郭 洋，王相凡，李學(xué)紅*，于國強(qiáng)，丁紅營，楊 峰，許紅濤

1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)科學(xué)大道136 號(hào) 450001

2.河南卷煙工業(yè)煙草薄片有限公司技術(shù)中心，河南省許昌市金葉大道666 號(hào) 461000

造紙法再造煙葉是將煙草原料（如煙末、碎煙片、片煙、煙梗等）進(jìn)行水浸提，將不溶物經(jīng)造紙工藝制成薄片，將浸提液濃縮后涂布于薄片上而制成的均質(zhì)化再造煙葉［1-5］。在再造煙葉工藝中，浸提液的真空濃縮過程會(huì)導(dǎo)致一定煙草化學(xué)成分揮發(fā)，從而影響再造煙葉產(chǎn)品的品質(zhì)。例如，葉建斌等［6］發(fā)現(xiàn)煙草浸提液經(jīng)濃縮后，一些重要致香成分如糠醛、苯乙醛、大馬酮和二氫獼猴桃內(nèi)酯等的質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯降低。李華雨等［7-8］研究表明煙草提取液濃縮過程中平均約30%左右的揮發(fā)性致香成分揮發(fā)損失，其中羧酸酯類化合物、煙堿和新植二烯分別減少約71.32%、73.15%和54.46%。濃縮時(shí)如果真空度低、溫度高，致香成分揮發(fā)較大；而濃縮真空度高、溫度低時(shí)，則被真空抽走的致香成分量增加［7-8］。因此，如何減少煙草浸提液濃縮過程中化學(xué)成分特別是致香成分的損失是再造煙葉生產(chǎn)中面臨的一個(gè)重要問題。

環(huán)糊精（Cyclodextrin，CD）是一類由D-吡喃型葡萄糖單元通過α-1,4-糖苷鍵相互連接而成的環(huán)狀低聚糖，其分子呈現(xiàn)為一個(gè)外表親水的疏水內(nèi)腔結(jié)構(gòu)，可以將疏水性客體包埋在其空腔內(nèi)而形成包合物，從而提高客體的穩(wěn)定性［9-11］。目前已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的環(huán)糊精主要有α-、β-和γ-環(huán)糊精（α-、β-和γ-CD）3 種，其中β-CD 價(jià)格低廉，應(yīng)用十分廣泛，而α-和γ-CD 由于有獨(dú)特的應(yīng)用特性，其生產(chǎn)規(guī)模也在逐年增長［12］。將環(huán)糊精應(yīng)用于煙草產(chǎn)品進(jìn)行增香已有不少報(bào)道，例如Kobayashi等［13］將香料用環(huán)糊精包埋后加入卷煙濾棒中，不僅提高了香料的穩(wěn)定性，還可改善香氣質(zhì)量；Zhu 等［14］和Ciobanu 等［15］用β-環(huán)糊精包埋煙用香料，提高了香料成分的熱穩(wěn)定性、延長了煙草的留香時(shí)間。截至目前，將環(huán)糊精添加至煙草浸提液減少濃縮過程中化學(xué)成分損失的研究還鮮見報(bào)道。因此，將3 種環(huán)糊精（α-、β-和γ-CD）添加至再造煙葉生產(chǎn)中的煙草浸提液中，研究環(huán)糊精對(duì)浸提液濃縮過程中化學(xué)成分揮發(fā)的影響，旨在為提高再造煙葉吸食品質(zhì)開發(fā)新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

煙草碎料由河南卷煙工業(yè)煙草薄片有限公司提供。

α-、β-和γ-環(huán)糊精（98%，山東濱州智源生物科技有限公司）；乙酸苯乙酯（內(nèi)標(biāo)，99%，上海麥克林生化科技有限公司）；其他試劑均為分析純，購自中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。

6890-5973N 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent 公司）；RE52-99 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；MP-501A 超級(jí)恒溫循環(huán)槽（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（河南省予華儀器有限公司）；同時(shí)蒸餾萃取裝置（北京玻璃集團(tuán)公司）。

1.2 方法

1.2.1 煙草浸提液的制備

稱取200 g 碎煙料，首次加入6 倍質(zhì)量的去離子水，60 ℃水浴攪拌浸提1 h，8 層紗布過濾，收集浸提液；第二次將殘余物加入4 倍質(zhì)量的水，再次60 ℃浸提30 min 后過濾；再重復(fù)4 倍質(zhì)量的水浸提，最后將3 次浸提液合并，4 000 r/min 離心10 min，將上清液密封后置于冰箱中冷藏。

