華麗霞 孫 佩 蔣秋平 曾華蘭* 葉鵬盛 何 煉 曾 靜 王明娟 張 敏 羅 飛 楊曉丫 何曉敏 劉 勇

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物育種栽培研究所，四川 成都 610300；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066)

木霉菌(Trichodermaspp.)是研究和利用最廣泛的植物病害生防真菌。已有研究表明木霉菌對(duì)黃瓜枯萎病病菌、辣椒疫霉病菌、棉花立枯絲核菌等多種植物病原真菌具有顯著拮抗效果，抑菌率在80%以上[1-2]；木霉菌能增強(qiáng)作物根系活力，對(duì)作物的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用[3-5]。因此，木霉菌在作物病害生物防治、農(nóng)藥減施增效方面具有重要的研究、開發(fā)及應(yīng)用價(jià)值。膠霉毒素(Gliotoxin)，簡(jiǎn)稱膠毒素，是一種真菌次生代謝產(chǎn)物，因其對(duì)細(xì)菌、放線菌以及真菌等具有顯著的拮抗作用，已被開發(fā)成抗生素或化療藥物[6]。木霉屬中的部分菌種可產(chǎn)生膠毒素，該物質(zhì)對(duì)病毒、細(xì)菌等均有抑制效果[7-8]。

膠毒素合成的分子機(jī)制在煙曲霉中研究較為深入：在煙曲霉基因組調(diào)控膠毒素合成的基因簇即gli基因簇中包含了12 個(gè)基因(gliA,gliC,gliF,gliG,gliK,gliM,gliN,gliJ,gliI,gliH,gliZ,gliT)共同調(diào)控著煙曲霉膠毒素的合成[9]，目前，簇內(nèi)gliP、gliC、gliZ、gliA、gliT在煙曲霉膠毒素合成途徑中的作用已經(jīng)較為清晰[10～14]。已有研究表明綠木霉菌(Trichodermavirens)中的部分菌株可產(chǎn)生膠毒素，并通過(guò)脈沖標(biāo)記明確了綠木霉菌液體培養(yǎng)過(guò)程中膠毒素含量的動(dòng)態(tài)變化情況[15]，但是綠木霉菌膠毒素合成分子調(diào)控機(jī)制方面的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于煙曲霉膠毒素的研究。雖然Vargas等[16]對(duì)T.virens菌株Gv29-8中的gliP基因進(jìn)行基因敲除，明確了該基因與綠木霉膠毒素的合成有關(guān)，然而，在分子水平上深入剖析綠木霉菌膠毒素合成的分子調(diào)控機(jī)制仍需要進(jìn)行大量的科研工作。因此，開展綠木霉菌膠毒素合成基因的克隆及功能研究，有利于對(duì)膠毒素合成代謝的分子調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入研究，有利于從分子水平上闡明木霉生防菌的拮抗機(jī)理，為進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供重要的理論基礎(chǔ)。

本研究室前期通過(guò)生物信息學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)綠木霉菌T23基因組中存在1 個(gè)與煙曲霉膠毒素合成基因簇有同源性的基因簇，簇內(nèi)有8 個(gè)候選基因，分別命名為gliP-T、gliC-T、gliN-T、gliK-T、gliI-T、gliG-T、gliF-T、gliM-T[17]。為進(jìn)一步研究綠木霉菌膠毒素合成的分子調(diào)控機(jī)制，本研究擬以綠木霉菌T23為研究對(duì)象，通過(guò)改良的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化(Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation, ATMT)技術(shù)，對(duì)T23膠毒素合成基因簇內(nèi)編碼帶甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)蛋白的gliN-T基因進(jìn)行敲除，分析基因敲除突變體中膠毒素含量變化情況，明確gliN-T對(duì)膠毒素合成的調(diào)控作用，為后續(xù)的膠毒素代謝調(diào)控機(jī)制的深入剖析提供重要的理論基礎(chǔ)，同時(shí)為膠毒素的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考信息。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)菌為生防綠木霉菌T23，由本研究室從川產(chǎn)道地中藥材根際土樣中分離得到[18]。

