劉濤，李鵬程，劉正湘，左后娟

1華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院，武漢430000；2華中科技大學(xué)附屬同濟醫(yī)院

肝癌是國內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，其侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要特征，也是患者死亡的主要原因之一[1]。CD151是四跨膜蛋白超家族(TM4SF)的重要成員，也是與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)最為密切的TM4SF分子[2]，被認為是調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移重要的分子之一。CD151能夠與整合素相結(jié)合，再銜接其他TM4SF分子與整合素作用，將多種細胞外生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細胞內(nèi)，調(diào)控細胞的伸展、遷移、黏附、腫瘤侵襲等過程[3]。研究顯示，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中，CD151-整合素α3表達陽性率明顯升高，CD151和整合素α3陽性表達在結(jié)腸癌患者中呈正相關(guān)性[4]；而CD151/整合素β1均陽性的肝癌患者3、5、7年總體生存率明顯低于CD151/整合素β1陰性的患者[5]。因此，CD151、CD151/整合素β1被認為是判斷肝癌患者預(yù)后不良的獨立危險因素。局部黏著斑激酶(FAK)與腫瘤侵襲高度相關(guān)，F(xiàn)AK-Src-paxillin信號通路除了作為整合素重要的信號通路外，也被認為是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移、生長和侵襲的重要通路之一。FAK、Src、paxillin的磷酸化是FAK-Src-paxillin信號通路激活的標(biāo)志，在結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌等多種腫瘤的轉(zhuǎn)移機制中均有報道[6，7]。雖然研究報道CD151高表達能促進肝癌細胞的侵襲，但其分子機制尚不清楚。2018年3月～2019年5月，我們將CD151及其整合素結(jié)合突變體(CD151-mut)轉(zhuǎn)染至肝癌細胞，觀察CD151及CD151-mut對肝癌細胞侵襲能力的影響，并探討其與FAK-Src-paxillin通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞株HepG2購自武漢大學(xué)物種保藏中心。pAAV-CD151質(zhì)粒由美國俄克拉荷馬大學(xué)健康中心張欣教授惠贈。pAAV-CD151-AAA(即CD151-AAA194-196突變質(zhì)粒)由本實驗室前期構(gòu)建[8，9]。FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑購自瑞士Roche Group公司，胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Gibco公司，ECL增強化學(xué)發(fā)光試劑和免疫共沉淀試劑盒購自美國Pierce公司，抗CD151小鼠抗人抗體由張欣教授惠贈，F(xiàn)AK、Src、paxillin及磷酸化抗體，二抗購自美國Cell signaling公司，單克隆抗整合素α3、α6、β1小鼠抗人抗體購自美國CST公司。熒光倒置顯微鏡購自NIKON公司、臺式高速低溫離心機購自美國Beckman公司，微量紫外分光光度計、Bio-RAD電泳儀購自美國Bio-RAD公司，微型離心機購自美國Sigma公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 將HepG2細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細胞生長至60%融合后，接種于至6孔板中，更換Opti-MEM培養(yǎng)基，37 ℃預(yù)孵育30 min。

1.3 細胞分組與轉(zhuǎn)染 將HepG2細胞隨機分成3組：對照組、CD151組和CD151-mut組。對照組加入6 μL生理鹽水，其他組加入6 μL FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑，CD151組和CD151-mut組再分別加入pAAV-CD151質(zhì)?；騪AAV-CD151-AAA質(zhì)粒各2 μg，孵育4 h后，去除培養(yǎng)基，更換含10%胎牛血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4 細胞侵襲能力觀察 采用Transwell小室實驗。收集各組細胞，加入胰酶消化，離心，用PBS重懸，調(diào)整細胞密度為(2～3)×105/mL。預(yù)先用Matrigel鋪小室，置入Transwell板中。無血清培養(yǎng)基稀釋的細胞外基質(zhì)包被膜，將含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基加入小室下層，各組細胞懸液分別加入Transwell小室中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取聚碳酸酯膜，擦去膜上層未遷移的細胞，甲醇固定濾膜及下層細胞，龍膽紫染色。顯微鏡(×200)下觀察并計數(shù)穿膜細胞數(shù)。隨機選擇5個視野，取平均值。

1.5 CD151及FAK-Src-paxillin通路活性檢測 采用Western blotting法。轉(zhuǎn)染的HepG2細胞加入預(yù)冷的PBS洗3次，加入細胞裂解液，冰上裂解后，從平板上刮下細胞，提取蛋白并檢測各組濃度。分別取各組蛋白(約40 μg)在SDS-PAGE凝膠上電泳并轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。分別加入一抗(鼠抗人CD151、FAK、Src、paxillin、p-FAK、p-Src、p-paxillin、β-actin)4 ℃孵育過夜。洗滌后，與相應(yīng)的二抗孵育約2 h。使用增強的化學(xué)發(fā)光試劑ECL顯色、曝光，凝膠成像分析系統(tǒng)(Image J軟件)分析各組目的條帶。CD151蛋白表達以β-actin蛋白表達量為內(nèi)參；p-FAK、p-Src、p-paxillin蛋白表達分別以FAK、Src、paxillin作為內(nèi)參，計算相對表達量表示該通路的活性。

