王 鋒，麻旭州，王道才，趙黎明，劉曉鵬，*

(1.湖北民族大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖北民族大學(xué))，湖北 恩施 445000)

機(jī)體在正常的生命活動(dòng)過程中一直伴隨著有氧代謝，不斷地產(chǎn)生自由基，自由基具有極強(qiáng)的生物活性且十分不穩(wěn)定，是多種疾病的根源[1].正常情況下，機(jī)體內(nèi)自由基處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)；但如果自由基產(chǎn)生過快或清除過慢，它們就會(huì)對(duì)機(jī)體造成傷害，甚至?xí)T發(fā)諸多疾病，例如癌癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、心血管疾病、糖尿病以及與衰老相關(guān)的退行性過程[2-5].抗氧化劑能夠有效地清除自由基，使機(jī)體免受自由基的損傷，受到廣泛應(yīng)用.目前所使用的抗氧化劑多是人工合成，但是人工合成的氧化劑攝入過多會(huì)產(chǎn)生毒副作用，其安全性與健康的初衷相反[6].天然抗氧化劑由于對(duì)機(jī)體的安全性高、無副作用且自身抗氧化能力強(qiáng)等特點(diǎn)愈來愈受到重視[7]，因此從植物中研究提取天然抗氧化劑具有重要意義.

和厚樸酚是木蘭科植物厚樸(MagnoliaofficinalisRehd.et Wils.)和凹葉厚樸(MagnoliaofficinalisRehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.)的干燥干皮、根皮及枝皮中的主要藥效成分之一[8-9]，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗氧化、抗抑郁、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫和保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等作用[10-14].盡管酚類物質(zhì)具有抗氧化活性，但迄今并未有研究明確和厚樸酚的體外抗氧化活性的強(qiáng)弱[15].本研究選取ABTS+·與DPPH自由基清除能力、FRAP值、總還原力和Fe2+螯合力5個(gè)指標(biāo)，并以Vc當(dāng)量以及EDTA-2Na當(dāng)量為單位，較系統(tǒng)地探究了和厚樸酚的體外抗氧化力，明確了其抗氧化活性能力的強(qiáng)弱，為和厚樸酚開發(fā)成一種新型的抗氧化劑提供試驗(yàn)依據(jù).

圖1 和厚樸酚與Vc的ABTS+·清除力Fig.1 ABTS+· scavenging ability of honokiol and Vc

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

和厚樸酚(Honokiol)購自西安天寶生物科技有限公司(純度>99%)；L(+)-抗壞血酸(Vc)、EDTA-2Na購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；ABTS購自life science products & senies；DPPH購自東京化成工業(yè)株式會(huì)社；2,4,6-三吡啶基三嗪(2,4,6-Tris(2-pyridyl)-s-triazine,TPTZ)購自日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社；六氰合鐵酸鉀購自天津市光復(fù)科技有限公司；菲咯嗪(3-(2-Pyridyl)-5,6-bis-(4-phenylsulfonicacid)-1,2,4-triazine)購自生工生物工程(上海)股份有限公司；以上及其余試劑均為分析純.

1.2 方法

1.2.1 ABTS+·清除力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[16]的方法，略有改動(dòng).先測(cè)定計(jì)算Vc標(biāo)準(zhǔn)品的ABTS+·清除率P，以Vc摩爾濃度為自變量、ABTS+·清除率為因變量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程；然后測(cè)定計(jì)算和厚樸酚的ABTS+·清除率P，以和厚樸酚摩爾濃度為自變量、ABTS+·清除率為因變量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程，計(jì)算和厚樸酚的Vc當(dāng)量.

1.2.2 DPPH自由基清除力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[17]的方法，略有改動(dòng).先測(cè)定計(jì)算Vc標(biāo)準(zhǔn)品的DPPH自由基清除率P，以Vc摩爾濃度為自變量、DPPH自由基清除率為因變量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程；然后測(cè)定計(jì)算和厚樸酚的DPPH自由基清除率P，以和厚樸酚摩爾濃度為自變量、DPPH自由基清除率為因變量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程，計(jì)算和厚樸酚DPPH自由基清除力的Vc當(dāng)量.

