楊娟，于曉濤，郭麗娜，王單單，吳作敏，王瑞

(漯河市中心醫(yī)院，河南 漯河 462300)

“金銀花”一名出自《本草綱目》，由于忍冬花初開為白色，后轉(zhuǎn)為黃色，因此得名金銀花。藥材金銀花又名忍冬花(LonicerajaponicaThunb) ，為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或帶初開的花[1]。 金銀花自古被譽(yù)為清熱解毒的良藥。其性甘寒、氣芳香，甘寒清熱而不傷胃，芳香透達(dá)又可祛邪。金銀花既能宣散風(fēng)熱，還善清解血毒，用于各種熱性病，如身熱、發(fā)疹、發(fā)癍、熱毒瘡癰、咽喉腫痛等癥，均效果顯著。藥理學(xué)研究表明，金銀花具有抗炎[2]、解熱、調(diào)節(jié)免疫功能、利膽、保肝、降血脂、降糖、抗血小板凝聚等生物活性[3]。但是，關(guān)于金銀花抗炎的作用機(jī)制研究較多地停留在整體動物指標(biāo)層面[4]，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法的研究較少。不同于化學(xué)藥通常作用于單一靶點，中醫(yī)藥的治療作用體現(xiàn)在對疾病的辨證施治，強(qiáng)調(diào)整體性，體現(xiàn)了中藥多成分-多靶點-多途徑作用的理念[5]。由于中藥的作用機(jī)制較復(fù)雜，所以深入研究存在較大困難，而通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可將藥物多成分、多靶點、多通路的關(guān)系展現(xiàn)出來，從而為探究活性化合物與其作用靶點之間的相互關(guān)系提供更好的方法[6]。本研究旨在尋找金銀花中成藥性、口服吸收較好的抗炎成分，并預(yù)測這些成分的抗炎作用靶點及相關(guān)通路，為金銀花抗炎作用的深入研究提供參考。

1 方法

1.1 篩選金銀花活性成分

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)提取金銀花的有關(guān)化學(xué)成分236個。在此基礎(chǔ)上以O(shè)B≥20%(Oral Bioavailability，口服生物利用度)和DL≥0.1(Drug-Like，類藥性)為條件對金銀花活性成分進(jìn)行篩選[7]，結(jié)合文獻(xiàn)報道共獲得40個活性成分。

1.2 金銀花活性成分作用靶點篩選及“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

通過TCMSP在線數(shù)據(jù)庫將40個活性成分的作用靶點提取出來，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫以原則為物種為人(Human)作為前提對靶點數(shù)據(jù)進(jìn)一步確認(rèn)。將金銀花的活性成分與相關(guān)預(yù)測靶點導(dǎo)入Cytoscape3.7構(gòu)建金銀花“成分-靶點”的網(wǎng)絡(luò)圖，再通過Network Analyzer插件分析以上網(wǎng)絡(luò)圖研究金銀花活性成分和作用靶點的相互作用關(guān)系，以便尋找其活性成分與抗炎相關(guān)靶點[8]。

1.3 抗炎相關(guān)靶點搜集

Therapeutic Target Database(TTD，https://db.idrblab.org/ttd/)能提供可用作治療的蛋白靶點和核苷酸靶點信息[9]，利用TTD在線數(shù)據(jù)庫平臺，把“anti-inflammatory”作為篩選條件，提取與抗炎相關(guān)的作用靶點。

1.4 抗炎相關(guān)靶點確認(rèn)并構(gòu)建成分靶點和抗炎靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

將TTD中得到的靶點輸入String數(shù)據(jù)庫[10]中預(yù)測靶點與靶點之間的相互作用關(guān)系，并選取分值>0.4作為蛋白之間相互作用的置信度依據(jù)。將結(jié)果輸入Cytoscape3.7中構(gòu)建抗炎靶點蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)。通過 Cytoscape3.7中Merge功能將化合物-預(yù)測靶點網(wǎng)絡(luò)與抗炎的 PPI 網(wǎng)絡(luò)合并，并通過構(gòu)建的抗炎靶點網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)分析金銀花抗炎的靶點。

1.5 KEGG通路富集分析

獲取的抗炎靶點利用DAVID數(shù)據(jù)庫[11]進(jìn)行KEGG通路富集分析，并以P≤0.05作為顯著功能與通路的臨界值。再通過Cytoscape3.7軟件構(gòu)建金銀花抗炎作用活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 金銀花主要活性成分篩選

