楊小瓊，余 君，周 文，李 程，李春黎，王昌軍，孫敬國，陳守文，楊 勇*

1.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢市武昌區(qū)友誼大道368 號(hào) 430062

2.湖北省煙草科學(xué)研究院，武漢市硚口區(qū)解放大道618 號(hào) 430000

3.四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司長城雪茄煙廠，四川省什邡市鎣華山路南段128 號(hào) 618400

煙草青枯病是煙葉生產(chǎn)中的主要病害之一［1-4］。目前對(duì)煙草青枯病的防治主要包括化學(xué)防治、生物防治和農(nóng)業(yè)防治等［3，5-10］，長期施用化學(xué)農(nóng)藥不僅導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性等［11］，而且抗病品種選育成功率低仍是農(nóng)業(yè)防治中關(guān)鍵性難題［12-13］。生物防治方法因其安全、無公害和長效等特點(diǎn)已成為煙草青枯病防治的研究熱點(diǎn)［3，14］。目前施用生物菌劑防治煙草青枯病已有較多研究報(bào)道［15-18］，但煙草生產(chǎn)上青枯病并沒有得到有效的控制［19-20］。趙文宗等［21］研究表明，2,4-二叔丁基苯酚、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二異辛酯等芳香族化合物添加后會(huì)顯著提高青枯病的發(fā)病率和病情指數(shù)；劉艷霞等［22］證實(shí)煙草根系分泌物中的苯甲酸、3-苯丙酸等酚酸類物質(zhì)有利于青枯菌在煙株根際定殖；李石力等［23］研究發(fā)現(xiàn)，煙草根系分泌的有機(jī)酸通過增強(qiáng)青枯菌成膜基因的表達(dá)，可促進(jìn)煙草青枯病的發(fā)生?？梢?，煙草根系分泌物中的芳香族或有機(jī)酸具有促進(jìn)青枯病發(fā)生的作用。另外，煙草根系分泌的阿魏酸、肉桂酸、苯甲酸、香草酸、對(duì)羥基苯甲酸等自毒物質(zhì)是煙草連作的障礙因子［24-28］，而且連作土壤中阿魏酸及肉桂酸等化感自毒物質(zhì)含量高于輪作土壤［29-30］。因此，化感自毒物質(zhì)的積累是誘導(dǎo)青枯病發(fā)生的重要因素之一。

已報(bào)道鄰苯二甲酸酯具有類激素作用，長期接觸會(huì)對(duì)人體和其他生物的內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生較大影響［31］，而且鄰苯二甲酸二丁酯為鄰苯二甲酸酯的衍生物，是一類重要的化感自毒物質(zhì)［21］。雖然已有報(bào)道指出芳香族化合物如苯甲酸等對(duì)青枯菌具有趨化性，但鄰苯二甲酸二丁酯促進(jìn)青枯病的發(fā)生機(jī)制尚不明確。為此，以鄰苯二甲酸二丁酯為靶標(biāo)物質(zhì)，分析了鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)青枯菌的趨化誘導(dǎo)作用，并通過篩選高效降解菌降解土壤中的鄰苯二甲酸二丁酯，旨在為煙草青枯病綠色防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

土壤樣品取自于湖北大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院排污口、沙湖及垃圾堆，將所得土壤置于250 mL 滅菌的三角瓶中，4 ℃保存。供試煙草品種為云煙87。病原菌來源：青枯菌病原菌HF1-1 由湖北省煙草科學(xué)研究院提供。

試驗(yàn)所用試劑均購自國藥集團(tuán)有限公司。儀器：高效液相色譜儀（HPLC，美國安捷倫科技有限公司）；電子分析天平ME204E（感量0.000 1 g，上海梅特勒-托勒多儀器有限公司）；pH 計(jì)（梅特勒-托勒多儀器有限公司）；722 型分光光度計(jì)（梅特勒-托勒多儀器有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱LRH-70（上海索普儀器有限公司）；SIMCABLE8 超純水儀（美國Thermo 公司）；HQL300B 恒溫大幅度振蕩搖床（武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司）；低溫離心機(jī)（美國Scjlogex 公司）。

