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陳皮對幼齡大鼠厭食癥的改善作用及機制研究*

2020-06-05 10:21余金蓉張欣雨劉建國
陜西中醫(yī) 2020年5期
關(guān)鍵詞:胃動素幼齡胃泌素

袁 立,余金蓉,李 軍,張欣雨,劉建國

1.湖北省應(yīng)城市人民醫(yī)院新生兒科(應(yīng)城 432400); 2.武漢科技大學(xué)附屬孝感醫(yī)院兒科(孝感 432000)

小兒厭食癥 (Infantile anorexia,IA) 是一種兒科常見慢性消化功能紊亂綜合征。IA主要癥狀是長期的食欲減退或消失、食量減少至原來的一半或者三分之一、持續(xù)時間達到兩周以上[1]。IA多發(fā)于1~6歲小兒,占兒科就診人數(shù)的5%~7%,該病還有逐年增加的趨勢[2]。長期厭食會使兒童營養(yǎng)不良、形體消瘦、生長發(fā)育遲緩、免疫力下降、繼發(fā)各種感染性疾病,甚至影響兒童的智力發(fā)展和心理健康,給家庭和社會帶來極大負擔(dān)[3]。該病的具體發(fā)病機制尚不明確,中醫(yī)認為小兒多因喂養(yǎng)不當(dāng)、飲食不節(jié)、情志失調(diào)等損傷脾胃,加之小兒“脾常不足”的生理特點,導(dǎo)致脾胃受納和運化失調(diào),從而引起厭食[4]。陳皮(Pericarpium cirri reticultae,PCR) 是蕓香科植物橘及其栽培變種的干燥成熟果皮,是中國傳統(tǒng)藥物。其味辛、苦,性溫,入脾、肺經(jīng),具有“理氣健脾,燥濕化痰”的功效[5]。且已有研究表明,陳皮能夠促進胃排空和腸推進[6],預(yù)示陳皮對小兒厭食具有良好改善作用。本文主要探討陳皮對幼齡厭食大鼠的作用及機制,以期為陳皮開發(fā)利用及小兒厭食癥的預(yù)防治療提供參考數(shù)據(jù)。

材料與方法

1 材 料

1.1 實驗動物:體重(60±10) g SD幼齡大鼠60只,雌雄各半,由四川大學(xué)實驗動物中心提供,許可證號:SCXK(川)2018-026。

1.2 飼料:常規(guī)飼料由四川大學(xué)實驗動物中心提供,特制飼料是按照1∶1∶1∶2∶1∶1.8∶2 的比例混合魚肉松、奶粉、玉米粉、黃豆粉、白糖、鮮雞蛋、鮮肥肉,通過自制圓柱狀模具塑型,經(jīng)烘箱烘干,4 ℃ 冷藏備用[7]。

1.3 藥物與試劑:將精選陳皮粉碎水煎,制成100% 濃度水煎劑,由藥檢所中藥室鑒定提取。胃動素、胃泌素和-內(nèi)啡肽試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司,RIPA裂解緩沖液購自南京??藸柹锟萍加邢薰荆?LEP抗體、NPY抗體、GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自上海艾博抗生物科技有限公司,BCA試劑盒購自海易色醫(yī)療科技有限公司。

2 治療方法

2.1 實驗分組:將SD大鼠隨機分為對照組、模型組、三個給藥組(陳皮低、中、高劑量組),每組12只。

2.2 模型建立及給藥:空白對照組飼喂常規(guī)飼料,模型組飼喂特制飼料,所有的大鼠在室溫20 ℃~24 ℃、相對濕度50% 條件下,單籠飼養(yǎng)。在造模8 d后開始給藥,對照組和模型組灌胃1 ml生理鹽水,給藥組大鼠每只分別灌胃1 ml 10、30、50 g/ml 的陳皮水煎劑,每天灌胃1次。第28天開始禁食,第29天腹主動脈采血、取胃等。

3 檢測指標(biāo)

3.1 攝食量和體重:通過稱重法測定各組大鼠攝食量和體重。

3.2 胃蛋白酶活性:采用Mett法測定胃蛋白酶活性:實驗當(dāng)天將吸滿雞蛋清的毛細玻璃管(內(nèi)徑:2 mm,長10 cm)置于70 ℃熱水使蛋白凝固,制成蛋白管。在試管中加入1 ml胃上清液和15 ml 0.05 mol/L的鹽酸,放入2個蛋白管后封口,將其置于37 ℃恒溫箱,24 h后測定四端透明長度。計算公式:胃蛋白酶活性單位(U/ml)=透明管長度均值2×16。

