量的韋恩圖Fig. 3 The Venn diagram showing the amount of different and same VOCs released by different strains

表2 細菌揮發(fā)性有機化合物質(zhì)譜上的峰面積與相應菌株抑菌率的相關性系數(shù)Table 2 Correlation coefficient between the peak area of each substance in mass spectrum and the inhibition rate of corresponding strain

通過對本研究的9株細菌釋放的揮發(fā)性有機物進行檢測，發(fā)現(xiàn)這些細菌每株都釋放了多種揮發(fā)性有機物，每株菌釋放的揮發(fā)性有機物有重疊的部分，也都特有部分，同時，每種揮發(fā)性有機物的量也不同（表1、圖2），研究結果與文獻報道較為一致。如MACKIE等[21]隨機選擇土壤中細菌，測定對幾種真菌生長的影響，發(fā)現(xiàn)54%菌株對部分真菌生長具有抑制作用；LI等[25]通過檢測8株芽孢桿菌釋放的揮發(fā)性有機物，發(fā)現(xiàn)這些菌株均能釋放多種揮發(fā)性有機物，且含量不同。

圖4 3-甲基丁酸（A）和5-甲基-2-己酮（B）熏蒸小孢根霉Fig. 4 R. microspores treated with 3-methyl-butanoic acid (A) and 5-methyl-2-hexanone (B)

本研究中，選取同時被3株以上菌株釋放的物質(zhì)，將它們在質(zhì)譜上的峰面積與相對應菌株的抑菌率做相關性分析，發(fā)現(xiàn)有6種物質(zhì)（2-庚酮、5-甲基-2-己酮、2-壬酮、5-甲基-3-己酮、3-甲基丁酸和甲基異丁基酮）與其對應菌株的抑菌率呈顯著正相關（表2）。其中，有 3種物質(zhì)（2-庚酮、2-壬酮和甲基異丁基酮）在不同文獻中被報道具有抑菌作用，如 POPOVA等[26]從土壤或根際分離得到的假單胞菌和沙雷氏菌（Serratia）產(chǎn)揮發(fā)物對根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）和真菌具有抑制作用，對藍藻、果蠅（黑腹果蠅Drosophila melanogaster）和線蟲（秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans）具有殺滅作用，通過檢測發(fā)現(xiàn)主要是一些酮類物質(zhì)（2-壬酮、2-庚酮和 2-十一烷酮）和二甲基二硫起作用；EZRA等[27]研究內(nèi)生真菌Muscodor albus的抑菌活性，通過檢測其釋放的揮發(fā)性有機物，發(fā)現(xiàn)該菌株在蔗糖培養(yǎng)基上主要釋放甲基異丁基酮、乙酸和丁酯3種物質(zhì)。本研究所篩選的6種揮發(fā)性有機物中尚有3種物質(zhì)（5-甲基-2-己酮、5-甲基-3-己酮和3-甲基丁酸）暫未被報道具有抑菌作用，因此，選取能購買到的其中2種物質(zhì)（5-甲基-2-己酮和3-甲基丁酸）進行體外熏蒸試驗，發(fā)現(xiàn)5-甲基-2-己酮能夠使小孢根霉致死，3-甲基丁酸嚴重抑制小孢根霉的生長（圖4）。

另外，3-甲基-1-丁醇、2-十一烷酮、三硫化二甲基和二硫化二甲基這幾種物質(zhì)雖然本研究并未分析出具有抑菌活性，但有文獻報道其具有抑菌活性[28]。如WANG等[29]通過分析一株白色鏈霉菌TD-1釋放的揮發(fā)性有機物，發(fā)現(xiàn)該菌株釋放最多的物質(zhì)為二甲基二硫，在體外熏蒸試驗中能抑制念珠菌的生長；FERNANDO等[30]通過檢測從菜籽、大豆中分離出的細菌釋放的揮發(fā)性有機物，發(fā)現(xiàn)6種物質(zhì)（苯并噻唑、環(huán)己醇、正癸醛、三硫化二甲基、2-乙基 1-己醇和壬醛）能抑制真菌生長。由于本研究是通過相關性分析來確定物質(zhì)釋放是否具有抑菌活性，因此筆者推測可能是釋放這些物質(zhì)的菌株同時釋放了其他一些抑菌活性更強的物質(zhì)，導致這些物質(zhì)相對含量與菌株的抑菌率沒有呈正相關，如50號菌株釋放了文獻已證明具有抑菌活性的物質(zhì)三硫化二甲基和二硫化二甲基，雖然沒有釋放本研究中分析到的6種物質(zhì)，但卻具有一定的抑菌能力，也可能是小孢根霉對于這些物質(zhì)的敏感性偏低，從而導致文獻中提到的一些抑菌物質(zhì)在本研究中未發(fā)現(xiàn)。

4 結論

水稻根系細菌能釋放種類豐富的揮發(fā)性有機物，部分揮發(fā)性有機物對水稻病原菌小孢根霉具有顯著抑制作用。通過相關性分析及體外驗證確定了2種新型的具有抑菌活性的物質(zhì)（5-甲基-2-己酮和3-甲基丁酸）以及1種可能具有抑菌活性的物質(zhì)（5-甲基-3-己酮），這些菌株和揮發(fā)性有機物均具有作為新型藥物和抗真菌代謝物生物資源的潛力。