細(xì)胞壁裂解酶Glucanex(Sigma-Aldrich，L1412，美國(guó))；E.Z.N.A.?Fungal DNA Kit(Omega Biotek，D3390=01，美國(guó))；膠毒素標(biāo)準(zhǔn)品(1 mg，Lot number: 1D0E12, 純度>99%，青島普瑞邦生物工程有限公司)；高效硅膠GF254預(yù)制板(青島海洋化工有限公司)；試驗(yàn)所需引物的合成及測(cè)序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 儀器設(shè)備及試劑

高效液相色譜1200型，配紫外檢測(cè)器G1314B(安捷倫科技有限公司，美國(guó))；C18反相色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm, Pribolab, Singapore)；色譜純甲醇(美國(guó)Fisher)；

1.3 培養(yǎng)基及相關(guān)試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato dextrose agar, PDA)用于綠木霉菌T23的培養(yǎng)；LB培養(yǎng)基用于大腸桿菌及農(nóng)桿菌的培養(yǎng)；IM液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基用于ATMT誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化[19]，121 ℃高溫高壓滅菌后，加入終濃度為200 μmol/L的乙酰丁香酮；共培養(yǎng)基用于農(nóng)桿菌和分生孢子的共培養(yǎng)，其配方在IM培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，每升共培養(yǎng)基只需加入葡萄糖1 g，加入瓊脂粉 15 g，121 ℃高溫高壓滅菌后加入終濃度為 200 μmol/L 的乙酰丁香酮，倒平板待用。

篩選培養(yǎng)基即PDA培養(yǎng)基高溫高壓滅菌后，加入終濃度為150 μg/mL的潮霉素B后倒平板待用。

1.4 基因敲除載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化子的分子鑒定

1.4.1DNA 提取

將供試綠木霉菌株T23活化于PDA平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2～3 d后，用接種環(huán)挑取新鮮菌絲接種到馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(Potato dextrose broth, PDB)中，28 ℃振蕩培養(yǎng)2～3 d，待菌絲體生長(zhǎng)茂盛的時(shí)候，用滅菌紗布和濾紙過(guò)濾收集菌絲體，用紙巾盡量吸干菌絲體中的水分后置于滅菌研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，然后用E.Z.N.A.?Fungal DNA Kit(Omega Biotek，D3390=01，美國(guó))進(jìn)行基因組DNA的提取，具體操作依照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4.2基因敲除載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化子的分子鑒定

按照同源敲除的原理構(gòu)建基因敲除載體(圖1)：分別以gliN-T的5′端1 016 bp (LF)及3′端 892 bp(RF)作為同源臂；以構(gòu)巢曲霉啟動(dòng)子PtrpC啟動(dòng)的潮霉素基因(hph)，即潮霉素表達(dá)盒作為基因替換片段，按照LF::PtrpC-hph::RF的順序，組裝到攜帶有CaMV poly(A)終止子元件的基因敲除載體pGKO2中。根據(jù)PtrpC-hph序列設(shè)計(jì)正反方向引物，即hyp-F與hyp-R，用于轉(zhuǎn)化子潮霉素盒的檢測(cè)；同時(shí)根據(jù)LF序列設(shè)計(jì)正向引物gliN-F，根據(jù)RF序列設(shè)計(jì)反向引物gliN-R，用于同源重組轉(zhuǎn)化子的分子鑒定。引物信息見(jiàn)表1。

圖1 基因敲除同源置換原理
Fig.1 Gene knockout strategy based on homologous recombination

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

注：引物序列5′末端的小寫字母為無(wú)縫拼接所需的同源重組序列；*,野生型和突變體擴(kuò)增片段大小。

Note： Lowercase letters on the 5′-end present the homology of the adjacent fragment for vector construction using seamless cloning; *, length of PCR fragments of wild type and mutant.