1.2.3 鐵離子還原抗氧化能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[18]的方法，略有改動(dòng).先測(cè)定計(jì)算Vc標(biāo)準(zhǔn)品的鐵離子還原抗氧化能力，以Vc摩爾濃度為自變量、593 nm處吸光值為因變量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程；然后測(cè)定計(jì)算和厚樸酚的鐵離子還原抗氧化能力，以和厚樸酚摩爾濃度為自變量、593 nm處吸光值為因變量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程，計(jì)算和厚樸酚鐵離子還原抗氧化能力的Vc當(dāng)量.

1.2.4 總還原力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[19]的方法，略有改動(dòng).先測(cè)定計(jì)算Vc標(biāo)準(zhǔn)品的總還原力；以Vc摩爾濃度為自變量、700 nm處的吸光值為因變量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程；然后測(cè)定計(jì)算和厚樸酚的總還原力，以和厚樸酚摩爾濃度為自變量、700 nm處的吸光值為因變量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出回歸方程，計(jì)算和厚樸酚總還原力的Vc當(dāng)量.

1.2.5 亞鐵離子螯合能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[20]的方法，略有改動(dòng).先測(cè)定計(jì)算EDTA-2Na標(biāo)準(zhǔn)品的亞鐵離子螯合率(清除率)P，以標(biāo)準(zhǔn)品摩爾濃度為自變量、亞鐵離子螯合率為因變量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程；然后測(cè)定計(jì)算和厚樸酚的亞鐵離子螯合率(清除率)P，以和厚樸酚摩爾濃度為自變量、亞鐵離子螯合率為因變量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出回歸方程，計(jì)算和厚樸酚亞鐵離子螯合能力的EDTA-2Na當(dāng)量.

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 和厚樸酚的ABTS+·清除力

和厚樸酚具有很強(qiáng)的ABTS+·清除力，和厚樸酚在0～0.047 mmol/L(0～0.0125 mg/mL)范圍內(nèi)，其ABTS+·清除力與其摩爾濃度呈正相關(guān)，線性方程為y=1 069.8x+0.894，決定系數(shù)R2=0.998 3(圖1)；Vc在0～0.142 mmol/L(0～0.025 mg/mL)范圍內(nèi)，Vc摩爾濃度與ABTS+·清除率之間有良好的線性關(guān)系，線性方程為y=444.144x-2.214，決定系數(shù)R2=0.996 5(圖1).計(jì)算得和厚樸酚ABTS+·清除力為(2.524±0.092) mol Vc當(dāng)量.

2.2 和厚樸酚的DPPH自由基清除力

和厚樸酚具有一定的DPPH自由基清除力，和厚樸酚在0～0.094 mmol/L(0～0.025 mg/mL)范圍內(nèi)，其DPPH自由基清除能力與其摩爾濃度呈正相關(guān)，線性方程為y=321.11x+1.712 4，決定系數(shù)R2=0.991 1(圖2)；而Vc在0～0.114 mmol/L(0～0.02 mg/mL)范圍內(nèi)，Vc摩爾濃度與DPPH自由基清除率之間有良好的線性關(guān)系，線性方程為y=423.852x+19.476，決定系數(shù)R2=0.995 9(圖2).計(jì)算得和厚樸酚DPPH自由基清除力為(0.291±0.014) mol Vc當(dāng)量.

2.3 和厚樸酚的鐵離子還原抗氧化能力

和厚樸酚具有很強(qiáng)的鐵離子還原抗氧化能力，和厚樸酚在0～0.375 mmol/L(0～0.1 mg/mL)范圍內(nèi)，其鐵離子還原抗氧化力與其摩爾濃度呈正相關(guān)，線性方程為y=1.241x+0.224，決定系數(shù)R2=0.992(圖3)；而Vc在0～0.8 mmol/L(0～0.14 mg/mL)范圍內(nèi)，Vc摩爾濃度與鐵離子還原抗氧化能力之間有很好的線性關(guān)系，線性方程為y=0.619 1x+0.177，決定系數(shù)R2=0.999 3(圖3).計(jì)算得和厚樸酚鐵離子還原抗氧化力為(2.150±0.172) mol Vc當(dāng)量.

