楊 智 唐 棟 曹 磊 楊光誠

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性腦腫瘤，占原發(fā)性腦腫瘤的70%以上。盡管過去幾十年里，膠質(zhì)瘤的治療取得了長足進步，但是總體生存率未見明顯提高[1]。微小RNA（microRNA，miRNA）在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，對腫瘤的早期診斷也有重要意義[2]。既往研究證實，外泌體miRNA非常穩(wěn)定，因此適合作為潛在的生物學標志物[3]。外泌體miRNA可作為腫瘤早期診斷、治療及預(yù)后的生物學標志物。本文探討膠質(zhì)瘤病人血清外泌體miRNA-30a-5p的表達水平，及其在診斷及預(yù)后評估中的價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2014年1月至2015年12月收治的膠質(zhì)瘤60 例為研究對象，其中男32 例，女28 例；年齡10～78 歲，平均（47.36±8.01）歲。納入標準：術(shù)前未接受手術(shù)或放化療；術(shù)后病理組織學檢查證實為膠質(zhì)瘤；病例資料完整。排除標準：合并其他類型腫瘤；復(fù)發(fā)性膠質(zhì)瘤；合并急慢性感染性疾病。另選取健康體檢者40 例為對照，其中男22 例，女18 例；年齡18～56 歲，平均（44.39±11.11）歲。本研究已經(jīng)過本院倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 外泌體的分離 膠質(zhì)瘤病人術(shù)前抽取空腹肘靜脈血5 ml，取血清800 μl，4 ℃條件下2 000轉(zhuǎn)/min離心20 min，取上清液。加入1/3體積的外泌體分離試劑（北京天恩澤基因科技有限公司），混勻。4 ℃下靜置20 min，15 000轉(zhuǎn)/min離心2 min。棄去上清液，以50 μl 的PBS 重懸沉淀，分裝后在-70 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 外泌體電鏡觀察 將凍存的外泌體重懸液于室溫下放置10～15 min使其溶解。取10 μl外泌體滴加于銅網(wǎng)上沉淀60 s，用濾紙吸取懸液。取醋酸雙氧鈾（北京中鏡科儀技術(shù)有限公司）10 μl 滴加于銅網(wǎng)上沉淀60 s，吸干液體。在常溫下干燥10 min，用Tecnai Spirit G2透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)。

1.4 免疫印跡法法檢測外泌體標志物CD63 的表達將凍存的外泌體重懸液室溫下放置10～15 min 使其溶解。用Nanosight 系統(tǒng)（英國Malvern 公司）檢測外泌體的濃度。檢測濃度為1.0 μg/μl 和0.5 μg/μl 時外泌體CD63 的表達情況。取100 μl，向其中加入RIPA細胞裂解液（北京索萊寶科技有限公司），提取蛋白。用BCA試劑盒（美國Sigma公司）進行蛋白定量檢測，隨后進行SDS-PAGE凝膠電泳，將分離的蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。用5%脫脂牛奶封閉，加入兔抗人CD63 單克隆抗體（1∶1000，美國Sigma 公司），4 ℃孵育過夜。TBST洗滌3次后加入羊抗兔二抗（1∶5 000，美國Sigma公司），溫室下作用1 h，再用TBST洗滌3次。最后用ECL顯影。內(nèi)參為GAPDH。

1.5 RT-PCR 檢測外泌體miRNA-30a-5p 表達水平將凍存的外泌體重懸液室溫下放置10～15min 使其溶解。取100 μl，用miRNAOUT試劑盒（上海雅吉生物科技有限公司）提取樣本miRNA，隨后進行miRNA逆轉(zhuǎn)錄。miRNA-30a-5p引物由蘇州泓迅生物科技股份有限公司設(shè)計并提供，上游引物5′-GCCGGCGCCCGAGCTCTGGCTC-3′，下游引物5′-TGTAAACATCCTCGACTGGAAG-3′。用RT-PCR 試劑盒（美國Sima公司）檢測miRNA相對表達量。以U6作為內(nèi)參（上游引物5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACAT-3′，下 游 引 物5′-TACCTTGCGAAGTGCTTAAAC-3′）。用2-△CT計算miRNA-30a-5p的表達量。