3.3 胃酸濃度:將胃液2 ml置于小燒杯中,分別加入3滴二甲基黃指示劑和酚酞指示劑,然后混合均勻。將0.02 mmol/L 氫氧化鈉溶液用微量滴定管逐滴加入,邊滴加邊搖勻,顏色由櫻紅色變?yōu)槌赛S色再變?yōu)槲⒓t色時為滴定終點。計算公式:總酸度(mmol/L)=終點量×10。

3.5 下丘腦中瘦素(Leptin,LEP)和神經(jīng)肽Y(Neural peptide Y,NPY)蛋白的表達:將小丘腦組織勻漿,并用RIPA裂解液來提取組織的總蛋白,通過 BCA試劑盒檢測蛋白的濃度;然后通過SDS凝膠電泳分離蛋白,用半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜,并用脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h;再加入兔來源的單克隆一抗(LEP 1∶500、NPY 1∶1000、GAPDH 1∶1000),在4 ℃ 封閉過夜;接著加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔單克隆二抗(1∶2000)室溫封閉1 h;最后滴ECL曝光,以GAPDH為內(nèi)參,使用Quantity One軟件進行分析目標(biāo)蛋白質(zhì)的相對表達水平。

3.6 胃排空:第29天給各組一半的大鼠灌胃營養(yǎng)性半固體糊2 ml/只,40 min后,將大鼠麻醉,結(jié)扎并取胃。將胃表面清理干凈并擦干后稱取胃全重,清洗干凈胃內(nèi)容物并擦干后稱取胃凈重。計算公式:胃殘留百分率=(胃全重-胃凈重)/灌胃總量×100%。

結(jié) 果

1 陳皮對幼齡厭食癥大鼠的攝食量和體重的影響 見表1、2。與對照組相比,模型組大鼠攝食量顯著減少(P<0.01),體重顯著減少(P<0.01),說明造模成功;與模型組相比,給藥組大鼠攝食量顯著增加(P<0.01),體重顯著增加(P<0.01),且效果隨著給藥量的增加越顯著,說明陳皮呈劑量依賴性促進幼齡厭食癥大鼠的攝食量和體重的增加。

2 陳皮對幼齡厭食癥大鼠的胃蛋白酶活性和胃酸分泌的影響 見表3。與對照組相比,模型組大鼠胃蛋白酶活性顯著減弱(P<0.01),胃酸分泌量顯著減弱(P<0.01);與模型組相比,給藥組大鼠胃蛋白酶活性顯著增強(P<0.01),胃酸分泌量顯著增強(P<0.01),且效果隨著給藥量的增加越顯著,說明陳皮呈劑量依賴性增強幼齡厭食癥大鼠的胃蛋白酶活性和胃酸分泌。

表1 陳皮對幼齡厭食癥大鼠攝食量的影響(g)

表2 陳皮對幼齡厭食癥大鼠體重的影響(g)

表3 陳皮對幼齡厭食癥大鼠胃蛋白酶活性和胃酸分泌的影響

4 陳皮對幼齡厭食癥大鼠下丘腦中瘦素和神經(jīng)肽Y蛋白的表達的影響 見表5。 與對照組相比,模型組大鼠下丘腦中瘦素明顯上調(diào)、神經(jīng)肽Y蛋白的表達明顯下調(diào)(P<0.01);與模型組相比,給藥組大鼠下丘腦中瘦素明顯下調(diào)、神經(jīng)肽Y蛋白的表達明顯上調(diào)(P<0.01),且效果隨著給藥量的增加越顯著,說明陳皮呈劑量依賴性上調(diào)幼齡厭食癥大鼠下丘腦中瘦素和神經(jīng)肽Y蛋白的表達。

表4 陳皮對幼齡厭食癥大鼠血漿中胃動素、胃泌素、-內(nèi)啡肽含量的影響(ng/ml)

表4 陳皮對幼齡厭食癥大鼠血漿中胃動素、胃泌素、-內(nèi)啡肽含量的影響(ng/ml)

組 別n胃動素 胃泌素 逕-內(nèi)啡肽對照組120.35±0.0439.21±5.413.15±0.21模型組120.23±0.0325.67±4.982.18±0.23陳皮低劑量組120.33±0.0338.66±5.763.03±0.19陳皮中劑量組120.38±0.0439.86±5.373.11±0.24陳皮高劑量組120.42±0.0341.65±5.643.16±0.21

表5 陳皮對幼齡厭食癥大鼠下丘腦中瘦素和神經(jīng)肽Y蛋白的表達的影響

5 陳皮對幼齡厭食癥大鼠胃排空的影響 見表6。與對照組相比,模型組大鼠胃殘留物顯著增多(P<0.01);與模型組相比,給藥組大鼠胃殘留物顯著減少(P<0.01),且效果隨著給藥量的增加越顯著,說明陳皮呈劑量依賴性促進幼齡厭食癥大鼠胃排空。

