許強(qiáng)華 陳新軍 劉平非 謝 騰 陳曉巍 陳治軍

傳統(tǒng)的手術(shù)治療聯(lián)合術(shù)后放療、化療對(duì)惡性膠質(zhì)瘤的治療效果有限[1]。近年來(lái)，尋求惡性膠質(zhì)瘤新的治療方法越來(lái)越被重視。由于傳統(tǒng)的腫瘤放療、化療與病毒生物療法并無(wú)交叉耐藥性，因此，可以聯(lián)合傳統(tǒng)放療、化療與病毒治療，以達(dá)到協(xié)同或疊加效應(yīng)[2]。 本文探討組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）抑 制 劑 曲 古 抑 菌 素 A（tropicostatin A，TSA）聯(lián)合野生型Ⅰ型單純皰疹病毒（herpes simplex virus typeⅠ，HSV-1）對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞（C6 細(xì)胞）增殖、凋亡的影響，為HDAC抑制劑聯(lián)合溶瘤病毒生物治療惡性膠質(zhì)瘤提供參考。

1 材料與方法

1.1 C6 細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)復(fù)蘇C6 鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞株（中科院細(xì)胞庫(kù)），DMEM+10%FBS+1%雙抗（美國(guó)Gibco公司），T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶表面80%～90%，0.25%胰酶（吉林省吉諾生物工程有限責(zé)任公司）消化2 min，加新鮮完全培養(yǎng)基終止消化，用移液器輕輕吹散細(xì)胞，收集至15 ml離心管中，1 000轉(zhuǎn)/min 離心5 min，去上清，加入新鮮完全培養(yǎng)基吹散細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞懸液按3×104/cm2移至新的培養(yǎng)瓶中傳代。

1.2 HSV-1病毒擴(kuò)增及滴度測(cè)定 接種HSV-1（武漢大學(xué)病毒研究所饋贈(zèng)）懸液0.5 ml 于已鋪有細(xì)胞的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，待80%的細(xì)胞出現(xiàn)病變后，反復(fù)凍融三次，通過CsCl 密度梯度離心法進(jìn)行抽提、純化HSV-1。最后通過空斑形成實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確測(cè)定其滴度。

1.3 CCK-8 法檢測(cè)C6 細(xì)胞增殖活性 細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/ml。96孔板上每孔加入100 μl 細(xì)胞懸液，恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。次日置換新鮮培養(yǎng)基。每孔培養(yǎng)體積200 μl，設(shè)對(duì)照組（加入等體積培養(yǎng)基）、TSA 組（加入0.5×10-3μmol/L TSA 處理）、HSV-1（加入10 MOI HSV-1 處理）及TSA+HSV-1 組（加入0.5×10-3μmol/L TSA 和10 MOI HSV-1 處理）共4 組，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。另設(shè)空白調(diào)零孔。培養(yǎng)48、72 h 后，每孔加入10 μl CCK-8 溶液（東仁化學(xué)科技有限公司），培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。室溫平衡后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度。計(jì)算各組細(xì)胞增殖活性。