1.6 隨訪 采用門診及電話方式進行隨訪。術(shù)后半年內(nèi)，每3個月隨訪1次；此后，每半年隨訪1次?？偵嫫冢╫verall survival，OS）定義為術(shù)后第一天至死亡或最后一次隨訪。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0進行分析；正態(tài)分布計量資料用±s 表示，用t 檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗；等級資料用秩和檢驗；受試者工作特性（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析診斷價值，計算曲線下面積（area under curve，AUC）、靈敏度和特異度；用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，采用logrank檢驗；多因素Cox比例回歸風險模型分析危險因素；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體標志物CD63的表達情況 電鏡下外泌體呈圓形囊泡狀，單個分布或聚集分布，囊泡外周可見膜性結(jié)構(gòu)，直徑在60～150 nm（圖1）。1.0 μg/μl 外泌體的CD63相對表達量明顯高于0.5 μg/μl外泌體（圖2）。

2.2 膠質(zhì)瘤血清外泌體miRNA-30a-5p 的表達水平膠質(zhì)瘤病人血清外泌體miRNA-30a-5p相對表達量明顯高于正常人（P＜0.001，圖3）。

2.3 血清外泌體miRNA-30a-5p 診斷膠質(zhì)瘤的價值ROC 曲線分析顯示，血清外泌體miRNA-30a-5p 診斷膠質(zhì)瘤的AUC 為0.901（95%置信區(qū)間0.812～0.986），最佳截斷值為0.601。miRNA-30a-5p 表達量為0.601時，診斷膠質(zhì)瘤的靈敏度和特異度分別為78.05%和93.55%（圖4）。

表1 膠質(zhì)瘤病人預(yù)后影響因素的Cox比例回歸風險模型分析結(jié)果

2.4 血清外泌體miRNA-30a-5p 與膠質(zhì)瘤病人預(yù)后的關(guān)系 術(shù)后60 例均得到有效隨訪，隨訪時間平均（28.39±3.25）個月。Kaplan-Meier 分析結(jié)果顯示，血清外泌體miRNA-30a-5p低表達病人總體生存時間高于高表達病人（P＜0.001，圖5）。多因素Cox 比例回歸風險模型分析結(jié)果顯示，WHO 分級高、KPS 評分低、miRNA-30a-5p 高表達是膠質(zhì)瘤病人不良預(yù)后的獨立影響因素（P＜0.05，表1）。

3 討論

外泌體miRNA 是近年來研究的熱點。外泌體miRNA 具有腫瘤特異性，在不同貯存條件下都較為穩(wěn)定[3]。miRNA 在膠質(zhì)瘤的篩查、診斷及預(yù)后評估中具有重要作用[5]。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤病人血清外泌體miRNA-30a-5p 表達水平明顯升高，可作為膠質(zhì)瘤早期診斷及判斷預(yù)后的指標。

miRNA-30a-5p 在膠質(zhì)瘤中的作用機制尚不明確。Wang等[6]發(fā)現(xiàn)，miRNA-30a-5p可以靶向調(diào)控神經(jīng)細胞粘附分子通過Wnt/β-catenin 通路促進膠質(zhì)瘤細胞增殖和侵襲。本文膠質(zhì)瘤病人血清外泌體miRNA-30a-5p 相對表達量為明顯高于正常人。血清外泌體miRNA 對膠質(zhì)細胞瘤的早期診斷有重要價值[7]。有學者發(fā)現(xiàn)，血清外泌體miRNA-310a有助于早期診斷膠質(zhì)瘤，靈敏度和特異度分別為82.6%和93.2%。

本文同樣發(fā)現(xiàn)，血清外泌體miRNA-30a-5p 診斷膠質(zhì)瘤的價值較高，靈敏度和特異度分別為78.05%和93.55%。Lan 等[8]發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤血清外泌體miRNA-310a 的表達水平明顯高于垂體腺瘤、腦膜瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)B 細胞淋巴瘤。這提示血清外泌體miRAN有助于顱內(nèi)腫瘤鑒別診斷。本文還發(fā)現(xiàn)，miRNA-30a-5p 高表達膠質(zhì)瘤病人較低表達病人生存期明顯縮短。多因素Cox比例回歸風險模型分析結(jié)果顯示血清外泌體miRNA-30a-5p高表達是膠質(zhì)瘤病人預(yù)后不良的獨立危險因素。這提示血清外泌體miRNA-30a-5p可作為膠質(zhì)瘤預(yù)后評估指標。