1.2.2 添加或不添加環(huán)糊精煙草浸提液的濃縮及揮發(fā)物的冷凝回收

由于真空濃縮過程的揮發(fā)物通過冷凝方法不能被全部回收（大量低沸點(diǎn)成分被抽走），無法對(duì)揮發(fā)的化學(xué)成分進(jìn)行全面分析，因此本實(shí)驗(yàn)中采用常壓加熱濃縮-冷凝的方法，整個(gè)系統(tǒng)處于相對(duì)密閉狀態(tài)，確保所有揮發(fā)的化學(xué)成分得以全部收集并分析。具體操作如下：

準(zhǔn)確稱取100 g 浸提液于圓底燒瓶中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的環(huán)糊精，磁力攪拌0.5 h。將加樣燒瓶接入常壓加熱濃縮-冷凝裝置中，磁力攪拌下120 ℃油浴加熱2.5 h［16］［最終濃縮 液濃度約 為（25.5±0.5）波美度］，5 ℃冷卻水循環(huán)冷凝，同時(shí)冷凝管下端用玻璃導(dǎo)管插入含有水-二氯甲烷混合物（體積比1∶1）的三角瓶中，鋁箔密封瓶口。濃縮完畢且體系冷卻后，先后用蒸餾水和二氯甲烷沖洗冷凝管內(nèi)壁，收集沖洗液并與三角瓶中液體合并，密封條件下混合攪拌10 min，靜置后分離有機(jī)相，水相中再重復(fù)加入10 mL 二氯甲烷萃取2 次，合并有機(jī)相。

向有機(jī)相中加入10 g 無水硫酸鈉干燥過夜，用孔徑為0.45 μm 的有機(jī)針式過濾器過濾至濃縮瓶中，40 ℃水浴濃縮至1 mL，準(zhǔn)確加入50 μL 乙酸苯乙酯內(nèi)標(biāo)后進(jìn)行GC-MS 分析。GC-MS 測試條件［17-18］：

色譜柱：DB-5MS 毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；載氣：高純He；載氣流速：1.50 mL/min；進(jìn)樣方式：不分流；進(jìn)樣量：1 μL；升溫程序：50 ℃（2 min）280 ℃（5 min）；電離方式：EI；離子源溫度：230 ℃；電離能量：70 eV；四極桿溫度：150 ℃；質(zhì)量掃描范圍：50～450 amu；溶劑延遲：5 min。FID 檢測器溫度：250 ℃；氫氣流速：40 mL/min；空氣流速：450 mL/min；尾吹氣（He）流速：30 mL/min。

利用氣質(zhì)聯(lián)用儀自帶軟件（增強(qiáng)型數(shù)據(jù)分析化學(xué)工作站）對(duì)所得質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行NIST 譜庫檢索識(shí)別，并結(jié)合一些標(biāo)準(zhǔn)樣品的GC 保留時(shí)間、相關(guān)文獻(xiàn)中煙草成分的GC 保留時(shí)間進(jìn)行定性分析，選擇匹配度≥75%；以乙酸苯乙酯為內(nèi)標(biāo)，用相應(yīng)的校正因子校準(zhǔn)待測組分的峰值并與內(nèi)標(biāo)物的峰值進(jìn)行比較，求出待測組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

分別進(jìn)行α-CD、β-CD、γ-CD 組以及3 種環(huán)糊精混合組的濃縮揮發(fā)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)以不加環(huán)糊精組作為對(duì)照。單獨(dú)環(huán)糊精組中α-CD、β-CD 和γ-CD添加量均為1.0%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同），混合組中α-CD、β-CD 和γ-CD 添加量分別為0.25%、0.5%和0.25%。

2 結(jié)果與分析

研究環(huán)糊精對(duì)化學(xué)成分揮發(fā)性的影響，可以通過分析添加或不添加環(huán)糊精時(shí)濃縮液中化學(xué)成分的種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化來進(jìn)行，也可以通過分析浸提液濃縮過程中揮發(fā)的化學(xué)成分的變化來比較。但考慮到濃縮液中部分化學(xué)成分是以環(huán)糊精包合物的形式存在，不易于定量，因此本實(shí)驗(yàn)中采用后者即收集揮發(fā)的化學(xué)成分并GC-MS 分析來進(jìn)行研究。

在前期實(shí)驗(yàn)中，采用83 ℃、0.075 MPa 的參數(shù)（模擬實(shí)際生產(chǎn)條件）對(duì)浸提液進(jìn)行濃縮、0 ℃冷凝回收化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)濃縮可導(dǎo)致浸提液中化學(xué)成分損失達(dá)44.1%，主要集中于揮發(fā)性相對(duì)較高的52 種化學(xué)成分，而0 ℃冷凝只能回收其中約30 種成分，且這些成分的回收量遠(yuǎn)低于濃縮過程的損失量。因此，為了確保濃縮過程揮發(fā)出的化學(xué)成分被全部回收，又采用常壓的半封閉加熱濃縮系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.1 單獨(dú)加入3 種環(huán)糊精對(duì)浸提液濃縮過程中化學(xué)成分揮發(fā)的影響

