潘建萍，鐘禹霖，鄧 華

(贛南衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，江西 贛州 341000)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是臨床上常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，且隨著社會(huì)老齡化問題加劇和人口壽命的延長(zhǎng)，AD發(fā)病率有逐年升高之趨勢(shì)，嚴(yán)重影響老人的身心健康和生活質(zhì)量[1-2]。學(xué)習(xí)記憶能力下降、認(rèn)知功能障礙等是AD發(fā)病的主要臨床特征。目前AD發(fā)病確切機(jī)制尚不明確，臨床仍無特效治療藥物。核桃自古作為健腦食品，《本草綱目》中記載核桃可令人肥健、添腦髓。雖有不少研究結(jié)果[3-5]表明核桃通過調(diào)節(jié)膽堿酯酶和抗氧化作用改善AD大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，但是關(guān)于核桃發(fā)揮抗AD的確切分子機(jī)制仍需深入。本研究采用大鼠側(cè)腦室注射Aβ1-40復(fù)制AD模型，探討核桃仁乙醇提取物對(duì)模型大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶的改善作用及其分子生物學(xué)作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

選取SD大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組和A、B、C(低、中、高劑量)治療組。A組核桃仁提取生藥0.05 g/100 g灌胃，B組核桃仁提取生藥0.15 g/100 g灌胃，C組核桃仁提取生藥0.5 g/100 g灌胃，以口服蒸餾水作為對(duì)照。

1.2 主要試劑及儀器

BACE1和ADAM10檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher公司；兔抗鼠BDNF抗體、兔抗鼠p-TrkB、兔抗鼠p-CREB和羊抗兔IgG-HRP二抗均購(gòu)自Abcam公司。

1.3 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè)

采用Morris檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，首先對(duì)大鼠進(jìn)行適應(yīng)性練習(xí)，大鼠每天在固定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)入水中練習(xí)，1次/d，60 s/次。連續(xù)練習(xí)6 d。實(shí)驗(yàn)中研究人員記錄大鼠進(jìn)入水池運(yùn)動(dòng)動(dòng)態(tài)及逃避潛伏期、平臺(tái)穿越次數(shù)。

1.4 大鼠海馬組織中BACE1、ADAM10活性檢測(cè)

大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死大鼠并解剖分離海馬組織，將含有蛋白酶抑制劑T-PER試劑與海馬組織混合制備勻漿，以溫度4 ℃、離心速度16 000 r/min離心60 min，收集上層清液并測(cè)定總蛋白濃度，按ELISA試劑盒操作步驟進(jìn)行ADAM10、BACE1酶活性測(cè)定。

1.5 大鼠海馬組織中BDNF、P-TrkB蛋白和TrkB蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

采用Western blot法檢測(cè)。取新鮮冰凍的海馬按比例加入裂解液進(jìn)行勻漿，勻漿后充分裂解30 min，12 500 r/min離心10 min后取上清。取出100 μL上清液加上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min使蛋白變性，以BCA法進(jìn)行蛋白定量，以 10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫下用封閉液封閉2 h后，加入兔抗鼠BDNF抗體(1∶500 Abcam，英國(guó))、兔抗鼠p-TrkB(1∶200 Abcam，英國(guó))和兔抗鼠p-CREB抗體(1∶200 Abcam，英國(guó))4 ℃孵育過夜或37 ℃孵育2 h，TBS緩沖液沖洗3次，加入羊抗兔IgG-HRP二抗(1∶2 000)，37 ℃孵育1 h，TBS緩沖液沖洗后，化學(xué)發(fā)光法顯色。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果比較

A、B、C組大鼠逃避潛伏期明顯短于對(duì)照組，平臺(tái)穿越次數(shù)明顯多于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表1。

組別大鼠數(shù)(n)逃避潛伏期(s)平臺(tái)穿越次數(shù)(次)A組636.75±7.54?1.97±0.52?B組628.92±6.86??2.88±0.78?C組625.63±6.24??3.25±0.94??對(duì)照組642.18±7.651.56±0.36

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 各組大鼠海馬組織中ADAM10、BACE1酶活性比較

A、B、C三組與對(duì)照組比較，核桃仁乙醇提取物上調(diào)海馬組織中ADAM10表達(dá)，下調(diào)BACE1表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表2。

