黃蓉，王滟，張憲棟，楊會祥，劉吉開

(中南民族大學 藥學院，民族藥學國家級實驗教學示范中心，武漢430074)

巨噬細胞在機體受到外來病原微生物入侵時，會分泌多種細胞因子、趨化因子、一氧化氮以及調節(jié)炎癥相關蛋白而引發(fā)炎癥和免疫應答.脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌細胞壁主要組成成分，細菌死亡溶解或用人工方法破壞細胞后才釋放出來，其毒性成分主要為類脂質[1].巨噬細胞在 LPS 的誘導下，不僅細胞增殖能力和吞噬能力明顯增強，還會釋放大量的細胞因子和炎癥介質，如一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)等,這些介質會對病原微生物的入侵產生抵御作用，過量分泌則會引發(fā)炎癥反應[2].

植物內生真菌(endophytic fungi)生活在健康植物各組織器官的細胞間隙或細胞內部，是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，植物內生真菌在與宿主長期協(xié)同進化過程中構筑起宿主植物的健康保護屏障，可以產生諸如生物堿類、萜類、蒽醌類、肽類、木質素類等結構新穎且生物功能多樣的次生代謝產物[3,4].目前，從藥用植物內生真菌中尋找到了多種抗腫瘤、抗炎活性物質，如紫杉醇、紫杉烷、長春新堿、細胞松弛素等[5].萜類化合物是由甲戊二羥酸生物合成途徑衍生而來的一類化合物，結構通式為(C5H8)n,常以含氧衍生物的形式存在；結構類型繁多，包括單萜、倍半萜、二萜、三萜、四萜等，生物活性也十分豐富，研究證明萜類化合物在抗炎活性方面有巨大的潛力[6,7].前期研究中，從馬鈴薯內生真菌Trichotheciumcrotocinigenum次生代謝產物中分離得到了新的倍半萜類化合物TA，結構如圖1所示[8,9].本研究以LPS刺激RAW264.7細胞構建炎癥反應模型，探究化合物TA對LPS誘導細胞炎癥反應的抑制作用.

圖1 化合物TA結構

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小鼠巨噬細胞株RAW264.7(武漢大學典型培養(yǎng)物保藏中心)，脂多糖LPS、DCFH-DA熒光探針粉末(德國Sigma)，GAPDH、iNOS兔多抗一抗(武漢三鷹)；COX-2兔多抗一抗(武漢愛博泰克)，HRP-山羊抗兔IgG(H+L)、NO檢測試劑盒、胎牛血清(上海碧云天)，ELISA試劑盒(美國BD).二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific)，多功能酶標儀(瑞士Tecan Spark)，凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad).

1.2 細胞培養(yǎng)與活力檢測

取對數(shù)生長期 RAW264.7 細胞，以 1×104個/孔接種到 96 孔板，每孔 100 μL，培養(yǎng)24 h后進行分組處理.空白組：加入無血清培養(yǎng)液；給藥組：加入2.5、5、10、20、40 μmol/L系列濃度的TA，每孔100 μL，每組3個復孔，孵育24 h.棄掉舊培養(yǎng)基，每孔加入100 μL的0.5 mg/mL的MTT試劑，培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，棄上清，加入150 μL DMSO溶解紫色結晶，15 min后，酶標儀檢測各孔在570 nm處的吸光度.

1.3 細胞中NO含量的測定

取對數(shù)生長期 RAW264.7 細胞，以 1×105個/孔接種到 96 孔板，每孔 100 μL，培養(yǎng)24 h后進行分組處理.空白組：加入無血清培養(yǎng)基；模型組：加入LPS(500 ng/mL)；給藥組：加入LPS和不同濃度的TA(5、10、15、20、30、40 μmol/L)，每孔100 μL, 每組3個復孔.孵育18 h，根據 NO 試劑盒說明書采用 Griess 法測定各孔培養(yǎng)上清液中 NO 的含量.

1.4 細胞內活性氧水平檢測

取RAW264.7 細胞按上述接種密度接種到黑色避光96孔板中.空白組：加入無血清培養(yǎng)基；LPS模型組：加入500 ng/mL LPS溶液；化合物TA處理組：加入40 μmol/L的TA;化合物TA+LPS處理組：分別加入10、20和40 μmol/L的TA和500 ng/mL LPS溶液.每孔100 μL，每組3個復孔，孵育18 h.用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA(1∶1000)，使其終濃度為10 μmol/L.去除細胞培養(yǎng)液，每孔加入50 μL的DCFH-DA稀釋液，置于培養(yǎng)箱中孵育20 min.PBS洗2次，酶標儀檢測細胞內熒光強度.

1.5 酶聯(lián)免疫法測細胞因子的含量

取RAW264.7 細胞以 1×105個/孔接種到6孔板中，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h.細胞分組及處理方法同1.4，孵育 18 h 后，收集上清液，分別按照 TNF-α，IL-1β 酶聯(lián)免疫試劑盒操作說明測定OD450值.

