林亞萱 黨晨原 鐘思寧 王佳文 鄭彤 倪晉仁

丹江口水庫上下游古菌優(yōu)勢菌群落結(jié)構(gòu)特征分析

林亞萱 黨晨原 鐘思寧 王佳文 鄭彤 倪晉仁?

教育部水沙科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京大學(xué)環(huán)境工程系, 北京 100871; ?通信作者, E-mail:nijinren@iee.pku.edu.cn

采用 16S rRNA Illumina Miseq 高通量測序技術(shù), 分析丹江口水庫庫區(qū)及漢江下游古菌物種組成, 并對大壩上、下游水體與沉積物中占優(yōu)勢的氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea, AOA)和產(chǎn)甲烷古菌(Methanogenic archaea)群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果表明, 優(yōu)勢種群落結(jié)構(gòu)組成受到水體與沉積物樣本差異的影響, 可由氨氧化古菌的好氧特性與產(chǎn)甲烷古菌的厭氧特性合理地解釋。網(wǎng)絡(luò)圖分析表明, 丹江口水庫上游氨氧化古菌與產(chǎn)甲烷古菌具有顯著的相關(guān)關(guān)系。受丹江口水庫運(yùn)行的影響, 大壩下游水體及沉積物中氨氧化古菌豐度皆比大壩上游少, 而沉積物中產(chǎn)甲烷古菌豐度較高, 二者間相關(guān)性不明顯。

大壩; 氨氧化古菌; 產(chǎn)甲烷古菌; 高通量測序

河流是重要的生態(tài)系統(tǒng), 在生態(tài)平衡和人類生活中起著至關(guān)重要的作用[1]。河流是地球陸地表面因流水作用而形成的典型地貌類型[2], 具有泄洪、供水、自凈、航運(yùn)、發(fā)電和景觀等多種功能[3]。河流中含有豐富的微生物, 它們是生物地球化學(xué)過程(如氮、硫和碳循環(huán))的關(guān)鍵參與者, 是各生態(tài)系統(tǒng)的主要生產(chǎn)者和消費(fèi)者[4], 對水質(zhì)有重要的影響[5]。為了實(shí)現(xiàn)水資源優(yōu)化配置, 利用水庫可以實(shí)現(xiàn)蓄水、防洪和發(fā)電等諸多功能, 但也會導(dǎo)致河流生境和生物的變化[6]。

漢江是長江最大的支流, 水利資源豐富[7]。漢江上游山谷具有天然的地勢落差, 丹江口水庫的建設(shè)使庫區(qū)水位上升, 由于周邊土壤被淹沒, 導(dǎo)致土壤中養(yǎng)分進(jìn)入水體, 水中氮和磷的含量增加[8]。前人的研究表明, 大壩對生境以及細(xì)菌、魚類等群落結(jié)構(gòu)和多樣性造成影響[9–10]。Reyes-Gavilán 等[11]指出, 水壩建設(shè)會對魚類群落的遷徙造成影響, 從而影響整體多樣性。Wang 等[12]指出, 大壩會對浮游細(xì)菌的生物量和多樣性造成影響。另有研究表明, 大壩會導(dǎo)致沉積物物理化學(xué)性質(zhì)改變, 使得微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[13]。

古菌中的氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archa-ea, AOA)在河流生態(tài)系統(tǒng)的氮循環(huán)中發(fā)揮著重要作用[14]。例如, Zhou等[15]的研究發(fā)現(xiàn), 氨氧化古菌可以適應(yīng)極端環(huán)境, 并在極端環(huán)境中對全球氮循環(huán)發(fā)揮不可或缺的作用。產(chǎn)甲烷古菌(methanogenic ar-chaea)則是介導(dǎo)土壤和河流底泥中甲烷循環(huán)的重要功能物種[16], 廣泛分布在海洋沉積物[17]、淡水沉積物[18]、水稻田[19]、濕地[20]、人類和動物的腸道[21]以及厭氧消化器等極端環(huán)境。有研究估計(jì), 河流對全球甲烷的貢獻(xiàn)將從每年 1.5Tg CH4升高到 26.8 Tg CH4, 相當(dāng)于濕地與湖泊甲烷排放量的 15%和40%[22–23]。鑒于氨氧化古菌及產(chǎn)甲烷古菌存在的廣泛性和重要性, 本文選擇漢江代表性河段進(jìn)行采樣, 重點(diǎn)了解漢江受丹江口水庫建設(shè)影響區(qū)域的古菌群落與優(yōu)勢種, 揭示大壩對研究區(qū)域古菌優(yōu)勢種的影響。