1.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的改良

1)取攜帶有基因敲除構(gòu)建體的陽(yáng)性農(nóng)桿菌C58C1在LB培養(yǎng)基上劃線，28 ℃培養(yǎng)36 h，挑取單菌落到帶抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，離心收集菌體，隨后用IM誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含終濃度為200 μmol/L的乙酰丁香酮)重懸浮菌體并調(diào)節(jié)OD600至0.2～0.3，然后28 ℃振蕩培養(yǎng)6 h，備用。

2)綠木霉分生孢子懸浮液的制備：在PDA培養(yǎng)基上活化綠木霉菌株T23，28 ℃培養(yǎng)4 d左右至產(chǎn)孢，用滅菌水輕輕地刮洗菌面，3 層擦鏡紙過(guò)濾菌絲，4 000 r/m離心5～10 min收集分生孢子。倒掉上清，加入細(xì)胞壁裂解酶Glucanex(終濃度為15 mg/mL，溶于0.7 mol/L NaCl溶液)，30 ℃ 80 r/m 振蕩培養(yǎng)2.5～3.0 h，4 000 r/m離心，用0.7 mol/L NaCl溶液清洗1～2 遍，3 層擦鏡紙過(guò)濾收集分生孢子液，調(diào)節(jié)分生孢子濃度至106個(gè)/mL。

3)取等體積(200 μL)的農(nóng)桿菌菌液及孢子懸浮液進(jìn)行混合后均勻涂布于共培養(yǎng)平板培養(yǎng)基中，22 ℃ 暗培養(yǎng)3 d。隨后，在共培養(yǎng)好的平板上倒1 層含潮霉素(終濃度150 μg/mL)及頭孢抗生素(終濃度400 μg/mL)的PDA篩選培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng) 5 d 左右，挑取能在篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子到新的篩選培養(yǎng)基中，進(jìn)行潮霉素穩(wěn)定性鑒定。

1.6 基因表達(dá)分析

參照已有報(bào)道[17]提取野生型T23和基因敲除突變體ΔgliN-T的總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。在gliN-T基因外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)引物，在轉(zhuǎn)錄組水平上檢測(cè)gliN-T在突變體中的表達(dá)情況。引物詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

1.7 膠毒素的提取及檢測(cè)

1.7.1薄層色譜分析

將供試菌株接種到100 mL PDB培養(yǎng)基中，28 ℃ 震蕩培養(yǎng)48 h，用孔徑為0.22 μm的濾膜過(guò)濾培養(yǎng)液，取20 mL濾液，加入等體積的乙酸乙酯萃取2 次，合并萃取液，置于通風(fēng)櫥中揮干得到待測(cè)樣品后用2 mL甲醇溶解作為薄層鑒別供試品。取膠毒素對(duì)照品1 mg，加入2 mL甲醇溶液，超聲5 min，得到濃度為0.5 mg/mL的膠毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，作為薄層分析的對(duì)照品溶液。以高效硅膠GF254預(yù)制板作為薄層板，以正己烷-乙酸乙酯體積比為6∶6作為展開劑，在254 nm的紫外光下觀察薄層板的展開情況，隨后用碘蒸汽對(duì)薄層板進(jìn)行顯色。

1.7.2高效液相色譜檢測(cè)

挑取新鮮菌絲接種至200 mLPDB培養(yǎng)基中， 28 ℃中震蕩培養(yǎng)48 h后取2 mL培養(yǎng)液并用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾至進(jìn)樣瓶中待用。按照以下的色譜條件對(duì)培養(yǎng)液中的膠毒素進(jìn)行檢測(cè)：以水為流動(dòng)相A，甲醇為流動(dòng)相C，按照50%水加50%甲醇進(jìn)行等度洗脫；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 通過(guò)改良的ATMT技術(shù)獲得gliN-T基因敲除突變體

