周 和1 譚翔勻1 馮 華1 王 奧2

1.遵義市食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 遵義 563002；2.遵義產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)院，貴州 遵義 563002

心腦疏通膠囊由丹參、川芎、法半夏、茯苓等11味中藥材組成，具有益氣活血、化瘀通絡(luò)之功效，用于氣虛血滯、脈絡(luò)瘀阻所致中風(fēng)后遺癥，半身不遂、肢體麻木及心腦血管供血不足等[1-2]。丹參中丹參酮類(lèi)化合物有抗菌消炎、祛瘀止痛等作用，是心腦疏通膠囊發(fā)揮功效的指標(biāo)性成分之一[3-4]。該中藥制劑現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)比較簡(jiǎn)單，只有川芎、枸杞子等幾味藥材的薄層鑒別，難以準(zhǔn)確、全面地表達(dá)該制劑的整體質(zhì)量和療效。

中藥指紋圖譜具有整體性、相似性的特點(diǎn)，是一種能突出中藥及其制劑完整面貌的有效方法[5-6]，有助于中藥及其制劑內(nèi)在化學(xué)成分的綜合評(píng)價(jià)。近年來(lái)，中藥指紋圖譜技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多種中藥及其制劑的質(zhì)量控制[6-10]。本研究以處方中丹參酮類(lèi)成分(丹參酮IIA、隱丹參酮、丹參酮I)為切入點(diǎn)，采用梯度洗脫模式，建立心腦疏通膠囊HPLC指紋圖譜，以期為心腦疏通膠囊的識(shí)別和質(zhì)量控制提供一定的參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 Agilent 1260高效液相色譜議(美國(guó)安捷倫公司)，Waters XSelect C18 (4.6mm×250mm，5μm)色譜柱；MS204TS型梅特勒電子天平(北京中恒日鑫科技有限公司)，KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥品 丹參酮IIA(98.9%，批號(hào)：110766-201721)、隱丹參酮(99.1%，批號(hào)：110852-201605)、丹參酮I(98.2%，批號(hào)：110867-201705)，心腦疏通膠囊(批號(hào)：161201、161202、161203購(gòu)買(mǎi)于遵義市中醫(yī)院，19101601、19101602、19101603、19102101、19102102、19102103、19102104為自制)。乙腈(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)，乙醚(成都金山化學(xué)試劑有限公司)，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱waters XSelect C18(4.6 mm ×250 mm，5μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0-5min，85% B；5-20min，85% B→50% B；20-35min，50% B→30% B；35-45min，30% B→10% B；45-65min，10% B)；檢測(cè)波長(zhǎng)：270nm；流速：1.0mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 稱取丹參酮IIA、隱丹參酮、丹參酮I對(duì)照品適量，分別用甲醇溶解制成含丹參酮IIA 212.63μg/mL、隱丹參酮47.52μg/mL、丹參酮I的單一對(duì)照品溶液，搖勻，用0.22μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.2 供試品溶液 取心腦疏通膠囊內(nèi)容物適量，研細(xì)，取約3.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入乙醚50mL，靜置24h(時(shí)時(shí)振搖)，過(guò)濾，濾液蒸干，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，定容，搖勻，用0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液(批號(hào)：161201)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，主要共有峰與17號(hào)丹參酮IIA參照峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于0.93%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取心腦疏通膠囊(批號(hào)：161201)內(nèi)容物適量，按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，共6份，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果，20個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1.29%(n=6)，相對(duì)峰面積的RSD均小于1.83%(n=6)，表明重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取(批號(hào)：161201)同一供試品溶液，分別在0、2、5、8、12、24h進(jìn)樣檢測(cè)，共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD(n=6)均小于2.62%，表明供試品溶液于室溫下放置24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4 指紋圖譜生成與相似度評(píng)價(jià)、共有峰的指認(rèn)及相關(guān)分析

2.4.1 指紋圖譜的生成 取10批心腦疏通膠囊內(nèi)容物適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004 A版”分析處理得心腦疏通膠囊HPLC指紋圖譜，如圖1、圖2所示。

圖1 樣品的HPLC對(duì)照?qǐng)D譜

圖2 10批樣品的HPLC疊加指紋圖譜

2.4.2 相似度分析 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(版本 2004 A)”，以S1號(hào)樣品(161201)為對(duì)照指紋圖譜，進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，10批樣品相似度均大于0.95，表明各樣品間差異小，質(zhì)量穩(wěn)定性良好，詳見(jiàn)表1。

表1 相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.4.3 共有峰的指認(rèn) 分別取“2.2.1”項(xiàng)下丹參酮IIA、隱丹參酮、丹參酮I的單一對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件依次測(cè)定，并與樣品對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行對(duì)比指認(rèn)。結(jié)果，共有峰中17、12、13號(hào)色譜峰分別指認(rèn)為丹參酮IIA、隱丹參酮、丹參酮I，如圖1、圖3所示。

2.4.4 共有峰的相關(guān)分析 10批樣品總峰31個(gè)，共有20個(gè)共有峰，其峰面積總和占色譜峰總面積的91.49%，具有較大代表性。其中，17號(hào)峰丹參酮IIA峰面積大，含量較高，峰形好，分離度為2.09，在樣品中較穩(wěn)定，故以其保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算其它共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均在3%范圍內(nèi)，無(wú)顯著性差異。結(jié)果詳見(jiàn)表2、表3。

圖3 對(duì)照品HPLC色譜圖

表2 共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表3 共有峰相對(duì)峰面積

3 討論

研究對(duì)比考察甲醇、乙醚兩種提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇提取液的色譜峰繁雜，不易分離，而用乙醚提取時(shí)，基線較平穩(wěn)，各色譜峰保留時(shí)間適中，故選擇乙醚為提取溶劑。此外，經(jīng)多次梯度洗脫模式摸索，對(duì)甲醇-水、甲醇-磷酸溶液、甲醇-醋酸溶液、乙睛-水、乙睛-磷酸溶液、乙睛-醋酸溶液6個(gè)流動(dòng)相考察發(fā)現(xiàn)：乙腈-0.1%磷酸溶液對(duì)樣品成分的梯度洗脫效果最好。同時(shí)采用DAD檢測(cè)器進(jìn)行紫外區(qū)全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)在270nm波長(zhǎng)下色譜圖基線噪音較低，色譜峰數(shù)目多，保留時(shí)間適中，有利于指紋圖譜分析，因此選擇270nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

綜上所述，本研究首次建立心腦疏通膠囊的HPLC指紋圖譜，確認(rèn)20個(gè)共有峰，標(biāo)示指認(rèn)了丹參酮IIA(17號(hào))、隱丹參酮(12號(hào))、丹參酮I(13號(hào))3個(gè)成分，10批樣品相似度均在0.95以上。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可為心腦疏通膠囊的質(zhì)量控制提供可靠一定的參考。在色譜圖中，以丹參酮IIA和隱丹參酮含量相對(duì)較高，可用于定量檢測(cè)分析，筆者將進(jìn)一步深入研究，完善心腦疏通膠囊的質(zhì)量控制。