表6 陳皮對幼齡厭食癥大鼠胃排空的影響(%)

討 論

食欲減退、體型消瘦是小兒厭食癥的主要表現(xiàn)癥狀,有效的增強食欲是治療小兒厭食的關(guān)鍵之一。本文通過研究發(fā)現(xiàn),陳皮呈劑量依賴性促進幼齡厭食癥大鼠的攝食量和體重的增加,預(yù)示陳皮對厭食癥具有良好的改善效果。

胃蛋白酶是一種由胃粘膜主細胞所分泌的能將食物中的蛋白質(zhì)分解為小肽片段的消化性蛋白酶,其活性和胃的消化功能息息相關(guān)[8]。胃酸是胃液中分泌的鹽酸。如果胃酸分泌不足,則其無法擔(dān)負起消化及防腐制酵的工作,這將會影響消化吸收功能,并導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的障礙[9]。吳麗萍等[10]發(fā)現(xiàn)小兒增食靈合劑治療小兒厭食癥的作用機制可能與其有效地增加胃游離酸及總酸度、提高胃蛋白酶的活性,從而達到促進消化的作用有關(guān);加減益胃湯對脾胃陰虛小兒厭食癥的治療作用與能顯著促進小鼠胃排空和小腸推進功能,明顯提高厭食癥模型大鼠胃蛋白酶活性,調(diào)節(jié)胃酸分泌有關(guān)[11];因此,有效的提高胃蛋白酶活性和胃酸的分泌量有助于小兒厭食癥的臨床治療。本文通過研究發(fā)現(xiàn),陳皮呈劑量依賴性增強幼齡厭食癥大鼠的胃蛋白酶活性和增加胃酸分泌量,著有助于改善厭食癥病癥。

胃動素是一種影響胃及腸道的動力,誘發(fā)胃強烈收縮和小腸明顯的分節(jié)運動,加強回腸和結(jié)腸的運動,對胃腸腔內(nèi)容起清掃作用的腦腸肽激素[12]。胃動素屬于消化間期激素,還刺激胃蛋白酶、胰液的分泌,有助于食物消化[13]。因此,可以用血漿中胃動素的含量來反映胃腸道的運動和功能狀態(tài)。易燕等發(fā)現(xiàn)扶正健脾湯改善厭食癥患兒臨床癥狀,調(diào)節(jié)食欲因子,促進胃動素的正常分泌,增強食欲[14]。本文通過研究可知,陳皮呈劑量依賴性增加幼齡厭食癥大鼠的血漿中胃動素含量,有助于改善厭食癥病癥。胃泌素是一種主要由G細胞分泌的胃腸激素,幾乎對整個胃腸道均有作用,可促進胃腸道的分泌功能,促進胃竇,胃體收縮,增加胃腸道的運動[15]。厭食癥患者血清胃泌素水平的降低,提示胃泌素濃度的降低可能是影響進食的病理抑制因素之一[16]。二寶顆??赏ㄟ^直接或間接調(diào)節(jié)胃竇胃泌素分泌,增加厭食癥模型的供食量[15]。本文通過研究發(fā)現(xiàn)陳皮呈劑量依賴性增加幼齡厭食癥大鼠的血漿中胃泌素含量,有助于改善厭食癥病癥。

LEP和NPY在飲食維持和調(diào)節(jié)中具有重要作用。LEP作為食欲的調(diào)節(jié)因子,具有抑制食欲產(chǎn)生的作用。本文研究發(fā)現(xiàn)陳皮呈劑量依賴性下調(diào)大鼠下丘腦中瘦素、上調(diào)神經(jīng)肽Y,通過神經(jīng)中樞調(diào)節(jié)因子影響食欲,良好改善厭食癥病癥。胃排空指食物由胃排入十二指腸的過程。促進動物胃排空會使動物有空腹感并促進食欲,改善厭食的情況。已有研究表明陳皮促進胃排空[6],這與本文研究結(jié)果陳皮呈劑量依賴性促進幼齡厭食癥大鼠胃排空相一致。

綜上所述,陳皮呈劑量依賴性增強胃蛋白酶活性,增多胃酸分泌量及血漿中胃動素含量、胃泌素含量、-內(nèi)啡肽含量,下調(diào)調(diào)下丘腦中瘦素、上調(diào)神經(jīng)肽Y,并促進胃排空,對改善幼齡厭食大鼠具有改善調(diào)節(jié)的作用。這為中藥材陳皮的開發(fā)利用提供依據(jù),為小兒厭食癥的治療提供參考數(shù)據(jù),具體分子機制還有待進一步的研究。

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