TTC 培養(yǎng)基（病原菌培養(yǎng)基）、基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)［32-33］配制。

1.2 方法

1.2.1 鄰苯二甲酸二丁酯處理后青枯菌生物量和趨化效應(yīng)分析

配制鄰苯二甲酸二丁酯含量分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 和4.5 mg/L 的NA 液體培養(yǎng)基，然后接種1 mL 青枯菌液（1.0×109CFU/mL），30 ℃培養(yǎng)24 h 后取菌懸液稀釋10 倍，在波長600 nm 下測(cè)定青枯菌的菌液濃度（CFU/mL）。

采用NA 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)青枯菌至OD600為1.0，將菌液離心后用等體積磷酸緩沖液（100 mmol/L，pH 7.0）重懸，靜置于無菌培養(yǎng)皿中。選用內(nèi)徑為1 mm 的滅菌毛細(xì)管，在管中吸入濃度為100 μmol/L 的鄰苯二甲酸二丁酯溶液，并垂直浸于青枯菌培養(yǎng)液培養(yǎng)皿內(nèi)，靜置40 min，用注射器將毛細(xì)管內(nèi)的液體移出，稀釋為1×10-5后涂布于含有TTC 的NA 固體平板上，30 ℃培養(yǎng)18 h 后計(jì)數(shù)。每處理3 次重復(fù)，以PBS 緩沖液為對(duì)照。

1.2.2 鄰苯二甲酸二丁酯降解菌篩選和培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.2.2.1 降解菌篩選

將收集的土壤分別取10 g，放于90 mL 滅菌去離子水中，180 r/min 振蕩過夜獲得菌懸液。吸取菌懸液10 mL 分別接種到鄰苯二甲酸二丁酯濃度為800 mg/L 的LB 培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d 后再吸取菌懸液100 μL 進(jìn)行第二次馴化，如此循環(huán)7 次，參考文獻(xiàn)［34］進(jìn)行馴化。從終濃度的各培養(yǎng)基中吸取100 μL 的菌懸液涂布于含有600 mg/L 鄰苯二甲酸二丁酯的固體培養(yǎng)基中，反復(fù)純化多次分離，挑選形態(tài)鮮明、菌落清晰的不同單菌落。在LB 培養(yǎng)液中富集培養(yǎng)。以鄰苯二甲酸二丁酯為唯一碳源，將挑選的各個(gè)菌置于基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)液中，30 ℃230 r/min 培養(yǎng)18 h，觀察菌液濁度，最終篩出可降解鄰苯二甲酸二丁酯的降解菌。

1.2.2.2 鄰苯二甲酸二丁酯降解效率檢測(cè)

降解菌經(jīng)LB 培養(yǎng)液富集培養(yǎng)，在鄰苯二甲酸二丁酯終濃度為300 mg/L 的基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基中，接種降解菌1 mL（1.0×109CFU/mL），30 ℃230 r/min 培養(yǎng)48 h。利用乙酸乙酯萃取培養(yǎng)液中殘余的鄰苯二甲酸二丁酯后，離心沉淀菌體，取上清液，用0.22 μm 的濾膜過濾，收集濾液待測(cè)。

采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定鄰苯二甲酸二丁酯含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。液相條件為：流動(dòng)相比例為甲醇∶水為95∶5，流速1 mL/min，波長245 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，色譜柱（Agilent ZORBAX SB-C18）為5 μm，4.6mm×250 mm。