通過TCMSP在線數(shù)據(jù)庫提取的金銀花符合OB≥20%和DL≥0.1的活性成分有55個，再根據(jù)文獻(xiàn)報道選取其中40個有相關(guān)靶點的主要活性成分作為研究目標(biāo)，見表1。

2.2 構(gòu)建金銀花“活性成分-預(yù)測靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

金銀花活性成分-預(yù)測靶點網(wǎng)絡(luò)(圖1)中共包括263個節(jié)點(40個化合物節(jié)點與223個靶點節(jié)點)，組成了600條邊，表示活性成分與靶點的相互作用關(guān)系。體現(xiàn)了金銀花多成分、多靶點共同作用的機(jī)制。圖中節(jié)點的大小表示度的大小，其中c40(槲皮素，quercetin)的度最大，有145個靶點，為網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點。其次重要的活性成分有芹黃素、山柰酚、毛地黃黃酮、β-谷甾醇、豆甾醇等。

2.3 篩選抗炎靶點并構(gòu)建化合物-抗炎靶點網(wǎng)絡(luò)圖

通過TTD檢測到9個與抗炎相關(guān)的蛋白，其PPI網(wǎng)絡(luò)(圖2)中，共有7個相互作用靶點，組成7條相互作用關(guān)系。使用 Cytoscape3.7 merge 功能將活性成分-預(yù)測靶點網(wǎng)絡(luò)與抗炎靶點的 PPI 網(wǎng)絡(luò)融合，取其交集部分，如圖3所示?？捎^察到金銀花中和抗炎有關(guān)的活性成分有7種，作用的主要靶點為有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPK14)、E-選擇素(SELE)、表皮生長因子受體(EGFR)、受體酪氨酸蛋白激酶erbb-2(ERBB2)。其中金圣草(黃)素、5-羥基-7-甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)鉻酮、2-(3,4-二甲氧基苯基)-5-羥基-7-甲氧基-鉻酮、麥黃酮主要作用于MAPK14；山柰酚、槲皮素作用于SELE；毛地黃黃酮、槲皮素作用于EGFR和ERBB2。

2.4 KEGG通路富集分析和金銀花活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)的建立

通過DAVID平臺對所得7個金銀花抗炎靶蛋白進(jìn)行KEGG通路富集分析，以P≤0.05為條件篩選出18條信號通路，見表2。其中炎癥信號通路有TNF signaling pathway；免疫信號通路有hepatitis C、epithelial cell signaling in helicobacter pylori infection；細(xì)胞增殖信號通路有ErbB signaling pathway、MAPK signaling pathway；低氧細(xì)胞應(yīng)激信號通路有HIF-1 signaling pathway；激素信號通路有GnRH signaling pathway；癌癥信號通路有proteoglycans in cancer、bladder cancer、endometrial cancer、non-small cell lung cancer、central carbon metabolism in cancer、pancreatic cancer、Prostate cancer。

通過Cytoscape3.7軟件將活性成分-抗炎靶點與靶點-通路網(wǎng)絡(luò)融合，見圖4，可顯示出金銀花抗炎活性成分與靶點以及相關(guān)通路之間的關(guān)系。挑選出與炎癥反應(yīng)相關(guān)的通路，并構(gòu)建抗炎相關(guān)的活性成分-靶點-通路圖，見圖5。由圖5可以看出，金銀花的抗炎作用主要通過靶點MAPK14、SELE、EGFR發(fā)揮。槲皮素、毛地黃黃酮為金銀花主要抗炎成分。

圖1 金銀花“活性成分-預(yù)測靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 抗炎靶點相互作用

圖3 金銀花抗炎活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

表2 金銀花抗炎作用靶點KEGG通路

圖4 金銀花抗炎活性成分-靶點-通路圖

圖5 抗炎相關(guān)的活性成分-靶點-通路圖

3 討論

炎癥是機(jī)體對于刺激的一種防御反應(yīng)，表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛和功能障礙。炎癥，可以是感染引起的感染性炎癥，也可以不是由于感染引起的非感染性炎癥。近年來，關(guān)于濫用抗炎藥所造成的抗藥、并發(fā)癥等問題也被頻繁報道。炎癥反應(yīng)是一個復(fù)雜的過程，涉及到多基因與信號通路，而中藥主要是通過多成分、多途徑、多靶點的協(xié)同作用來獲得治療效果，由于療效顯著且副作用小的優(yōu)點在炎癥的治療方面?zhèn)涫荜P(guān)注。

