王書妍，孟迎迎，薛 松

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 化學(xué)與材料學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028043；2.中國科學(xué)院 大連化學(xué)物理研究所 海洋生物工程組，遼寧 大連 116023；3.大連理工大學(xué) 環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116024）

蝦青素，化學(xué)命名為3，3’-二羥基-β，β’-胡蘿卜素-4，4’-二酮，屬于酮式類胡蘿卜素.研究表明，蝦青素為自然界最強的抗氧化劑［1-2］.蝦青素具有抗氧化性、抗輻射、抗衰老、抗腫瘤及防治心血管疾病等功能［2-3］，因此具有極高的經(jīng)濟價值，已應(yīng)用于保健品、藥品、飼料添加劑、化妝品、功能食品、食品添加劑等方面［4］.蝦青素生產(chǎn)的原料主要來自蝦蟹殼［3，5］、雨生紅球藻［4］及紅法夫酵母［6］中，其中雨生紅球藻中在脅迫條件下可積累蝦青素達到干重的5%.由于蝦青素結(jié)構(gòu)中有兩個手性C 原子，雨生紅球藻中的結(jié)構(gòu)為3S，3S’構(gòu)型，而合成的為手性混合物，以3R，3R’構(gòu)型為主，雨生紅球藻被認為是天然蝦青素生產(chǎn)的最佳來源.

雨生紅球藻在脅迫后形成膠殼狀外壁，細胞內(nèi)色素提取時，常規(guī)的溶劑很難進入細胞內(nèi)部將色素萃出，通常需要結(jié)合破壁方法.其次，雨生紅球藻細胞內(nèi)蝦青素主要以蝦青素酯的形式存在，即不同?；溄Y(jié)合的蝦青素單酯分子、蝦青素雙酯分子，存在HPLC分析難以對其所有分子達到基線分離，且含量計算時分子量的不同.另外，蝦青素在光熱等條件下不穩(wěn)定易發(fā)生降解，因此，造成蝦青素的準確測定存在一定問題.本文從雨生紅球藻中蝦青素的提取、水解及檢測等方面對目前的研究狀況進行了綜述，以期能夠指導(dǎo)基于不同目的的快速測定雨生紅球藻中蝦青素的含量選擇合適的方法提供指導(dǎo).

1 雨生紅球藻中蝦青素的提取

蝦青素的提取是準確測定其含量的基礎(chǔ)，也是蝦青素測不準的環(huán)節(jié)之一.脅迫條件下雨生紅球藻細胞蝦青素積累，但細胞生長及分裂停止，形成不動孢子即膠殼細胞.成熟的膠殼細胞具有三層厚、硬的細胞壁，最外層為膠鞘（Algaenan），一種強抗醋酸水解的材料.第二、三層分別為均勻和非均勻分布的甘露糖和纖維素［7］.對于具有膠殼外壁的雨生紅球藻，常規(guī)的溶解提取法無法進入細胞內(nèi)部將色素萃出.目前在工業(yè)中對于雨生紅球藻中蝦青素采用超臨界CO2萃取技術(shù)［7］、高壓/超高壓均質(zhì)提取技術(shù)［8］、負壓空化法［9］等.上述幾種方法可有效提取蝦青素，但需要藻粉量大，操作復(fù)雜，適合大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn).應(yīng)用于雨生紅球藻中蝦青素檢測的提取方式包括溶劑提取法、機械研磨+溶劑提取法、二甲基亞砜（DMSO）浸提法以及纖維素酶破壁+溶劑提取法.

1.1 溶劑提取法

溶劑浸提法操作簡便、成本低、對設(shè)備要求低，只需對提取溶劑、料液比、提取溫度、提取時間進行優(yōu)化即可.常用的溶劑有丙酮［10］，乙酸乙酯、二氯甲烷及乙醇等.但由于雨生紅球藻膠殼外壁，常規(guī)溶劑并不能進入細胞，蝦青素的提取率較低.Mendes-Pinto等報道了丙酮作為雨生紅球藻中蝦青素的提取溶劑，提取率僅為4 mg·g-（1每克藻粉提取蝦青素質(zhì)量），而機械破碎+丙酮提取率為19 mg·g-1，說明溶劑并不能進入細胞內(nèi)，將蝦青素提取出來［10］.