1 研究區(qū)域與研究方法

1.1 研究區(qū)域及樣點(diǎn)布設(shè)

漢江全長 1532km, 流域面積有 15.9 萬 km2[24]。根據(jù)漢江的國家水文站點(diǎn)分布情況, 設(shè)置 6 個(gè)采樣點(diǎn), 從上游到下游分別是白河、陶岔、丹江口壩下、襄陽、仙桃和集家嘴(圖 1), 于 2014 年春季(3月)和秋季(10月)同步采集水樣與沉積物樣本。

1.2 樣品采集與處理

參照中華人民共和國環(huán)境保護(hù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) HJ/T- 2002《地表水和污水檢測技術(shù)規(guī)范》中的等比例混合水樣采集法[25], 將采集的水樣在 24 小時(shí)內(nèi)用孔徑為 0.22μm 的聚碳酸酯膜(Millipore, 美國)進(jìn)行過濾。過濾水樣的濾膜與沉積物樣本都置于干冰中, 運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室, 貯藏在?80oC冰箱中備用。

水樣 DNA 提取使用液氮反復(fù)凍融法來裂解細(xì)胞, 后續(xù)與沉積物樣本一致, 依據(jù) FastDNA SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals, 美國)試劑盒協(xié)議步驟進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用 524F10extF/Arch958RmodR[26]引物對 16S rRNA 進(jìn)行 3 次 PCR 重復(fù)擴(kuò)增。本研究采用 MiSeq高通量測序技術(shù), 以 97% 的相似性閾值進(jìn)行 OUT 聚類, 后與 Silva 數(shù)據(jù)庫比對, 獲得 OTU 物種表格。

使用 R 語言軟件(R version 3.5.1)的 pheatmap, vegan, ggplot2 和 igraph程序包, 分別對數(shù)據(jù)進(jìn)行熱圖(Heatmap)分析、非度量多維標(biāo)定 (non-metric multi-dimensional scaling, NMDS)分析、ANOSIM分析、方差分析和網(wǎng)絡(luò)關(guān)系(Network)圖分析。其中, NMDS 使用 Bray-Curtis 距離, 方差分析以< 0.05 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。Network 以= 0.85 作為閾值, 做 Spearman 相似性分析, 使用Gephi 作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 古菌及優(yōu)勢種的群落組成

通過 16S rRNA 高通量測序技術(shù), 分析漢江生態(tài)系統(tǒng)中古菌群落組成。此次調(diào)查共得到 2908 個(gè)OTU, reads 數(shù) 966898 條。所有樣品共檢測出 21 個(gè)門, 相對豐度大于 0.01%的共有 12 個(gè)門以及一個(gè)未分類微生物, 分別為(奇古菌門, 53.9%)、(廣古菌門, 26%)、(深古菌門, 9.5%)、(0.7%)、(洛基古菌, 0.8%)、(1.1%)、(0.6%)、(0.4%)、(0.3%)、(0.3%)、(0.3%)、(0.3%)及unclassified (5.3%), 如圖 2 所示。奇古菌門和廣古菌門是漢江流域的主要優(yōu)勢菌門, 數(shù)量占有絕對優(yōu)勢, 但兩者在水樣和泥樣中的相對豐度有顯著區(qū)別: 奇古菌門在水體樣品中的相對豐度(超過 50%)都比在沉積物中高(約占 20%); 廣古菌門是漢江流域沉積物中古菌豐度最高的門(43.5% (春泥)和 42.8%(秋泥)), 也是浮游古菌豐度第二高的優(yōu)勢門(23.5% (春水)和4.7% (秋水))。