1.2.2.3 菌種鑒定

參照文獻(xiàn)［35］進(jìn)行細(xì)菌生理生化指標(biāo)鑒定。

分子生物學(xué)鑒定：通過DNA 提取試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）得到目標(biāo)菌株（編號(hào)Ed2）的基因組，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：DNA模板5 μL，正反向引物各1 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，10xExtaq buffer 5 μL，Extaq 1 μL，加ddH2O補(bǔ)足體系至50 μL。引物序列：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，61 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min；30 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存30 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物的大小為1 450 bp 左右。同時(shí)由武漢擎科生物公司測(cè)序該產(chǎn)物大小為1 401 bp，并與GenBank中的16S rRNA序列進(jìn)行比對(duì)。

1.2.2.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化

在LB 固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行降解菌的活化，并轉(zhuǎn)移到LB 液體培養(yǎng)基中作為種子液，檢測(cè)單因素條件下Ed2 菌的生長狀況。

（1）接種1 mL 青枯菌液（1.0×109CFU/mL）至LB 培養(yǎng)液中，在溫度分別為18、30、37 和45 ℃，230 r/min 條件下培養(yǎng)，每隔4 h 取樣，測(cè)定OD600時(shí)青枯菌液濃度，每組設(shè)置3 次重復(fù)；（2）接種1 mL青枯菌液至LB 培養(yǎng)液中，在pH 分別為4、5、6、7、8、9，230 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)，每隔4 h 取樣，測(cè)OD600時(shí)青枯菌液濃度，每組設(shè)置3 次重復(fù)；（3）接種1 mL 青枯菌液至LB 培養(yǎng)液中，鄰苯二甲酸二丁酯的初始濃度分別為100、200、300、400、500 和600 mg/L，230 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)，每隔4 h 取樣，測(cè)定OD600值，每處理設(shè)置3 次重復(fù)。（4）青枯菌液接種量按培養(yǎng)液體積的0.6%、1.2%、1.8%、2.4%接種至LB 培養(yǎng)液中，30 ℃230 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)，每隔4 h 取樣，測(cè)定OD600值，每處理設(shè)置3 次重復(fù)。

1.2.2.5 鄰苯二甲酸二丁酯解降特性分析

在優(yōu)化條件下，按照1.2.2.2 節(jié)描述的方法測(cè)定鄰苯二甲酸二丁酯降解率。

1.2.3 盆栽試驗(yàn)

選擇生長健壯一致的5 片真葉期煙苗移栽至直徑12 cm、高16 cm 的盆缽中，每盆1 株，按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行栽培管理。試驗(yàn)共設(shè)置3 個(gè)處理。對(duì)照（CK）：基質(zhì)土壤中添加青枯菌（1.00×1010CFU/mL）；處理1（T1）：青枯菌+鄰苯二甲酸二丁酯；處理2（T2）：青枯菌+鄰苯二甲酸二丁酯+Ed2 菌。各處理中青枯菌菌懸液土壤接種量為10 mL（1.00×1010CFU/mL），鄰苯二甲酸二丁酯添加量為10 mL（600 mg/L），Ed2 菌接種量為10 mL（1.00×1010CFU/mL）。

煙苗移栽15 d 后，參考文獻(xiàn)［36］的方法，每7 d調(diào)查青枯病的發(fā)病情況并計(jì)算青枯病發(fā)病率。

發(fā)病率=（發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)）×100%

每個(gè)處理煙苗10 株，重復(fù)5 次，共計(jì)150 株。參照文獻(xiàn)［37］的方法，隨機(jī)抽取煙株3株，收集根際土壤各10 g。所取土樣分為兩份，一份加入無菌水90 mL 振蕩3 h，然后取懸濁液100 μL，涂布含TTC的NA 平板，30 ℃培養(yǎng)18 h 后統(tǒng)計(jì)青枯菌數(shù)量。另一份測(cè)定鄰苯二甲酸二丁酯含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。

鄰苯二甲酸二丁酯含量測(cè)定：利用乙酸乙酯萃取第二份收集的土壤中鄰苯二甲酸二丁酯，然后利用HPLC 法測(cè)定土壤鄰苯二甲酸二丁酯含量動(dòng)態(tài)變化，HPLC 法測(cè)定條件參照1.2.2.2 節(jié)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS19.0 軟件和Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)的描述統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)青枯病的影響