浸提液經(jīng)濃縮后回收的揮發(fā)物質(zhì)經(jīng)GC-MS分析，檢測出的主要化學(xué)成分及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果見表1?？芍?，從二氯甲烷萃取液中主要檢測出58 種化學(xué)成分，其中酮類20 種、醇類10 種、醛類4種、酯類6 種、酚類3 種、雜環(huán)類6 種、酸類3 種、烴類6 種。相對(duì)于對(duì)照組，在添加量為1%的條件下，3 種CD 均能不同程度地降低濃縮過程中化學(xué)成分的揮發(fā)。

表1 單獨(dú)加入3 種CD 時(shí)浸提液濃縮揮發(fā)物中化學(xué)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tab.1 Contents of chemical components in volatile components during extraction when adding three CDs separately（μg·g-1)

表1（續(xù)1）

表1（續(xù)2）

為了更好地分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)表1 中數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，可得到加入3 種CD 后浸提液濃縮過程中58種化學(xué)成分的相對(duì)揮發(fā)減少量，對(duì)照保留時(shí)間，結(jié)果列于表2。

表2 3 種CD 對(duì)浸提液濃縮過程化學(xué)成分揮發(fā)減少量的影響Tab.2 Effects of three CDs on volatilization of chemical components during extraction and concentration

表2（續(xù)1）

由表2 可知，3 種環(huán)糊精降低化學(xué)成分揮發(fā)性的作用存在差異。α-CD 整體降低較少，除了能夠降低小分子酮或醇、α-香附酮、苯甲醛、苯乙醛、苯、有機(jī)酸和部分雜環(huán)類化合物的揮發(fā)外，對(duì)其他類型成分的揮發(fā)性影響相對(duì)較小。β-CD 和γ-CD降低化學(xué)成分揮發(fā)的量相對(duì)較大，影響到的化學(xué)成分范圍也相對(duì)更大，特別是γ-CD，對(duì)大部分化學(xué)成分的揮發(fā)均有較好的降低作用，在成分范圍方面也寬于α-CD 和β-CD。

為了探索3 種CD 與化學(xué)成分出峰時(shí)間的關(guān)系，以GC-MS 保留時(shí)間為橫坐標(biāo)、3 種CD 條件下浸提液濃縮過程化學(xué)成分的揮發(fā)減少量為縱坐標(biāo)作圖，得圖1。

由圖1 并結(jié)合表2 可知，γ-CD 降低化學(xué)成分揮發(fā)明顯，β-和α-CD 相對(duì)較弱。具體來說，γ-CD除了對(duì)保留時(shí)間分別為8.66、8.82、20.45 和26.53 min 的異戊醛、苯、苯酚和芳樟醇沒有效果外，對(duì)整個(gè)出峰保留時(shí)間范圍內(nèi)的其他化學(xué)成分的揮發(fā)均有不同影響。β-CD 影響的化學(xué)成分范圍也較廣，但總體效果不如γ-CD，其使化學(xué)成分揮發(fā)減少約19.7%。α-CD 主要對(duì)保留時(shí)間在8.82～20.14 min 之間的化學(xué)成分以及保留時(shí)間分別為23.87、54.30、56.13、58.58 和72.62 min 的化學(xué)成分有影響，對(duì)化學(xué)成分揮發(fā)的降低程度為19.8%，特別是其對(duì)保留時(shí)間小于12.83 min 的幾種化學(xué)成分的影響，可以與β-和γ-CD 形成互補(bǔ)。

3 種環(huán)糊精對(duì)煙草化學(xué)成分揮發(fā)性的影響跟其疏水空腔與客體分子尺寸的匹配度、客體疏水性等因素有關(guān)［19-20］。α-CD 的空腔直徑在0.47～0.53 nm 之間，通常只能包埋體積相對(duì)較小的分子，而β-CD 和γ-CD 的空腔直徑分別為0.60～0.65 nm 和0.75～0.83 nm，隨著空腔直徑的增大，其所能包埋的客體的分子量范圍也增大。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，β-CD 和γ-CD 對(duì)煙草化學(xué)成分的包埋選擇性不強(qiáng)，而α-CD 則表現(xiàn)一定的分子尺寸選擇性。

