袁華偉 ，王 鑫，王 連，鄧婺遠(yuǎn)，劉光錢，喻學(xué)淳，沈才洪，王松濤

（1.宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川宜賓 644000；2.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室，四川宜賓 644000；3.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州 646000；4.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州 646000）

雜醇油是含有3 個以上碳原子的一元醇類物質(zhì)的總稱，在白酒中含量較大，也是最重要的三大芳香組分（脂肪族酸類、脂肪族酯類、高級醇類）之一[1]。濃香型白酒中雜醇油的主要成分為異戊醇、異丁醇、正丙醇和正丁醇等，尤其以異戊醇、異丁醇較為突出[2]。適宜的雜醇油含量及適當(dāng)比例可使酒體豐滿圓潤，口感柔和協(xié)調(diào)；但雜醇油在人體內(nèi)氧化速度較乙醇慢，停留時間長，含量過高時，不僅會帶來異雜味，還會使消費者飲后引起頭痛、頭暈、神經(jīng)系統(tǒng)充血等癥狀，對人體有一定的毒害作用[3-4]。因此，國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定白酒中雜醇油（以異戊醇、異丁醇計）的含量≤0.20 mg/100 mL。

雜醇油是白酒釀造過程中酵母發(fā)酵正常代謝的副產(chǎn)物，主要有兩種生成途徑。一種是酵母以氨基酸為基質(zhì)的降解代謝途徑，一種是酵母以糖為基質(zhì)的合成代謝途徑[5-7]。傳統(tǒng)釀酒生產(chǎn)過程中存在雜醇油含量普遍偏高的問題已經(jīng)引起了業(yè)界的廣泛關(guān)注。因此，為降低雜醇油含量，使其控制在合適的范圍內(nèi)，生產(chǎn)工藝上已采取了種種措施，如采用低溫發(fā)酵技術(shù)等，但其工藝復(fù)雜，生產(chǎn)成本高[8]。通過誘變選育及離子注入技術(shù)來選育氨基酸缺陷型的釀酒酵母，阻止其Ehrlieh 代謝途徑，從而獲得低產(chǎn)雜醇油的酒精酵母菌株[9-13]。但在釀造工業(yè)中存在回復(fù)突變等問題，生產(chǎn)上存在風(fēng)險，只有選育低產(chǎn)雜醇油且高產(chǎn)乙醇的酵母菌進(jìn)行發(fā)酵才能從根本上解決問題[14]。

濃香型白酒獨特的生產(chǎn)工藝造就了大曲和糟醅中特殊的微生物區(qū)系，富含具有工業(yè)價值的微生物資源。篩選大曲和糟醅中的功能微生物以及進(jìn)行相關(guān)應(yīng)用的研究正成為熱點[15-16]。本文首先通過TTC 培養(yǎng)基、乳酸培養(yǎng)基篩選低產(chǎn)雜醇油、高產(chǎn)乙醇的酵母菌株，對所選菌株進(jìn)行鑒定，然后評價所選菌株的性能。使該菌株能夠應(yīng)用于傳統(tǒng)白酒釀造生產(chǎn)，降低雜醇油含量，從而提高白酒品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料、試劑

大曲和糟醅樣品采集自瀘州濃香型白酒生產(chǎn)企業(yè)的釀酒車間，多點采樣后混合均勻。釀酒酵母購自市場上常用于白酒生產(chǎn)的酵母菌。

試劑及耗材：蛋白胨，酵母膏，瓊脂粉均為生化試劑，北京奧博星生物有限公司；異戊醇、異丁醇、正丙醇、乙酸乙酯等色譜分析用標(biāo)準(zhǔn)品均為色譜純，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；PCR 所用試劑購自上海生工生物工程公司；其他試劑均為分析純，成都科龍化工試劑廠。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：YPD 液體培養(yǎng)基。121 ℃滅菌15 min，冷卻到50 ℃按1 U/mL加入青霉素。

平板分離培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15～20 g/L，121 ℃滅菌15 min。

初篩培養(yǎng)基：TTC 培養(yǎng)基，TTC 0.1 g/L，乳酸5 g/L，瓊脂15 g/L，pH 6.0。乳酸培養(yǎng)基，乳酸40 g/L，硫酸銨5 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，氯化鈉0.1 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，氯化鈣0.1 g/L，酵母膏0.2 g/L，瓊脂15 g/L，pH6.0。