金銀花主要化學(xué)成分為有機(jī)酸類、揮發(fā)油類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類、三萜及三萜皂苷類和微量元素，自古被譽(yù)為清熱解毒的良藥。其性甘寒氣芳香，甘寒清熱而不傷胃，芳香透達(dá)又可祛邪。金銀花既能宣散風(fēng)熱，還善清解血毒，用于各種熱性病，為治一切內(nèi)癰外癰之要藥。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的角度上來講，癰即是致病菌入侵在局部引起的炎癥反應(yīng)。關(guān)于金銀花的抗炎作用，除了關(guān)于其含有的綠原酸、總黃酮類的抗炎作用多有報道外，各種文獻(xiàn)報道多從其總提取物的抗炎活性方面進(jìn)行討論[12-14]。而本研究通過對獲得的金銀花的40種具有生物活性的化學(xué)成分進(jìn)行分析，結(jié)果顯示金銀花中的金圣草(黃)素、山柰酚、槲皮素、5-羥基-7-甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)鉻酮、2-(3,4-二甲氧基苯基)-5-羥基-7-甲氧基-鉻酮、麥黃酮、毛地黃黃酮顯示抗炎活性，揭示了金銀花發(fā)揮抗炎作用的主要成分。這些抗炎活性成分的主要作用靶點為MAPK14、SELE、EGFR、ERBB2、TNFRSF1A等。金銀花中的抗炎活性成分可直接作用于 MAPK14、SELE、EGFR、ERBB2發(fā)揮抗炎作用，也可間接作用于其他靶點而發(fā)揮抗炎作用。其中金圣草(黃)素、5-羥基-7-甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)鉻酮、2-(3,4-二甲氧基苯基)-5-羥基-7-甲氧基-鉻酮、麥黃酮主要作用于MAPK14；山柰酚、槲皮素作用于SELE；毛地黃黃酮、槲皮素作用于EGFR和ERBB2。結(jié)合圖1和圖5可看出毛地黃黃酮、槲皮素是金銀花中OB和DL較高的主要抗炎活性成分，而MAPK14是金銀花發(fā)揮抗炎作用的主要靶點。金銀花主要通過TNF signaling pathway、MAPK signaling pathway兩條信號通路發(fā)揮抗炎作用。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是一組能被不同的細(xì)胞外刺激，如細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、細(xì)胞應(yīng)激及細(xì)胞黏附等激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。這些MAPK能被多種炎性刺激所激活 ,并對炎癥的發(fā)生、發(fā)展起重要調(diào)控作用。EGFR是表皮生長因子(EGF)受體，同時也是 TGF-α受體。E-選擇素是一種細(xì)胞表面糖蛋白，能夠介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與胞外基質(zhì)相互黏附。E-選擇素的表達(dá)是啟動炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵步驟之一。ERBB2(又名ErbB2, NEU, CD340)是原癌基因erbB-2編碼的185 kDa的細(xì)胞膜受體，為表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)家族成員之一。ERBB2高表達(dá)腫瘤細(xì)胞中Ras-MAPK和PI3K-Akt信號傳導(dǎo)活性較高，細(xì)胞增殖能力較強(qiáng)，分化成熟和凋亡機(jī)制受到抑制，細(xì)胞惡性程度高。結(jié)合靶點與通路分析，可看出金銀花中抗炎活性成分可能通過以下4種方式發(fā)揮抗炎作用：減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生、阻斷促炎因子與相應(yīng)受體的結(jié)合、抑制啟動炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白的表達(dá)、調(diào)控細(xì)胞增殖從而間接調(diào)控炎癥反應(yīng)。

本實驗通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法顯示出金銀花“多成分-多靶點-多通路”的抗炎作用機(jī)制，成功地預(yù)測了金銀花抗炎作用的主要成分、主要作用靶點與相關(guān)的信號通路，但研究結(jié)果仍需要通過進(jìn)一步的實驗加以驗證。