2.2 加入3 種環(huán)糊精混合物對(duì)浸提液濃縮過程中化學(xué)成分揮發(fā)性的影響

3 種環(huán)糊精降低化學(xué)成分揮發(fā)性的能力依次為γ-CD＞β-CD＞α-CD。但γ-CD 價(jià)格較高，實(shí)際應(yīng)用受限，β-CD 成本低廉，在工業(yè)領(lǐng)域中應(yīng)用最廣，α-CD 價(jià)格居中且在降低小分子成分揮發(fā)方面有一定優(yōu)勢，三者具有一定程度的互補(bǔ)性。考慮上述因素，初步選擇使用α-CD、β-CD 和γ-CD 添加質(zhì)量比例為1∶2∶1，結(jié)果見表3。

浸提液濃縮后得到的揮發(fā)性成分經(jīng)GC-MS分析，共鑒定出64 種化學(xué)成分，其中酮類22 種、醇類12 種、醛類4 種、酯類7 種、酚類3 種、雜環(huán)類6種、酸類5 種、烴類5 種。相對(duì)于未添加環(huán)糊精的對(duì)照組，加入1%環(huán)糊精混合物，化學(xué)成分的揮發(fā)量均顯著降低。酮類化合物中3 種低濃度組分9-羥基-4,7-巨豆二烯-3-酮、α-香附酮和螺巖蘭草酮未檢出，可能被CDs 保留在濃縮液中，揮發(fā)量減少20.0%～33.3%的有11 種，8.3%～19.4%的有8 種；對(duì)于12 種醇類化合物，其中有6 種組分的揮發(fā)量減少20.0%～31.6%，3 種組分的揮發(fā)量減少10.0%～20.0%，2 種組分的揮發(fā)量減少小于10%，低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的鐮葉芹醇在揮發(fā)物中未檢出，可能被保留在濃縮液中；對(duì)于酯類化合物，二氫獼猴桃內(nèi)酯和閉鞘姜酯的揮發(fā)量分別減少41.4%和35.6%，其余酯類的揮發(fā)量減少7.6%～18.2%；6 種雜環(huán)類化合物中，除3-（4,8,12-三甲基十三烷基）呋喃揮發(fā)量減少61.5%外，其余的減少量在13.2%～25.6%之間；5種有機(jī)酸中，低濃度的2-癸烯酸和棕櫚酸未檢出，丁酸、2-甲基丁酸和己酸的揮發(fā)量減少分別為25.3%、9.1%和30.3%；另外，醛類和酚類化合物揮發(fā)量減少分別在13.9%～26.2%和16.4%～23.8%之間，烴類化合物減少9.3%～26.9%（4,4-二甲基-3-（3-甲基-3-丁烯亞基）-2-亞甲基雙環(huán)［4.1.0］庚烷未檢出，八氫-2-（1-甲基亞乙基）-4,7-亞甲基-1H-茚揮發(fā)量減少50.0%）。

為了更直觀顯示3 種CD 的混合物對(duì)揮發(fā)性成分的影響，以化學(xué)成分的組分序號(hào)為橫坐標(biāo)，以化學(xué)成分的相對(duì)揮發(fā)減少量為縱坐標(biāo)進(jìn)行作圖，得圖2?？芍?，各數(shù)據(jù)點(diǎn)的縱坐標(biāo)值主要分布于10.0%～30.0%之間，說明加入1%CD 混合物后，大多數(shù)化合物的相對(duì)揮發(fā)減少量處于此范圍內(nèi)，相比單獨(dú)加入3 種CD，混合環(huán)糊精可以對(duì)整體化合物揮發(fā)量起到降低效果。

表3 添加3 種CD 混合物對(duì)浸提液濃縮過程化學(xué)成分揮發(fā)減少量的影響Tab.3 Effects of three CDs mixture on volatilization loss of chemical components during extraction and concentration

表3（續(xù)1）

圖2 3 種環(huán)糊精混合物對(duì)各化學(xué)成分揮發(fā)減少量的影響Fig.2 Effects of three CDs mixture on the volatilization loss of chemical components

3 結(jié)論

①向煙草浸提液中添加3 種環(huán)糊精可有效降低濃縮過程中化學(xué)成分的揮發(fā)量，但不同環(huán)糊精對(duì)各化學(xué)成分揮發(fā)量的降低程度存在差異。其中，γ-CD 降低作用最強(qiáng)，β-CD 次之，α-CD 的效果最差；γ-CD 和β-CD 對(duì)較廣范圍的化學(xué)成分有影響，α-CD 對(duì)中小分子化合物的影響更為顯著且具有選擇性。②相比于單獨(dú)加入3 種環(huán)糊精，加入混合環(huán)糊精能夠降低化合物的整體揮發(fā)量，更有利于煙草化學(xué)成分整體揮發(fā)量的減少。