1.4 C6 細(xì)胞凋亡率的檢測(cè) 同CCK-8 法制備細(xì)胞懸液及分組。培養(yǎng)48、72 h 后，棄去培養(yǎng)基，漂洗后胰酶消化，加完全培養(yǎng)基離心，棄上清。將細(xì)胞重懸于400 μl 結(jié)合緩沖液中，每管加入5 μl Annexin VFITC 和5 μl PI（美國(guó)BD 公司），室溫避光孵育15 min，混勻，70 μm 篩網(wǎng)過濾，轉(zhuǎn)移至流式管，1 h 內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 RT-PCR 檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）mRNA 表達(dá)水平 取細(xì)胞樣品，加入1 ml RNAiso Plus（Trizol），吹打細(xì)胞，加入200 μl氯仿，混均、離心，吸取上清至另一離心管中，加入等量的異丙醇混勻，-20 ℃沉淀，4 ℃離心，棄上清。加入1 ml 75%乙醇，4 ℃離心，棄上清，真空干燥5～10 min。20 μl DEPC H2O 溶解RNA 樣品，RNA純度的測(cè)定和RNA 的定量以DEPC H2O 為對(duì)照，取2 μl RNA溶液于酶標(biāo)儀上檢測(cè)樣本濃度和質(zhì)量。將RNA 樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。引物序列：VEGF 正義鏈5'-TCACCGGAAAGACCGATTAAC-3'，反義鏈5'-CCCTTCATGTCAGGCTTTCT-3'；內(nèi)參GAPDH 正義鏈5'-AGACAGCCGCATCTTCTTGT-3'，反義鏈5'-CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT-3'。1.6 免疫印跡法檢測(cè)VEGF蛋白水平 將細(xì)胞樣品用胰酶消化、離心、洗滌后轉(zhuǎn)移至EP管中，加入200 μl的RIPA冰上裂解30 min，4 ℃離心15 min，上清轉(zhuǎn)移至離心管，用BCA 法檢測(cè)細(xì)胞裂解液的蛋白濃度。通過制膠，樣品處理后上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育，顯影拍照分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析；計(jì)量資料以±s 表示，采用方差分析；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TSA 聯(lián)合HSV-1 對(duì)C6 細(xì)胞增殖活性的影響 處理48、72 h，TSA 組、HSV-1 組、TSA+HSV-1 組C6 細(xì)胞增殖活性較對(duì)照組顯著降低（P＜0.05），而且，TSA+HSV-1 組C6 細(xì)胞增殖活性較TSA 組和HSV-1組明顯降低（P＜0.05）。見圖1。

2.2 TSA 聯(lián)合HSV-1 對(duì)C6 細(xì)胞凋亡率的影響 處理48、72 h，TSA 組、HSV-1 組、TSA+HSV-1 組C6 細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組顯著增高（P＜0.05），而且，TSA+HSV-1 組C6 細(xì)胞凋亡率較TSA 組和HSV-1 組明顯增高（P＜0.05）。見圖2。

2.3 TSA聯(lián)合HSV-1對(duì)C6細(xì)胞VEGF表達(dá)水平的影響 處理48、72 h，TSA 組、HSV-1 組、TSA+HSV-1 組C6細(xì)胞VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低（P＜0.05），而且，TSA+HSV-1 組C6 細(xì)胞VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平較TSA組和HSV-1組明顯降低（P＜0.05）。見圖3、4。

3 討論

溶瘤病毒的溶瘤特性對(duì)治療惡性膠質(zhì)瘤具有極大潛力，并在很多基礎(chǔ)研究及臨床試驗(yàn)中得到了證實(shí)[3]。HSV-1為研究最早的溶瘤病毒，為了提高溶瘤病毒治療的安全性、靶向性及溶瘤效應(yīng)，目前已研發(fā)出多種基因重組HSV-1[4]。

組蛋白乙酰化調(diào)控基因表達(dá)是重要的表觀遺傳學(xué)修飾機(jī)制之一。研究表明，由于乙?；慕M蛋白分子電荷的改變，使染色體結(jié)構(gòu)松散而增加轉(zhuǎn)錄因子和其它轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)分子結(jié)合到基因啟動(dòng)子的機(jī)會(huì)，激活腫瘤抑制基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[5，6]；同時(shí)也通過導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞周期停滯、阻止癌基因表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞增殖[7～9]。

一直以來(lái)，傳統(tǒng)的放療與化療的聯(lián)合作用較易出現(xiàn)交叉耐藥，導(dǎo)致治療效果不理想。由于目前還沒有關(guān)于腫瘤細(xì)胞對(duì)化療和溶瘤病毒交叉耐藥的報(bào)道，更重要的是，大多數(shù)情況下，對(duì)化療抵抗的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)溶瘤病毒治療的敏感[3]。本研究應(yīng)用體外C6細(xì)胞模型，結(jié)果顯示，TSA+HSV-1聯(lián)合作用較各單一作用效果更好。這說明TSA 聯(lián)合HSV-1對(duì)體外培養(yǎng)的C6 細(xì)胞可產(chǎn)生協(xié)同或疊加殺傷作用。另外，TSA+HSV-1 聯(lián)合作用明顯降低C6 細(xì)胞VEGF 表達(dá)式平，這提示TSA+HSV-1 聯(lián)合作用抗腫瘤效應(yīng)可能與降低VEGF表達(dá)有關(guān)。