復(fù)篩培養(yǎng)基：高粱汁培養(yǎng)基，高粱粉碎后按高粱∶水=1∶4的比例混勻后，90 ℃水浴下糊化90 min，冷卻到60 ℃，加入糖化酶，糖化2～3 h，煮沸5 min，雙層紗布過濾，加水調(diào)糖度為15 °Bx，121 ℃滅菌15 min。

1.1.3 儀器設(shè)備

SW-CJ-2FD 型超凈工作臺，蘇州合飛凈化設(shè)備有限公司；SPX-250-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；T6 型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；RX40 型密度折光儀，梅特勒-托利多上海有限公司；Power Pac Basic型電泳儀，美國Bio-Rad 公司；Gel Doc XR 型凝膠成像儀，美國Bio-Rad 公司；7890A 型氣相色譜儀（配LZP-930 白酒分析專用柱，30 m×320μm×1 μm，Analytical Technology，蘭州化學(xué)物理研究所），美國安捷倫科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵母菌的分離與純化

將大曲、糟醅樣品置于富集培養(yǎng)基中，于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中增殖培養(yǎng)48 h。用玻璃珠振蕩打散后，取合適梯度涂布于平板分離培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)。

待菌落長大后在平板上層注入TTC培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)2～3 h，挑選深紅色的菌株，轉(zhuǎn)接到乳酸培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)3～5 d。挑選菌落較大的作為初篩菌株。

1.2.2 低產(chǎn)雜醇油酵母菌的篩選

初篩菌株活化后接入YPD 培養(yǎng)基中增殖，使活菌濃度達(dá)到108個/mL，然后取5 mL 接入裝有500 mL 高粱汁的錐形瓶中，28 ℃培養(yǎng)72 h 后測定發(fā)酵液的乙醇、異戊醇、異丁醇含量。選擇產(chǎn)雜醇油低、產(chǎn)酒能力強的酵母菌株為目標(biāo)菌株。

1.2.3 酵母菌株鑒定

菌落及菌體形態(tài)觀察：篩選出的酵母菌株，劃線于分離培養(yǎng)基瓊脂平板上，于28 ℃下厭氧培養(yǎng)48～72 h，觀察菌落形態(tài)；用光學(xué)顯微鏡觀察個體形態(tài)。

菌種16Sr DNA 鑒定：離心收集液體培養(yǎng)至對數(shù)生長期的酵母菌體，采用Bacterial DNA Kit 試劑盒提取總DNA。提取得到的總DNA 采用0.6 %瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度。采用酵母通用引物NLl（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和NL4（5'-GGTCCGTGTTT CAAGACGG-3'）對總DNA 進(jìn)行PCR 擴增，送至上海生工公司進(jìn)行測序。將測序得到的26S rDNA D1/D2序列在eztaxon上進(jìn)行BLAST 比對，比較分離菌株與已知酵母菌相應(yīng)序列的相似程度，與Gen Bank 數(shù)據(jù)庫做相似性分析。

1.2.4 酵母菌的性能檢測

以波長600 nm 處測定酵母菌發(fā)酵液的OD 值來研究酵母菌的生長性能[17]。

耐溫性實驗：將酵母菌接種到Y(jié)PD 液體培養(yǎng)基中，分別置于15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液的OD值，研究酵母菌的最適生長溫度。

耐酸性實驗：將酵母菌接種在起始pH 值分別為3.0、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5的YPD液體培養(yǎng)基中，于最適溫度下培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液的OD值，研究酵母菌的最適生長pH值。

耐糖性實驗：將酵母菌接種在蔗糖、葡萄糖濃度分別為10 %、15 %、20 %、25 %、30 %、35 %的YPD 液體培養(yǎng)基中，于最適溫度下培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液的OD值，研究酵母菌的耐糖性。

耐酒精實驗：將酵母菌接種到乙醇含量分別為8 %vol、10 %vol、12 %vol、14 %vol、16 %vol、18 %vol、20 %vol 的YPD 液體培養(yǎng)基中，于最適溫度下培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液的OD值，研究酵母菌的耐酒精程度。