奇古菌門中以氨氧化古菌(87.90%)為主, 廣古菌門內(nèi)物種豐富, 包括產(chǎn)甲烷菌(65.34%)、甲烷氧化菌(7.64%)與嗜鹽菌(0.02%)等, 由此得出氨氧化古菌是奇古菌門的優(yōu)勢種, 產(chǎn)甲烷菌是廣古菌門的優(yōu)勢種的結(jié)論。漢江中的優(yōu)勢功能物種是氨氧化古菌和產(chǎn)甲烷古菌, 二者分別在漢江的水體與沉積物中起重要作用。發(fā)現(xiàn)的氨氧化古菌共有 4 種屬, 分別是(),(),()和(), 其中在氨氧化古菌中相對豐度最高。產(chǎn)甲烷古菌中是屬屬和屬的相對豐度最高。屬和屬是已知產(chǎn)甲烷古菌中僅有的兩種可以使用乙酸作為底物的屬[27]。研究表明, 在淡水環(huán)境中是乙酸型的產(chǎn)甲烷古菌占主導(dǎo), 其中乙酸型和氫營養(yǎng)產(chǎn)甲烷古菌分別占 CH4產(chǎn)量的 70%和 30%[28–29]。

漢江上游的丹江口水壩是南水北調(diào)中線工程的調(diào)水源頭。圖 3 比較古菌優(yōu)勢種在丹江口水壩上、下游的相對豐度差異, 其中 4 個(gè)區(qū)域分別是丹江口水壩上游水體、上游沉積物、下游水體和下游沉積物中古菌的相對豐度, 顏色的深淺代表相對豐度的高低。4 個(gè)分組中, 氨氧化古菌的屬、屬綱和綱以及產(chǎn)甲烷古菌的屬、屬和屬都是豐度較高的物種。屬和綱在水體中相對豐度高, 體現(xiàn)氨氧化古菌對好氧環(huán)境的偏好。屬與屬則在水體中相對豐度較低, 在沉積物中相對豐度較高, 顯示產(chǎn)甲烷古菌的厭氧特性。

本研究中, 浮游古菌以好氧的氨氧化古菌為主, 沉積物古菌則以厭氧的產(chǎn)甲烷古菌為主, 這種現(xiàn)象可由氨氧化古菌的好氧特性與產(chǎn)甲烷古菌的厭氧特性來合理的解釋。雖然在水體與沉積物中也分別發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甲烷古菌與氨氧化古菌, 但這是由于氨氧化古菌可以在低氧環(huán)境中生存[15]。另一方面, 產(chǎn)甲烷古菌也在好氧環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)[30–32], 但有氧環(huán)境對產(chǎn)甲烷有抑制作用。

分別篩選出壩上與壩下水體和沉積物中具有顯著性差異的優(yōu)勢物種(<0.05)。圖 4 顯示, 水庫下游浮游氨氧化古菌的豐度略少于上游, 而產(chǎn)甲烷古菌的豐度在上、下游的差別不顯著(尤其是屬和屬)。圖 5 顯示, 沉積物中氨氧化古菌的豐度在丹江口水壩下游減少, 表明沉積物中氨氧化古菌受到水壩運(yùn)行的影響, 而產(chǎn)甲烷古菌的豐度在下游比上游有明顯的提升, 可能與上、下游沉積物中有機(jī)質(zhì)含量的差異有關(guān)。

2.2 古菌優(yōu)勢種群落結(jié)構(gòu)空間分布

采用 NMDS 分析法, 分別分析大壩上、下游兩個(gè)優(yōu)勢菌群落結(jié)構(gòu)的時(shí)空格局(圖 6)。壩上與壩下的氨氧化古菌群落組成在沉積物與水體間有差異, 沉積物中的物種形成一個(gè)明顯的區(qū)塊, 浮游物種相對分散, 但也形成一個(gè)區(qū)塊, 表明漢江流域的氨氧化古菌群落結(jié)構(gòu)組成受到水體和沉積物樣本差異的影響。產(chǎn)甲烷古菌與氨氧化古菌的分析結(jié)果一致, 產(chǎn)甲烷古菌的群落結(jié)構(gòu)組成在壩上與壩下都受到樣品差異的影響。