1.6 CD151與整合素α3、α6、β1結(jié)合情況觀察 采用免疫共沉淀法。取CD151組、CD151-mut組、對照組轉(zhuǎn)染后的細胞，加入RIPA裂解緩沖液，4 ℃裂解30 min。裂解物于4 ℃ 13 000 g離心10 min，去除沉淀，保留上清液。取細胞裂解液加入已包被一抗的蛋白A(CD151的抗體1 μg)和蛋白G瓊脂糖珠，4 ℃孵育過夜；4 ℃離心5 min。去上清，緩沖液洗滌免疫復(fù)合物，加入laemmli樣品緩沖液中溶解。取各組樣品分別于SDS-PAGE凝膠上進行電泳分離。檢測各組CD151結(jié)合整合素α3、α6、β1蛋白的表達。

2 結(jié)果

2.1 三組細胞侵襲能力比較 對照組、CD151組和CD151-mut組的穿膜細胞數(shù)分別為(106±4)、(165±7)、(98±2)個。CD151組穿膜細胞數(shù)較對照組增加，CD151-mut組穿膜細胞數(shù)較CD151組減少(P均<0.05)。

2.2 三組CD151表達量比較 CD151組、CD151-mut組、對照組CD151蛋白的相對表達量分別為2.17±0.18、2.31±0.23、1.09±0.14。CD151組和CD151-mut組較對照組升高(P均<0.01)，CD151-mut組與CD151組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 三組FAK-Src-paxillin通路活性比較 CD151組p-FAK、p-Src、p-paxillin蛋白表達量較對照組增加，CD151-mut組p-FAK、p-Src、p-paxillin蛋白表達量較CD151組降低(P均<0.05)。見表1。

表1 三組FAK-Src-paxillin通路活性比較

注：與對照組相比，*P<0.05；與CD151組相比，#P<0.05。

2.4 三組結(jié)合整合素水平比較 CD151與整合素α3、α6和β1結(jié)合形成復(fù)合體，CD151組結(jié)合整合素α3、α6、β1水平高于對照組(P均<0.05)，而CD151-mut組結(jié)合整合素α3、α6、β1水平低于CD151組(P均<0.01)。見表2。

表2 三組結(jié)合整合素水平比較

注：與對照組相比，*P<0.05；與CD151組相比，#P<0.01。

3 討論

肝癌是常見的惡性腫瘤，其病因多樣、惡性程度高、預(yù)后差，是我國第2位的腫瘤死亡原因。肝癌的手術(shù)切除治療是首選方法，早期切除肝癌患者的5年生存率可達60%以上。部分患者在明確診斷時已經(jīng)失去根治性切除的機會，全肝切除和肝移植治療能夠挽救部分患者，但其高昂的經(jīng)濟負擔(dān)成為患者不能承受之重。早期發(fā)現(xiàn)肝癌、研究其侵襲特性成為近年來研究的熱點。CD151是最早發(fā)現(xiàn)與腫瘤轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)的四跨膜蛋白,是四跨膜網(wǎng)絡(luò)形成最為關(guān)鍵的分子之一，與整合素關(guān)系密切，CD151在肝癌、肺癌等腫瘤中廣泛表達，且與腫瘤惡性進展以及預(yù)后均密切相關(guān)。Zevian等[10]報道，CD151在原發(fā)性肝細胞癌肝癌組織中的表達明顯高于癌旁組織及正常組織；CD151過表達與肝癌患者的無包膜、高分期與分級、腫瘤細胞低分化、有門脈癌栓及多衛(wèi)星灶等臨床病理因素有關(guān)。腫瘤侵襲是惡性腫瘤細胞從其起源部位沿組織間隙向周圍組織浸潤的過程，腫瘤細胞突破基底膜是腫瘤擴散的第一步。