2.1.1 鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)青枯菌的生長和趨化效應(yīng)分析

圖1 顯示，隨著鄰苯二甲酸二丁酯濃度增加，青枯菌的菌液濃度先增加后減少，在鄰苯二甲酸二丁酯濃度為3.5 mg/L 時(shí)菌液濃度OD600為9.17±0.19（圖1 a），表明低濃度的鄰苯二甲酸二丁酯可以促進(jìn)青枯菌生長，而高濃度則抑制青枯菌生長，與于妍華等［38］研究結(jié)果基本一致，說明鄰苯二甲酸二丁酯是青枯菌生長的營養(yǎng)物質(zhì)；在毛細(xì)管中添加鄰苯二甲酸二丁酯，青枯菌的平均數(shù)量為（2.03±0.842）×107CFU/mL，明顯高于對(duì)照［CK，（3.63±1.67）×106CFU/Ml）（圖1 b），與李石力［23］和張克勤等［27］的試驗(yàn)結(jié)果基本一致，說明鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)青枯菌具有趨化誘導(dǎo)作用，也解釋了連作條件下隨著鄰苯二甲酸二丁酯濃度的增高，青枯病發(fā)病率也顯著升高的內(nèi)在原因［28，30］。

圖1 鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)青枯菌的生物量影響（a）和趨化誘導(dǎo)（b）Fig.1 Influences of dibutyl phthalate on biomass（a）of R.solanacearum and the chemotaxis-inducing effects（b）

2.2 降解菌篩選鑒定與培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.2.1 菌株篩選

以鄰苯二甲酸二丁酯為唯一碳源，從土壤中篩選獲得鄰苯二甲酸二丁酯降解菌4 株，HPLC 檢測(cè)結(jié)果顯示，鄰苯二甲酸二丁酯液相出峰時(shí)間為3.8 min 左右，根據(jù)HPLC 峰面積百分比確定1 號(hào)菌為高效降解菌（表1），該菌株在48 h 內(nèi)降解效率為89%（圖2 a），該菌株編號(hào)為Ed2。

表1 鄰苯二甲酸二丁酯降解效率Tab.1 Degradation rate of dibutyl phthalate

圖2 鄰苯二甲酸二丁酯降解率的液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms on degradation of dibutyl phthalate

2.2.2 菌株的生理生化鑒定

Ed2 菌在LB 培養(yǎng)基平板上菌落呈現(xiàn)乳白色，顯微鏡下觀察呈球桿狀，革蘭氏染色呈陰性，能夠利用葡萄糖、木糖、乳糖等，見表2。

表2 菌株的生理生化特性①Tab.2 Physiological and biochemical characteristics of Ed2 strain

將菌株Ed2 的16SrRNA 基因序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，序列登錄號(hào)為MK729019.1，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。分析結(jié)果顯示：菌株Ed2與不動(dòng)桿菌Acinetobacter nosocomialis strain RUH2376 在同一個(gè)分支上，序列相似性為80%，根據(jù)結(jié)果可以得知菌株Ed2 歸于不動(dòng)桿菌屬（圖3），并命名為Acinetobacter sp.Ed2。

圖3 Ed2 菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic analysis of Acinetobacter sp.Ed2

2.2.3 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

經(jīng)過培養(yǎng)及條件優(yōu)化，鄰苯二甲酸二丁酯的初始濃度為300 mg/L 時(shí)，Acinetobacter sp.Ed2 生長狀況最好（圖4 a）；其能耐受的pH 范圍為5.0～9.0。當(dāng)培養(yǎng)基pH 為7.0 時(shí)，Acinetobacter sp.Ed2 生長狀況最好（圖4 b）；在30 ℃條件下培養(yǎng)生長狀況最好（圖4 c）；在接種量為2.4%時(shí)生長狀況最好（圖4 d）。

圖4 不同培養(yǎng)條件下Acinetobacter sp.Ed2 生物量變化Fig.4 Biomass changes of Acinetobacter sp.Ed2 under different culture conditions