1.6 蛋白免疫印跡測定蛋白表達

細胞接種，方法同1.5.待培養(yǎng)結束后用RIPA 裂解液在冰上裂解蛋白.離心取上清進行蛋白定量.加入蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min使蛋白變性，聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分離蛋白，再將蛋白轉至 PVDF 膜上，5% BSA進行封閉，1 h后加入一抗(iNOS、COX-2和 GAPDH)，于 4 ℃下孵育過夜.TBST緩沖液洗膜，加辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗孵育1 h后進行 ECL顯影.以 GAPDH為內標，定量分析各組細胞中蛋白的表達情況.

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果與分析

2.1 化合物TA對細胞活力的影響

用 MTT 法測定不同濃度的TA對 RAW264.7 細胞活力的影響，結果如圖2所示.化合物TA作用濃度在 2.5 ～40 μmol/L范圍時，相比空白組，細胞存活率無明顯變化，說明該化合物對細胞無毒性.

圖2 不同濃度TA對RAW264.7細胞活力的影響

2.2 化合物TA對LPS誘導的RAW264.7細胞釋放NO的影響

##表示與空白組差異極顯著；*表示與LPS組差異顯著，**表示與LPS組差異極顯著(下同)

LPS刺激RAW264.7細胞后，細胞上清液中的NO釋放量較空白組明顯增加(P< 0.01)，說明LPS誘導的炎癥模型建立成功(圖3).而加入不同濃度TA的給藥組相比LPS模型組均能顯著降低上清中NO的含量(P< 0.01)，濃度在5 ～40 μmol/L范圍內呈一定的劑量依賴性，半抑制濃度IC50值為18.53 ± 0.43 μmol/L，表明該化合物在LPS誘導產生炎癥的情況下能有效抑制NO的產生，發(fā)揮抗炎作用.

2.3 化合物TA對LPS誘導的RAW264.7細胞中ROS水平的影響

與空白組相比(圖4)，LPS刺激組ROS水平明顯升高(P< 0.01).化合物TA濃度在10 μmol/L時，其ROS表達水平不變；當TA濃度增加到20、40 μmol/L時，ROS水平明顯降低(P< 0.01)，說明一定濃度的TA可以降低細胞內ROS水平.

圖4 TA對LPS誘導的RAW264.7細胞中ROS水平的影響

2.4 化合物TA對LPS誘導的RAW264.7細胞中的TNF-α、IL-1β含量的影響

在沒有LPS刺激時加40 μmol/L TA，炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β釋放量與空白組相比無明顯變化，而LPS組細胞上清中的TNF-α、IL-1β含量都明顯增多(P< 0.01).與LPS組相比，加藥組的TNF-α、IL-1β含量呈現(xiàn)劑量依賴性降低，且20和40 μmol/L時顯著降低(P<0.01)，說明化合物TA能夠通過抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β的生成，從而發(fā)揮抗炎作用(圖5).

2.5 化合物TA對LPS誘導下iNOS、COX-2蛋白表達的影響

iNOS(誘導型NO合成酶)是機體活性氮自由基產生的催化酶；COX-2 在正常細胞中表達量很低，但是在被激活的巨噬細胞和其他炎性細胞中表達水平會迅速上升，二者都是反映炎癥的重要標志酶[9].用蛋白免疫印跡法檢測RAW264.7細胞中iNOS、COX-2蛋白的表達量，結果如圖6所示，空白組中iNOS、COX-2 蛋白表達量較低；與空白組相比，LPS組的iNOS、COX-2表達量顯著增加(P<0.01)；與LPS組相比，給藥組的iNOS、COX-2表達量隨著TA濃度的增加而減少，20和40 μmol/L時顯著降低(P<0.01)，表明化合物TA可以通過下調iNOS、COX-2的表達量發(fā)揮抗炎效果.

圖5 化合物TA對LPS誘導的RAW264.7細胞TNF-α、IL-1β釋放量的影響

圖6 化合物TA對LPS誘導RAW264.7細胞iNOS、COX-2蛋白表達量的影響

3 結語

通過LPS誘導RAW264.7細胞構建體外炎癥反應模型，探究了馬鈴薯內生真菌Trichotheciumcrotocinigenum次生代謝產物中新型倍半萜類化合物TA的抗炎作用.MTT檢測試驗表明其對細胞無毒性，與LPS模型組相比，可以劑量依賴性地降低細胞上清液中NO，炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β的釋放量，降低細胞內活性氧水平，表現(xiàn)出顯著的抗炎活性.中、高濃度的化合物TA可以抑制LPS刺激RAW264.7細胞中的iNOS、COX-2蛋白的表達，說明化合物TA的抗炎機制與iNOS、COX-2蛋白轉錄水平表達有關.炎癥反應的經典信號通路主要包括JAK/STAT、NF-κB和MAPK，且3條信號通路之間存在復雜的交匯作用.因此，從這3條通路出發(fā)可對倍半萜類化合物TA的抗炎機制進行更細致深入的研究，為找尋有效抗炎方法提供新思路.