腫瘤細胞的侵襲是影響惡性腫瘤預(yù)后的重要因素，Ke等[11]研究發(fā)現(xiàn)，高表達CD151的肝癌細胞侵襲能力明顯增強。CD151如何介導(dǎo)腫瘤細胞的侵襲是目前研究的熱點。Zhang等[3]報道，CD151參與了細胞黏附、細胞外基質(zhì)黏附并促進新生血管生成，這可能是其促進腫瘤侵襲的機制之一。本研究通過轉(zhuǎn)染CD151質(zhì)粒上調(diào)肝癌細胞中CD151的表達，CD151-mut僅是CD151基因序列中的AAA194-196突變，并不影響CD151蛋白的表達。結(jié)果顯示，CD151組與CD151-mut組在CD151蛋白表達水平上無差異；在肝癌細胞侵襲能力方面，CD151組穿膜細胞數(shù)較對照組增加，CD151-mut組穿膜細胞數(shù)較CD151組減少。表明CD151高表達可提高肝癌細胞的侵襲能力，CD151基因突變在不改變CD151蛋白表達的基礎(chǔ)上可以影響CD151的功能。

在促腫瘤侵襲的分子信號機制的研究方面，整合素是位于細胞表面的異二聚體黏著受體,與胞外基質(zhì)蛋白相結(jié)合,由一個α亞基和一個β亞基組成,α3β1和α6β1是層黏連蛋白連接整合素，可以與四跨膜超家族蛋白形成復(fù)合體。CD151是四跨膜超家族蛋白的最重要成員之一，它可以通過胞外大環(huán)特異性位點QRD194-196與整合素α3β1或α6β1相連，形成CD151-α3β1/α6β1復(fù)合體，進而調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的功能。

FAK是一種非受體酪氨酸激酶，是整合素依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的基礎(chǔ)分子，介導(dǎo)細胞與細胞外基質(zhì)的相互作用，是腫瘤細胞侵襲的關(guān)鍵[12]。FAK磷酸化后，將上游信號整合并傳遞下去，調(diào)控細胞骨架重組、收縮、黏著斑解聚與形成，調(diào)節(jié)細胞運動。Kohno等[13]報道，向小鼠成纖維細胞轉(zhuǎn)染CD151后，細胞侵襲能力明顯增強，但該效應(yīng)可被CD151抗體所抑制。Yue等[14]對CD151-整合素復(fù)合體的研究發(fā)現(xiàn)，CD151可使促進FAK磷酸化。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)皮細胞中，CD151能夠促進FAK磷酸化增強[8]。本研究結(jié)果證實，CD151可使FAK磷酸化加強，CD151-mut組的FAK磷酸化受阻。FAK-Src-paxillin通路是整合素重要的信號通路，F(xiàn)AK、Src、paxillin磷酸化是該信號通路激活的標(biāo)志，是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移、生長和侵襲的重要通路。

Mantonakis等[15]報道，F(xiàn)AK、Src、paxillin高表達與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移和病理學(xué)分級顯著相關(guān)。但FAK-Src-paxillin信號通路是否介導(dǎo)CD151在肝癌中的作用并未見報道。本研究分別檢測了CD151和CD151-mut轉(zhuǎn)染肝癌細胞后對FAK、Src、paxillin表達的影響，結(jié)果顯示CD151高表達促進FAK、Src、paxillin的磷酸化，且轉(zhuǎn)染CD151-mut突變體未導(dǎo)致FAK、Src、paxillin的磷酸化蛋白表達增加。CD151-mut組與CD151組兩組肝癌在細胞侵襲上的功能差異與CD151基因的突變導(dǎo)致的FAK、Src、paxillin磷酸化差異相關(guān)，提示CD151促肝癌細胞侵襲作用與FAK-Src-paxillin信號通路相關(guān)，其通過促進FAK、Src、paxillin蛋白的磷酸化程度，增強腫瘤細胞的侵襲能力。

CD151是整合素重要的關(guān)聯(lián)蛋白，在結(jié)構(gòu)上具有特異性。其通過細胞外大環(huán)特異性位點QRD194-196，與多種整合素亞基結(jié)合，其中最主要的是整合素α3、α6、β1，形成相當(dāng)牢固且極其穩(wěn)定的CD151-整合素復(fù)合體[16]，該復(fù)合體的形成是跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要前提條件[17]。破壞該復(fù)合體的形成后，內(nèi)皮細胞的侵襲能力、管狀結(jié)構(gòu)形成的能力均明顯減弱[18]。本研究結(jié)果顯示，CD151-mut突變體可破壞CD151與整合素α3、α6、β1的結(jié)合，但該突變體并不影響CD151蛋白表達。CD151突變體轉(zhuǎn)染后肝癌細胞的侵襲能力較CD151明顯減弱，提示CD151和整合素結(jié)合是介導(dǎo)其促肝癌細胞侵襲和遷移的重要機制。

綜上所述，CD151和整合素復(fù)合體形成是促進肝癌細胞侵襲的重要條件，破壞該復(fù)合體形成則減弱CD151的促侵襲效應(yīng)，CD151促肝癌細胞侵襲的作用機制是通過FAK-Src-paxillin信號通路的磷酸化產(chǎn)生效應(yīng)的。