Ruen-ngam比較了利用超聲輔助提取（Ultrasound Assisted Extraction）、微波輔助溶劑萃取（Microwave Assisted Extraction）、索式提?。⊿oxhlet Extraction）等輔助的溶劑提取法，其中微波輔助提取75 °C 5 min，蝦青素提取率達到74%［11］.此外，為增強溶劑的提取效率，化學(xué)破壁即利用酸或堿對雨生紅球藻細胞進行處理，Sarada等報道了利用濃度為2 mol·L-1的鹽酸溶液70 °C處理2 min，后利用溶劑進行提取，蝦青素的提取率可達86%～94%［12］.但值得注意的是將蝦青素置于高濃度的酸或堿溶液極易造成蝦青素的降解.上述的結(jié)果說明由于雨生紅球藻特殊的細胞壁組成，直接溶劑浸提無法進入細胞，而輔助的超聲、微波及酸堿處理均易造成蝦青素的降解，并不適合用于蝦青素的提取.

1.2 機械破壁+溶劑提取

機械破壁是利用外力將雨生紅球藻細胞壁破碎，是實驗室最常用的破壁方式.雨生紅球藻中蝦青素檢測的國標GB/T 31520-2015中［13］，將雨生紅球藻利用玻璃勻漿器充分研磨，二氯甲烷-甲醇為溶劑對其色素進行提取.機械破碎+溶劑的提取方法在蝦青素的檢測中應(yīng)用較多［10，14-16］.機械破碎能夠?qū)⒓毎谄茡p，其色素可達到完全提取，方法操作簡單，但此方法需要將每個樣品通過細胞勻漿器進行研磨，耗時、費力.

1.3 纖維素酶破壁+溶劑提取

由于雨生紅球藻細胞壁主要為纖維素、果膠、脂多糖等物質(zhì)組成，因此纖維素酶、果膠酶和多糖酶等應(yīng)用于雨生紅球藻的破壁處理［8］.周錦珂等探索了酶法提取雨生紅球藻中蝦青素的新工藝［17］.纖維素酶對藻粉進行酶解處理，乙醇提取.酶解法提取的最佳工藝條件為：酶解液初始pH值4.5、酶解溫度45 °C、酶用量1.5%、酶解時間15 h.在此條件下蝦青素的提取率達94.6%，比傳統(tǒng)的乙醇直接提取法高61.5%.具有操作溫度低、污染少、成本低、提取率高等方面的優(yōu)點，易于實現(xiàn)綠色工業(yè)化生產(chǎn)，但此方法耗時較長，且高溫也易造成蝦青素的降解.

1.4 DMSO浸提法

DMSO與各種溶劑均具有良好的互溶性，另外具有對細胞的良好的滲透性，常用于藥物或農(nóng)藥的滲透促進劑，及細胞凍存過程中的保護劑.Seely 首次報道了DMSO 可用于微藻葉綠素及類胡蘿卜素的提取［18］.Boussiba等利用DMSO對雨生紅球藻中的色素進行提取，70 °C水浴提取10 min，重復(fù)提取2～3次藻渣可達到無色［19］，說明DMSO良好的滲透性，可滲透進入雨生紅球藻細胞，將蝦青素完全提取出來.DMSO提取無需對雨生紅球藻的細胞壁進行處理，大大簡化了蝦青素提取的過程，已在蝦青素的檢測中得到應(yīng)用［20-21］.此外，世界微藻領(lǐng)軍企業(yè)Cyanotech 公司、日本Fuji 公司以及中國綠A 生物工程公司［8］等均對DMSO提取雨生紅球藻中蝦青素的方法應(yīng)用于蝦青素的檢測中.

利用DMSO作為溶脹劑，能夠增大細胞壁的通透性，可以作為雨生紅球藻蝦青素的提取劑，簡化的雨生紅球藻檢測中需要破壁的過程.