為驗(yàn)證結(jié)果的可靠性, 對 NMDS 分析結(jié)果進(jìn)行相似性分析(圖 7)。壩上氨氧化古菌的值為 0.5,值為 0.01; 壩下值為 0.5643,值為 0.001。壩上產(chǎn)甲烷古菌的值為 0.3056,值為 0.04; 壩下值為 0.3047,值為 0.007。值表示結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 表明優(yōu)勢種在丹江口水庫上、下游的樣品差異分組具有意義, 顯示氨氧化古菌和產(chǎn)甲烷古菌都受到水體與沉積物樣品差異的影響。

對古菌優(yōu)勢種的時(shí)空格局分析結(jié)果表明, 雖然丹江口水庫在一定程度上影響古菌優(yōu)勢種在上、下游的相對豐度, 但并未顯著地影響古菌群落結(jié)構(gòu), 表明古菌對不同環(huán)境具有更廣泛的適應(yīng)性。溫度、pH和氧氣濃度等的變化是導(dǎo)致水體與沉積物中優(yōu)勢種群落結(jié)構(gòu)變化的關(guān)鍵因素, 例如,屬和屬常在海洋與河口沉積物中被發(fā)現(xiàn)[33],屬偏好酸性土壤,屬則主要在陸地土壤中被發(fā)現(xiàn)[34]。產(chǎn)甲烷古菌內(nèi)部物種同樣對環(huán)境有不同的需求, 如甲烷屬要求乙酸濃度高的生存環(huán)境,屬則可在乙酸濃度偏低的環(huán)境中生存[35]。產(chǎn)甲烷菌根據(jù)對溫度的要求不同, 可分為嗜熱菌(55~80°C 左右)、嗜溫菌(35°C 左右)以及嗜冷菌(低于 25°C)。例如, 研究表明低溫條件下產(chǎn)甲烷古菌以乙酸型的屬占主導(dǎo)[36], 嗜冷菌的屬物種不能在超過 20°C的地方生長[37]。

圖5 沉積物中優(yōu)勢物種在大壩上游與下游的豐度

2.3 古菌優(yōu)勢種之間的關(guān)系

通過網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(圖 8), 分析氨氧化古菌與產(chǎn)甲烷古菌在大壩上、下游物種之間的關(guān)系。丹江口水壩上游優(yōu)勢物種共生網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)中, 氨氧化古菌和產(chǎn)甲烷古菌分別占 44.44%和 55.56%, 兩者之間的關(guān)系以正相關(guān)為主。上游優(yōu)勢物種的共生網(wǎng)絡(luò)(圖 8(a))可以分為 3 個(gè)部分: 氨氧化古菌的獨(dú)立部分、產(chǎn)甲烷古菌獨(dú)立部分以及兩者相互關(guān)聯(lián)的部分。兩者相互關(guān)聯(lián)的部分主要包括 OTU2577, OTU 4187, OTU1436, OTU4358, OTU2748, OTU2799, OTU2545, OTU2543, OTU3255, OTU3089, OTU 3469 和 OTU4227, 分別屬于氨氧化古菌的綱與, 以及產(chǎn)甲烷古菌的,,,,和。

丹江口水壩下游氨氧化古菌與產(chǎn)甲烷古菌的比例分別是 47.22%和 52.78%。兩個(gè)優(yōu)勢種之間的關(guān)系以正相關(guān)為主, 負(fù)相關(guān)僅占總體的不到 1%。下游兩個(gè)優(yōu)勢種各自形成獨(dú)立的區(qū)塊(圖 8(b)), 彼此之間基本上沒有關(guān)聯(lián)。既屬于上游相互聯(lián)系的又在下游相關(guān)的 OTU 有 OTU1436, OTU2577, OUT2545, OTU3255, OTU3089 和 OTU4227, 分別屬于氨氧化古菌的綱以及產(chǎn)甲烷古菌的和。