在細(xì)胞壁溶解酶Glucanex處理試驗(yàn)前，共進(jìn)行了3 批次的遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)共篩選到3 個(gè)轉(zhuǎn)化子。分子鑒定結(jié)果表明這3 個(gè)轉(zhuǎn)化子均為異位整合轉(zhuǎn)化子。在分生孢子液中添加終濃度為15 mg/mL的細(xì)胞壁溶解酶Glucanex進(jìn)行處理后，篩選得到22 個(gè)轉(zhuǎn)化子，潮霉素基因檢測(cè)陽(yáng)性率為100%，基因特異引物鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2：在22 個(gè)轉(zhuǎn)化子中：有3 個(gè)是同源重組轉(zhuǎn)化子，即成功敲除gliN-T的基因敲除突變體ΔgliN-T；有2 個(gè)轉(zhuǎn)化子檢測(cè)到潮霉素基因，但檢測(cè)不到同源敲除的條帶，為非正常轉(zhuǎn)化子；其余17 個(gè)是異位整合轉(zhuǎn)化子。對(duì)溶解酶處理前后的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)綠木霉菌T23分生孢子經(jīng)細(xì)胞壁溶解酶Glucanex處理后，平均每毫升分生孢子液的轉(zhuǎn)化子數(shù)從0.25 個(gè)提升到10.00 個(gè)，轉(zhuǎn)化效率大大提高(表2)。

M：DL15000；T23：野生型T23 DNA擴(kuò)增產(chǎn)物；1～8：基因敲除轉(zhuǎn)化子DNA擴(kuò)增產(chǎn)物(1～3為同源重組陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，4～5為非正常轉(zhuǎn)化子，6～8為異位整合轉(zhuǎn)化子)。 M: DL15000; T23: amplicon from wildtype T23 gDNA; 1-8 are amplicons from transformants gDNA: 1-3 represent homologous transformants; 4-5 are unusual transformants; 6-8 are ectopic transformants.
圖2 Glucanex處理后獲得的轉(zhuǎn)化子的分子鑒定
Fig.2 Molecular identification for transformants after glucanex treatment

2.2 gliN-T在基因敲除突變體中的表達(dá)分析

對(duì)野生型T23及基因敲除突變體ΔgliN-T中的gliN-T進(jìn)行RT-PCR表達(dá)分析，結(jié)果表明：在野生型T23基因組及cDNA中均檢測(cè)到gliN-T的表達(dá)； 在轉(zhuǎn)錄水平上，在基因敲除突變體ΔgliN-T中檢測(cè)不到gliN-T的表達(dá)(圖3)，意味著gliN-T基因被成功敲除。

表2 Glucanex處理前后木霉菌T23 ATMT轉(zhuǎn)化效果比較Table 2 Comparison of transformant efficiency before and after Glucanex treated for T23

M：DL2000；1：T23 gDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物；2：T23 cDNA 擴(kuò)增產(chǎn)品；3：ΔgliN-TcDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物；4：陰性對(duì)照，以H2O為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物。 M， DL2000; 1， amplicon from T23 gDNA; 2， amplicon from T23 cDNA; 3， amplicon fromΔgliN-TcDNA; 4， amplicon from H2O as negative control.
圖3gliN-T在基因敲除突變體ΔgliN-T中的表達(dá)分析
Fig.3 Expression analysis forgliN-Tin gene knockout mutantΔgliN-T

2.3 gliN-T基因敲除突變體膠毒素代謝產(chǎn)物的檢測(cè)

對(duì)野生型與基因敲除突變體ΔgliN-T的48 h的培養(yǎng)液進(jìn)行薄層色譜分析，膠毒素標(biāo)準(zhǔn)品上樣量為5 μL，供試樣品上樣量為10 μL。薄層色譜分析結(jié)果表明，在野生型T23 48 h培養(yǎng)液中可檢測(cè)到膠毒素(圖4，泳道2和4)；而相同培養(yǎng)條件下，基因敲除突變體ΔgliN-T的培養(yǎng)液則無(wú)法檢測(cè)到膠毒素(圖4，泳道3)。