2 蝦青素酯的水解

雨生紅球藻中所積累的蝦青素為全反式3S，3S’構(gòu)型，末端環(huán)狀結(jié)構(gòu)中各有一個羥基，通常與C16、C18或C20脂肪酸酯化形成蝦青素酯，以穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)［22］.其中大部分為蝦青素單酯，約占75%，蝦青素雙酯約占20%，而游離蝦青素僅占5%［12，23］.雨生紅球藻中蝦青素單酯及雙酯分子數(shù)高達30種［24］，蝦青素酯的復(fù)雜性使得蝦青素純化和直接準確定量存在問題造成，因此需要將提取的蝦青素酯水解成游離蝦青素，實現(xiàn)單一物質(zhì)的純化和HPLC準確定量.通常蝦青素酯水解的方式有皂化和酶解兩種方法.

2.1 皂化法

皂化一般在NaOH或KOH甲醇溶液進行反應(yīng)，將蝦青素酯水解為游離蝦青素.Yuan等的研究指出皂化過程中高的堿濃度或反應(yīng)溫度有利于蝦青素酯的水解反應(yīng)的進行，同時也加劇了蝦青素的降解［14］.陳興才等的研究也顯示游離蝦青素的濃度隨著堿濃度的增加直線下降［25］.Yuan等研究蝦青素酯皂化下的水解動力學(xué)及不同堿濃度下蝦青素的降解，結(jié)果顯示在22 °C 反應(yīng)體系中NaOH 濃度為0.0175～0.020 mol·L-1時，蝦青素酯可水解完全，且不會發(fā)生蝦青素降解，而更高濃度的NaOH-甲醇溶液或反應(yīng)溫度則會引起蝦青素的明顯降解［26］.蝦青素酯皂化方法的條件苛刻，皂化過程中堿溶液的濃度，皂化溫度及時間均會影響皂化的效率及蝦青素的穩(wěn)定性，也是影響蝦青素的準確測定的另一個環(huán)節(jié).

2.2 酶解法

Zhao報道了一種來自圓弧青菌（Penicillium cyclopium）水溶性堿性酯酶能夠?qū)⑽r青素酯轉(zhuǎn)化為蝦青素，反應(yīng)條件為28 °C攪拌下孵化7 h，蝦青素的回收率達到63.2%［27］，但此酶酶解效率低，并未在蝦青素含量的測定中得到廣泛應(yīng)用.而Jacobs 首次報道了脂溶性膽固醇酯酶可以快速將類胡蘿卜素酯進行水解［28］.目前雖然文獻對此酶解方法的研究報道較少，但酶解法作為一種溫和的水解方式被生產(chǎn)蝦青素的國內(nèi)外公司應(yīng)用，所使用的膽固醇酯酶不僅能夠完全水解蝦青素酯，且不易造成蝦青素的氧化，可以更加準確的確定蝦青素的含量.

利用膽固醇酯酶對雨生紅球藻含蝦青素的提取物時間短，大幅提高雨生紅球藻中蝦青素的檢測效率.

3 雨生紅球藻中蝦青素的定量檢測

蝦青素的檢測方法主要有分光光度法、水解-HPLC法、HPLC-MS法.

3.1 分光光度法

Boussiba報道利用5%KOH-30%甲醇溶液加熱10 min左右破壞雨生紅球藻葉綠素，然后DMSO提取蝦青素，波長475 nm 測定其吸光度值以計算蝦青素濃度.此方法能夠快速估算蝦青素含量，在培養(yǎng)及生產(chǎn)中應(yīng)用較多［12，29］.但有報道顯示此方法中堿溶液破壞葉綠素的處理，造成蝦青素25%～40%的降解［16］.因此Li等對Boussiba的方法進行了改進，不經(jīng)堿液處理直接由DMSO進行提取，可見光530 nm波長進行檢測，避免了其他類胡蘿卜素及葉綠素干擾，應(yīng)用于雨生紅球藻中蝦青素含量的快速檢測［16］.耿金峰等的研究顯示雨生紅球藻在培養(yǎng)過程中體內(nèi)所含的類胡蘿卜素含量與蝦青素含量是呈穩(wěn)定的線性關(guān)系，使用直接較容易的測定類胡蘿卜素，間接獲得蝦青素含量的方法，可快速測定出類胡蘿卜素的含量，再根據(jù)所得的類胡蘿卜素和蝦青素的相關(guān)性，可快速推算出雨生紅球藻體內(nèi)蝦青素的含量.本實驗室的數(shù)據(jù)也顯示基于分光光度法測定的類胡蘿卜素與經(jīng)酶解-HPLC 測定的蝦青素的含量具有良好的線性（圖1）.因此，可以直接利用DMSO提取，利用分光光度法在475 nm下測定，利用圖1的關(guān)系即可獲得準確的蝦青素的含量.