對比丹江口水庫上、下游物種間的關(guān)系, 可知丹江口水庫上游氨氧化古菌與產(chǎn)甲烷古菌具有顯著的相關(guān)關(guān)系, 而下游的相關(guān)性并不明顯。黃柳琴等[38]的研究表明, 雖然水庫運(yùn)行對氨氧化古菌群落結(jié)構(gòu)的影響并不明顯, 但會改變其生存方式, 如在三峽大壩上游的氨氧化古菌以附著為主, 而下游以浮游為主。這與我們的研究結(jié)果十分類似, 即壩上游氨氧化古菌與產(chǎn)甲烷古菌關(guān)聯(lián)密切, 但壩下游因河床的劇烈沖刷大大削弱了二者之間的聯(lián)系。

3 結(jié)論

本文基于 2014 年春季(4 月)和秋季(10 月)在受丹江口水庫影響的漢江河段監(jiān)測結(jié)果, 對古菌物種組成、群落結(jié)構(gòu)及優(yōu)勢種的相互關(guān)系進(jìn)行分析, 得到以下主要結(jié)論。

1)漢江流域古菌物種的組成由奇古菌門和廣古菌門主導(dǎo), 水體中以奇古菌門中的氨氧化古菌為主, 沉積物中則以廣古菌門的產(chǎn)甲烷古菌為主, 這可用氨氧化古菌和產(chǎn)甲烷古菌分別適宜好氧和厭氧環(huán)境進(jìn)行很好的解釋。

2)丹江口水庫對氨氧化古菌豐度的影響更主要地表現(xiàn)為對沉積物中古菌的影響。沉積物中產(chǎn)甲烷古菌的豐度在壩下游明顯增高, 可能與上、下游沉積物中有機(jī)質(zhì)含量的差異有關(guān)。大壩上、下游氨氧化古菌與產(chǎn)甲烷古菌的群落結(jié)構(gòu)組成受水體與沉積物樣本類型差異的影響更大。

3)網(wǎng)絡(luò)圖分析表明, 丹江口水庫上游氨氧化古菌與產(chǎn)甲烷古菌具有顯著的相關(guān)性, 但是在大壩下游二者之間未呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性, 推測與壩下河床沖刷造成物種生存方式的變化有關(guān)。

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Community Characteristics of Dominant Archaea before and after the Danjiangkou Dam

LIN Yaxuan,DANG Chenyuan,ZHONG Sining,WANG Jiawen,ZHENG Tong,NI Jinren?

Key Laboratory of Water and Sediment Sciences (MOE), Department of Environmental Engineering, Peking University, Beijing 100871;? Corresponding author, E-mail: nijinren@iee.pku.edu.cn

The 16S rRNA Illumina Miseq high-throughput sequencing technology was used to analyze the species composition of archaea in the Danjiangkou reservoir area and the downstream Hanjiang River. The structure of ammonia-oxidizing archaea (AOA) and methanogenic archaeathat dominated the water and sediments in the upstream and downstream dam was analyzed. The results showed that the structure of the dominant species was affected by the samples difference, which could be explained by the aerobic preference of the ammonia-oxidizing archaea and the anaerobic properties of the methanogenic archaea. According to the network analysis, there was a significant correlation between the ammonia-oxidizing archaea and the methanogenic archaea in the upstream of the Danjiangkou reservoir. Because of the operation of the Danjiangkou reservoir, the abundance of ammonia-oxidizing archaea in the water and sediments of downstream of the dam was reduced, and the abundance of methanogenic archaea in the sediments was relatively high. The relation between them was not obvious.

dam; ammonia-oxidizing archaea; methane-oxidizing archaea; high-throughput sequencing

10.13209/j.0479-8023.2020.034

國家自然科學(xué)基金(51539001)資助

2019–04–18;

2019–06–25