生長曲線：把酵母菌接種于YPD 液體培養(yǎng)基中，于最適溫度和pH 值下培養(yǎng)，每隔2 h 在波長600 nm處測一次發(fā)酵液的OD值。

1.2.5 高粱汁發(fā)酵

將所篩選的酵母菌用于高粱汁發(fā)酵，以釀酒酵母菌為對照組，發(fā)酵7 d，檢測雜醇油、乙醇及其他香氣成分的含量。

1.2.6 乙醇、雜醇油及其他香氣成分分析

取發(fā)酵液樣品，經(jīng)減壓蒸餾后取餾出液，過0.2 μm 微孔濾膜，分析乙醇、雜醇油及其他香氣成分的含量。

乙醇含量的測定：采用密度折光儀分析。

雜醇油及其他香氣成分的測定：用氣相色譜分析，汽化溫度：220 ℃；檢測器溫度：230 ℃；柱溫：35 ℃；升溫程序：初始溫度為50 ℃，保持6 min 后，以4 ℃/min 升溫至170 ℃，保持3 min，以40 ℃/min升至220 ℃，保持2 min；進(jìn)樣量：0.4μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的分離純化和篩選

通過平板分離培養(yǎng)基分離純化，從大曲中篩選了57 株酵母菌；第二步用TTC 培養(yǎng)基和乳酸培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，篩選了18 株酵母菌。利用TTC 培養(yǎng)基是為了篩選高產(chǎn)乙醇的酵母菌，因為只有選育高產(chǎn)乙醇及低產(chǎn)雜醇油的酵母菌才有實際意義。由于雜醇油的生成與乳酸的代謝途徑正好相反，因此通過乳酸培養(yǎng)基從大曲中篩選低產(chǎn)雜醇油的酵母菌[10]。

對初篩的18 株酵母菌進(jìn)行高粱汁發(fā)酵，發(fā)酵液的乙醇含量、異戊醇、異丁醇等雜醇油含量如表1所示。從表1可知，所篩選的酵母菌中LJ-07、LJ-15、LJ-18 產(chǎn)酒能力較好，但產(chǎn)雜醇油含量較高；LJ-07、LJ-10、LJ-16、LJ-17 酵母菌產(chǎn)雜醇油含量低，但是產(chǎn)酒能力較差；相對而言，LJ-07 酵母菌產(chǎn)雜醇油較低且產(chǎn)酒能力較好。后續(xù)使用LJ-07 酵母菌進(jìn)行試驗。

表1 發(fā)酵液雜醇油、乙醇含量 (mg/L)

2.2 酵母菌株鑒定

2.2.1 菌落及細(xì)胞形態(tài)觀察

酵母菌株LJ-07 經(jīng)進(jìn)一步純化后，進(jìn)行菌落特征和個體形態(tài)觀察。在YPD 瓊脂培養(yǎng)基上的菌落特征和顯微鏡下觀察的個體形態(tài)如圖1 所示。圖1中（A）是在平板上生長的LJ-07 酵母菌，菌落易用針挑起，大而厚，質(zhì)地均勻，表面濕潤光滑、不透明、黏稠，顏色單調(diào)，呈乳白色，正反面及中央與邊緣顏色一致，有不規(guī)則的毛狀物。圖1 中（B）是在400倍顯微鏡下觀察到的LJ-07 酵母菌，球形、卵圓形、橢圓形，無鞭毛。

2.2.2 酵母菌株26Sr DNA基因序列測定結(jié)果

酵母菌株LJ-07 的26Sr DNA 核苷酸測序結(jié)果在NCBI 使用BLASTN 比對初步確定為釀酒酵母，從GenBank 數(shù)據(jù)庫中獲得有關(guān)種的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)序列數(shù)據(jù)，使用ClustalX 1.8 對齊后使用MEGA 2.1 計算序列相似性并作系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果見圖2。系統(tǒng)發(fā)育樹中篩選出的酵母菌株與Saccharomyces cerevisiae屬同一分枝，確定篩選出的酵母菌株為Saccharomyces cerevisiae，暫命名為酵母菌LJ-07。