2.4 和厚樸酚的總還原力

和厚樸酚具有一定的總還原力，在0～3.755 mmol/L(0～1.0 mg/mL)范圍內(nèi)，和厚樸酚總還原力與其摩爾濃度呈正相關(guān)，線性方程為y=0.052x+0.082，決定系數(shù)R2=0.995 1(圖4)；Vc在0～0.568 mmol/L(0～0.1 mg/mL)范圍內(nèi)，Vc摩爾濃度與總還原力之間有良好的線性關(guān)系，線性方程為y=1.064x+0.046 2，決定系數(shù)R2=0.996 3(圖4)；計(jì)算得到和厚樸酚總還原力為(0.058±0.002) mol Vc當(dāng)量.

2.5 和厚樸酚的亞鐵離子螯合力

和厚樸酚具有一定的亞鐵離子螯合力，和厚樸酚在0～1.877 mmol/L(0～0.5 mg/mL)范圍內(nèi)，它的亞鐵離子螯合力與其摩爾濃度呈正相關(guān)，線性方程為y=19.852x+2.303 2，決定系數(shù)R2=0.990 4(圖5)；而EDTA-2Na摩爾濃度與亞鐵離子螯合能力的關(guān)系如圖5所示，在一定范圍內(nèi)(0～0.269 mmol/L，即0～0.1 mg/mL)，EDTA-2Na摩爾濃度與亞鐵離子螯合率(清除率)之間有良好的線性關(guān)系，線性方程為y=367.15x+0.018 2，決定系數(shù)R2=0.995 3；計(jì)算得和厚樸酚亞鐵離子螯合力為(0.057±0.003)mol EDTA-2Na當(dāng)量.

3 討論與結(jié)論

自從Harman在1956年首次提出衰老自由基學(xué)說之后，機(jī)體的抗氧化研究就不斷深入，很多藥物具有抗氧化能力是因?yàn)槠浔旧砭哂羞€原性、能螯合金屬離子、提供氫供體、吸收電子及參與機(jī)體內(nèi)酶調(diào)控等作用[21-23].和厚樸酚有多種生理活性可能與其抗氧化能力相關(guān)，趙超[15]研究了新木脂素類天然產(chǎn)物的抗氧化活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)和厚樸酚能夠淬滅ABTS+·和DPPH自由基，抑制β-胡蘿卜素-亞油酸的氧化，抑制2,2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(AAPH)、Cu2+/GSH和DNA被羥自由基(·OH)氧化的反應(yīng)；但該研究?jī)H僅明確了和厚樸酚具有體外抗氧化能力，且未設(shè)陽性對(duì)照(如Vc)，對(duì)它的抗氧化能力強(qiáng)弱也無試驗(yàn)數(shù)據(jù)支持.郝慶紅等[24]研究了和厚樸酚對(duì)羥自由基的半數(shù)清除濃度、對(duì)過氧化氫的半數(shù)清除濃度，和厚樸酚對(duì)過氧化氫和羥自由基的清除作用要明顯強(qiáng)于抗壞血酸，此研究?jī)H顯示和厚樸酚具有較強(qiáng)的羥自由基和過氧化氫清除能力，但對(duì)其它抗氧化指標(biāo)的作用未見報(bào)導(dǎo)；且與用半數(shù)清除濃度(EC50)表示抗氧化活性大小方法相比，采用標(biāo)準(zhǔn)品當(dāng)量為單位，更能定量地體現(xiàn)活性強(qiáng)弱.

本研究采用Vc、EDTA-2Na標(biāo)準(zhǔn)品當(dāng)量為單位，研究了和厚樸酚的5個(gè)體外抗氧化活性指標(biāo)，從多方面系統(tǒng)地反應(yīng)出和厚樸酚的抗氧化活性.在一定的范圍內(nèi)和厚樸酚的ABTS+·清除力、DPPH自由基清除力、Fe3+還原抗氧化能力、總還原力和Fe2+螯合力均呈劑量依賴關(guān)系；對(duì)不同的指標(biāo)和厚樸酚的抗氧化能力是不同的，和厚樸酚具有很強(qiáng)的ABTS+·清除力、一定的DPPH自由基清除力；雖然和厚樸酚總還原力的Vc當(dāng)量較低、亞鐵離子螯合力的EDTA-2Na當(dāng)量較低，但和厚樸酚具有很強(qiáng)的鐵離子還原抗氧化能力，能夠說明和厚樸酚具有較高的體外抗氧化活性，該研究為將和厚樸酚開發(fā)成為抗氧化活性藥物提供一定的理論依據(jù).