組別大鼠數(shù)(n)ADAM10BACE1A組6167.52+21.56448.12+45.75?B組6208.38+24.68?405.73+43.54?C組6234.21+26.34??368.38+38.96??對(duì)照組6140.96+16.56512.45+64.82

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 各組大鼠海馬組織中BDNF/TrkB通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

A、B、C三組與對(duì)照組比較，BNDF、P-TrkB、p-CREB蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯上升，C組變化更突出，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表3。

表3 各組大鼠海馬組織BDNF/TrkB通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

本研究采用低、中、高三個(gè)劑量在對(duì)AD大鼠干預(yù)1個(gè)月后采用Morris水迷宮判斷其行為功能水平及用分子生物學(xué)方法研究其作用機(jī)制。研究結(jié)果顯示，經(jīng)用核桃仁乙醇提取物干預(yù)后，逃避潛伏期縮短，平臺(tái)穿越次數(shù)增多，學(xué)習(xí)記憶能力較模型對(duì)照組改善，且呈劑量濃度依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示核桃仁乙醇提取物具有改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。

阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，但主要是Aβ在海馬等重要腦區(qū)部位沉積并形成老年斑，從而神經(jīng)功能受到損傷，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[6-7]。近年來，隨著對(duì)β淀粉蛋白前體蛋白(APP)處理途徑認(rèn)識(shí)的不斷深入，APP降解的關(guān)鍵酶在AD發(fā)病中的作用越來越被重視。α分泌酶(ADAM10)和BACE1是降解APP作用截然不同的兩個(gè)重要關(guān)鍵酶，同時(shí)也是治療AD的重要藥物靶點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，ADAM10有切割A(yù)PP功能的α分泌酶活性，將AD小鼠與ADAM10轉(zhuǎn)基因小鼠雜交或?qū)⒋笫筮^表達(dá) ADAM10基因發(fā)現(xiàn)淀粉樣斑塊明顯減少，可溶性產(chǎn)物APPs-α增多，學(xué)習(xí)和記憶功能障礙明顯改善[8-10]。而AD模型鼠和患者腦中BACE1的蛋白表達(dá)水平顯著高于同齡野生鼠[11-12]和非AD患者；反之，通過SiRNA沉默或基因敲除等手段抑制BACE1酶活性可使APP裂解產(chǎn)生Aβ減少，淀粉樣斑塊減輕[13-14]。為探究核桃仁乙醇提取物改善大鼠學(xué)習(xí)記憶功能是否與APP降解酶相關(guān)，研究中檢測(cè)了ADAM10和BACE1酶活性。本研究結(jié)果表明，核桃仁乙醇提取物提高AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其作用機(jī)制與上調(diào)海馬組織中ADAM10表達(dá)水平和下調(diào)BACE1表達(dá)有關(guān)。

核桃仁乙醇提取物通過調(diào)控APP降解的兩個(gè)重要關(guān)鍵酶，從而改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。為探究其更深層次的分子生物學(xué)機(jī)制，研究中進(jìn)一步檢測(cè)了BDNF/TrkB信號(hào)通路。BDNF/TrkB通路在神經(jīng)再生及突觸功能重塑中發(fā)揮著重要作用，能夠改善AD認(rèn)知障礙。Arancibia S等[15]、Kimura N等[16]發(fā)現(xiàn)激活BDNF/TrkB通路能抑制Aβ對(duì)神經(jīng)元的毒性反應(yīng)，并且該過程能被TrkB受體特異性抑制劑阻斷；阻斷海馬神經(jīng)元的BDNF/TrkB信號(hào)通路使胞內(nèi)外Aβ沉積增加并且激活其毒性，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。Li N等[17]研究表明，Aβ的沉積導(dǎo)致APP/PS1小鼠海馬部位BDNF/TrkB/CREB信號(hào)通路功能障礙。本研究結(jié)果顯示，A、B、C三組中BNDF、p-CREB、p--TrkB蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯上升，C組變化最突出，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示BDNF/TrkB/CREB信號(hào)通路可能參與核桃仁乙醇提取物改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的調(diào)節(jié)。

綜述所述，核桃仁乙醇提取物通過調(diào)節(jié)APP降解的兩個(gè)重要關(guān)鍵酶，改善AD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，這種作用可能是通過調(diào)節(jié)BDNF/TrkB/CREB信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。