2.3 酵母菌的性能測定（圖3）

酵母菌株LJ-07 在不同條件下的生長情況如圖3 所示，乙醇濃度、pH 值對酵母菌生長的影響較大，溫度、糖濃度對酵母菌生長的影響相對較小。以下對圖3中4種影響因素結(jié)果進(jìn)行分析。

2.3.1 溫度對酵母菌生長的影響

溫度對酵母菌的生長非常重要，溫度過高過低都會抑制酵母菌的生長，甚至?xí)蛊涫Щ?，同時，酵母菌的最適生長溫度范圍對酒類發(fā)酵至關(guān)重要。溫度對酵母菌生長的影響如圖3(A)所示，溫度在30 ℃以下時隨著溫度的升高，酵母菌的生長隨溫度的上升呈上升趨勢；溫度在30 ℃之上時，酵母菌的生長隨溫度的上升呈下降趨勢；溫度在25～35 ℃時，酵母菌生長較好，因此，其最適生長溫度為25～35 ℃。

2.3.2 pH值對酵母菌生長的影響

pH 值過高或過低都會影響酵母菌的生長和代謝產(chǎn)物的生成，甚至?xí)菇湍妇Щ?。如圖3(B)所示，pH6～7 時，酵母菌生長良好，pH6.5 時，酵母菌的OD值最大，為酵母菌的最適pH值。

2.3.3 糖濃度對酵母菌生長的影響

葡萄糖和蔗糖濃度對酵母菌生長的影響如圖3(C)所示，酵母菌在葡萄糖濃度10%時，菌體濃度最大，生長繁殖最為迅速；酵母菌在蔗糖含量為10%和25%時菌體濃度都較大。葡萄糖和蔗糖的濃度達(dá)到35%時，酵母菌都能夠生長，表明酵母菌具有一定的耐糖能力。

2.3.4 乙醇濃度對酵母菌生長的影響

乙醇濃度對酵母菌生長的影響如圖3(D)所示，乙醇濃度越高，酵母菌的生長越弱，當(dāng)乙醇含量為8%vol～14%vol 時，酵母菌生長情況較穩(wěn)定；乙醇含量為16 %vol～18 %vol 時，酵母菌生長緩慢；乙醇含量為20%vol 時，酵母菌基本不生長。過高的乙醇含量對酵母菌種具有毒害作用，乙醇發(fā)酵時要求所用的酵母菌具有一定的耐乙醇的能力，酒類發(fā)酵生產(chǎn)中乙醇含量大多數(shù)在14%vol 以下，所篩選的酵母菌能滿足生長的需要。

2.3.5 酵母菌的生長曲線（圖4）

所篩選的酵母菌在最適生長溫度和最適生長pH 值下進(jìn)行生長曲線測定，其結(jié)果如圖4 所示，在0～4 h 為生長延滯期，6～18 h 為對數(shù)生長期，18 h以后處于生長相對穩(wěn)定期，20 h 后菌體濃度略有降低。

2.4 高粱汁發(fā)酵

用篩選的LJ-07 酵母菌進(jìn)行高粱汁發(fā)酵，以釀酒酵母為對照組，發(fā)酵液雜醇油、乙醇及其他香氣成分的含量如表2 所示。LJ-07 號酵母菌產(chǎn)雜醇油的量為233.61 mg/L，比釀酒酵母降低了23.53 %；而對乙醇生成能力影響不大，對其他香氣成分的生成量也幾乎沒有影響。

3 結(jié)論

從瀘州老窖濃香型白酒釀造大曲和糟醅中篩選出1 株低產(chǎn)雜醇油、高產(chǎn)乙醇的酵母菌LJ-07。對該株酵母菌進(jìn)行26S rDNA 基因序列分析，確定其為Saccharomyces cerevisiae，該菌株對溫度、酸度、糖度及乙醇的耐受性能好，最適溫度的范圍為25～30 ℃，最適pH值為6.5，且耐糖、耐乙醇性能較好。與常用的釀酒酵母相比，酵母菌LJ-07 的雜醇油產(chǎn)量降低了23.53%，而產(chǎn)乙醇的能力持平，該菌可應(yīng)用于濃香型白酒等傳統(tǒng)釀酒工業(yè)，以降低白酒的雜醇油含量。

表2 發(fā)酵高粱汁乙醇、雜醇油等香氣成分含量(mg/L)