為了進(jìn)一步明確膠毒素的分泌是否與菌絲生長(zhǎng)時(shí)期有關(guān)，本研究對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)期(24、48、72和96 h)的野生型T23及基因敲除突變體ΔgliN-T的菌絲培養(yǎng)液分別進(jìn)行了高效液相色譜檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在28 ℃，120 r/m的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)24 h時(shí)，野生型T23培養(yǎng)液中檢測(cè)不到膠毒素，在48、72、96 h的培養(yǎng)液中均檢測(cè)到膠毒素；而在相同的培養(yǎng)條件下，基因敲除突變體ΔgliN-T在4 個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期的培養(yǎng)液中均未檢測(cè)到膠毒素(表3)。

(a) 薄層板在254 nm紫外光下的薄層檢測(cè)結(jié)果；(b) 經(jīng)過(guò)蒸汽碘顯色后的薄層色譜圖 1和5：膠毒素標(biāo)準(zhǔn)品；2和4：野生型T23培養(yǎng)液萃取樣品；3：突變菌株培養(yǎng)液萃取物。 (a) chromatography under 254 nm UV light; (b) chromatography after vapor iodine staining 1 and 5， gliotoxin standard substrate; 2 and 4， extraction from wild type T23; 3， extraction fromΔgliN-T.
圖4 薄層色譜法檢測(cè)T23及突變體膠毒素
Fig.4 Gliotoxin detection by TLC for T23 andΔgliN-T

表3 高效液相色譜檢測(cè)不同時(shí)間段培養(yǎng)液中的膠毒素含量
Table 3 Gliotoxin detection for different time-period culture filtrate by HPLC mAU·S

菌株Strain培養(yǎng)時(shí)間/hCulture time24487296T23-436.30 401.99240.34ΔgliN-T----

注：“-”表示在相同液相色譜條件下未檢測(cè)到峰值。

Note： - represents no peak is detected under the same HLPC condition.

3 討論與結(jié)論

高效率的基因敲除技術(shù)是進(jìn)行絲狀真菌基因功能研究的重要生物技術(shù)之一。目前應(yīng)用于絲狀真菌基因敲除的轉(zhuǎn)化技術(shù)包括分生孢子電擊轉(zhuǎn)化[20]、基于菌絲原生質(zhì)體的PEG/CaCl2轉(zhuǎn)化[21]、基因槍轉(zhuǎn)化及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化(ATMT)[22]等。其中，ATMT技術(shù)因成本低、操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化效率高、遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到各類絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化中[23]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)雖然已經(jīng)在綠木霉菌(T.virens)中有成功應(yīng)用的報(bào)道[24-25]，但是轉(zhuǎn)化效率低，大大限制了T.virens重要基因的功能驗(yàn)證及開發(fā)利用。本研究對(duì)ATMT技術(shù)進(jìn)行改良，在T.virensT23的分生孢子液中添加細(xì)胞壁溶解酶，轉(zhuǎn)化效率是對(duì)照組的40 倍，并通過(guò)改良的ATMT技術(shù)獲得膠毒素合成候選基因gliN-T的基因敲除突變體，這將為深入研究T.virensT23膠毒素合成的分子調(diào)控機(jī)制提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

甲基轉(zhuǎn)移酶是一類普遍存在于生物體內(nèi)的重要酶類，參與生物體的甲基化反應(yīng)，對(duì)生物體次生代謝產(chǎn)物的合成具有重要的調(diào)控作用[26-27]。在煙曲霉膠毒素合成基因簇內(nèi)存在著2 個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶基因(gliN及gliM)，但是，尚未見(jiàn)有關(guān)煙曲霉膠毒素合成基因簇內(nèi)甲基轉(zhuǎn)移酶基因的功能研究報(bào)道。

本研究利用改良的ATMT技術(shù)對(duì)gliN-T進(jìn)行基因敲除并獲得突變體，發(fā)現(xiàn)敲除gliN-T基因后，T.virensT23膠毒素的合成受到抑制，gliN-T參與了調(diào)控T23膠毒素的合成。在膠毒素合成基因簇內(nèi)存在著gliN-T及gliM-T2 個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶基因，這2 個(gè)基因甲基化底物是否相同？其在調(diào)控膠毒素合成途徑中各扮演著什么角色？這些問(wèn)題有待深入探索。