分光光度法可作為雨生紅球藻培養(yǎng)過程中蝦青素監(jiān)控的快速檢測手段.

3.2 水解-HPLC法

雨生紅球藻提取色素經(jīng)皂化或酶解前處理后，HPLC 可對游離蝦青素進行準確測定.目前蝦青素測定的國標GB/T 31520-2015采用皂化后HPLC測定的方法［13］，分離色譜柱為反相C30柱，20 min可完成皂化后全反式游離蝦青素，9-順-蝦青素，13-順-蝦青素的檢測.Yuan利用C18柱對蝦青素酯皂化后產(chǎn)物進行分析，甲醇/二氯甲烷/乙腈/水作為流動相梯度洗脫，16 min 完成單樣檢測［30］.而Cyanotech 公司雨生紅球藻含量測定方法為將提取色素酶解后進行HPLC測定.這種經(jīng)水解前處理將蝦青素酯轉(zhuǎn)變?yōu)槲r青素可把含有蝦青素化合物的混合成分轉(zhuǎn)變?yōu)闄z測蝦青素單一成分，使HPLC分析更加簡單，能夠準確定量，重復(fù)性高.更多蝦青素反相色譜分離條件總結(jié)于表1中.

3.3 HPLC-MS法

由于提取蝦青素及其酯衍生物的多樣性及復(fù)雜性，常規(guī)的分光光度法及HPLC法并不能識別不同蝦青素酯分子間的差別，質(zhì)譜利用蝦青素酯分子間質(zhì)量及碎片信息的差別能夠較好的分辨不同的分子，進而進行定性及定量分析.提取的色素樣品不經(jīng)處理直接HPLC/MS的測定方法，避免了皂化過程中蝦青素的降解，可實現(xiàn)蝦青素、蝦青素酯分子、其他類胡蘿卜素及葉綠素的同時測定，在蝦青素成分確定及蝦青素代謝機理研究中具有一定應(yīng)用.Holtin等利用LC-（APCI）MS對雨生紅球藻中游離蝦青素異構(gòu)體、蝦青素單酯、蝦青素雙酯及葉黃素進行了定性分析［24］.Weesepoel 等利用ESI-IT及MADIL-TOF/TOF 對雨生紅球藻中的蝦青素酯進行了更加細致的分析，包括蝦青素酯?；湹拇_定，及順反異構(gòu)體的區(qū)分［32］.更多蝦青素及其酯衍生物的色譜分離總結(jié)于表1中.值得注意的是類胡蘿卜素及蝦青素酯的低極性，常用的軟電離ESI離子源難以將其離子化，APCI離子源較多的應(yīng)用于蝦青素酯的分析.

本文通過對目前雨生紅球藻中蝦青素的提取、水解及檢測方法進行了綜述與評估，DMSO溶劑提取后直接進行分光光度法在波長475 nm下進行檢測，根據(jù)分光光度法測定類胡蘿卜素含量與HPLC法蝦青素含量的線性關(guān)系快速計算蝦青素含量.此方法更利于快速獲得研究過程中的相關(guān)重要參數(shù).而DMSO提取后，膽固醇酯酶進行水解，HPLC 測定游離蝦青素的含量，可作為準確測定蝦青素含量的方法.對于不同的檢測目的，可以采用不同的方法進行分析，而不同實驗室或方法間的數(shù)據(jù)比較，應(yīng)該要把數(shù)據(jù)矯正到提取樣品的水解處理，HPLC分析之后的結(jié)果進行分析.

表1 文獻報道的蝦青素的HPLC及HPLC-MS測定條件Tab.1 The measurement conditions of astaxanthin by HPLC and HPLC-MS reported in the literature