2.2.4 Acinetobacter sp.Ed2 降解鄰苯二甲酸二丁酯的特性

Acinetobacter sp.Ed2 經(jīng)培養(yǎng)48 h 后通過HPLC檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)溫度在30 ℃、接種量2.4%和pH7 時(shí)分別表現(xiàn)出較高的降解效果，其降解率分別為81.97%±8.1%、89%±4.15%和66.23%±6.4%，見圖5。

圖5 不同條件下Acinetobacter sp.Ed2 對(duì)鄰苯二甲酸二丁酯的降解特性Fig.5 Acinetobacter sp.Ed2's degradation characteristics to dibutyl phthalate under different conditions

2.3 降解菌處理后青枯病發(fā)病率及病原菌豐度的動(dòng)態(tài)變化

2.3.1 土壤中鄰苯二甲酸二丁酯降解分析

土壤中T1 處理鄰苯二甲酸二丁酯殘留率為36.68%±2.31%，T2 處理鄰苯二甲酸二丁酯殘留率為17.90%±1.99%，Acinetobacter sp.Ed2 對(duì)鄰苯二甲酸二丁酯的降解率為51.17%（圖6 c），說明Acinetobacter sp.Ed2 能在土壤中發(fā)揮降解作用。

圖6 土壤中鄰苯二甲酸二丁酯的降解效果Fig.6 Degradation efficiency analysis of dibutyl phthalate in soil by HPLC

2.3.2 青枯菌病原菌豐度動(dòng)態(tài)變化

圖7 表明，CK 青枯菌菌落數(shù)量為（3.84±0.12）×108CFU/mL，T1 處理青枯菌菌落數(shù)量為（6.14±0.74）×108CFU/mL，T2 處理青枯菌菌落數(shù)量為（5.9±1.65）×107CFU/mL。T1 處理青枯菌數(shù)量顯著高于CK（P=0.03），提高59.89%；T2 處理青枯菌數(shù)量顯著低于CK（P＜0.01）和T1 處理（P=0.04），分別降低84.63%和90.38%。說明降低土壤中鄰苯二甲酸二丁酯可以有效降低青枯病病原菌的數(shù)量。

圖7 不同處理土壤中青枯菌豐度及青枯病發(fā)病率的變化Fig.7 Changes of pathogen abundances of R.solanacearum in soil and incidences of bacterial wilt under different treatments

2.3.3 煙草青枯菌發(fā)病率動(dòng)態(tài)變化

青枯病發(fā)病率分析結(jié)果表明，CK 青枯病發(fā)病率為44.68%±6.5%；T1處理青枯病發(fā)病為69.39%±10.9%；T2 處理青枯病發(fā)病率為29.35%±9.2%。T1 處理青枯病發(fā)病率顯著高于CK（P＜0.01），提高55.30%；T2 處理青枯病發(fā)病率顯著低于CK（P=0.02）和T1 處理（P＜0.01），分別降低52.23%和136.42%。這與劉艷霞等［22］和李石力［23］的研究結(jié)果基本一致，說明根系分泌的化感自毒物質(zhì)積累是導(dǎo)致土壤病原微生物數(shù)量增加的重要原因，切斷青枯菌的趨化效應(yīng)物質(zhì)可以達(dá)到防治青枯病的目的。

3 結(jié)論

盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，鄰苯二甲酸二丁酯是青枯菌生長的重要營養(yǎng)物質(zhì)，低濃度條件促進(jìn)青枯菌生長，高濃度則抑制青枯菌生長；鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)青枯菌具有誘導(dǎo)趨化作用，是誘導(dǎo)和促進(jìn)青枯菌煙草根際定殖的重要因素；利用鄰苯二甲酸二丁酯高效降解菌降解土壤中的鄰苯二甲酸二丁酯，可以顯著降低土壤中青枯菌豐度和煙草青枯病的發(fā)病率。