孫利林，李立郎，胡 萍*，田 亞，麻穎垚，袁再順

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽 550025；2.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實驗室，貴州貴陽 550014）

中國傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵白酒的釀造微生物包括大曲、酒醅、窖泥和釀酒環(huán)境等四大微生物菌群[1]。不同菌群微生物在釀酒過程中的活動影響白酒的品質(zhì)[2]。醬香型白酒在其獨(dú)特的釀造環(huán)境和工藝條件下，酒曲、酒醅、窖泥中形成了豐富的微生物資源[3]。這些微生物在醬香型白酒制曲和釀造過程中，扮演十分重要的角色，它不僅僅是釀酒原料的組成部分，還參與乙醇和香味物質(zhì)的形成[4]。

細(xì)菌是醬香型白酒釀造過程中重要的產(chǎn)香功能微生物，具有分泌代謝降解蛋白質(zhì)及淀粉的水解酶類，對酒體的風(fēng)味質(zhì)量有著極大的貢獻(xiàn)和關(guān)鍵調(diào)控作用[5]。高溫大曲中，細(xì)菌占絕對優(yōu)勢，有90%以上的數(shù)量，以獲得所需香味物質(zhì)[6-8]。堆積發(fā)酵又稱“二次制曲”，是網(wǎng)羅堆積場地和空氣中的微生物進(jìn)行堆積發(fā)酵，并生成多種酶類和多種酶類的相互作用下合成酒體的前驅(qū)物質(zhì)及香味物質(zhì)，為入窖發(fā)酵創(chuàng)造必要的條件，對醬香型白酒優(yōu)良酒質(zhì)的形成起著關(guān)鍵性作用[9-12]。細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物在高溫操作過程中強(qiáng)化了酒醅自身形成醬香的原動力，促進(jìn)了醬香物質(zhì)的進(jìn)一步生成，研究最多的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）被認(rèn)為是利用糖類和氨基酸促成“美拉德反應(yīng)”而大量產(chǎn)生呈香物質(zhì)的[13-14]。窖內(nèi)發(fā)酵是堆積發(fā)酵的延續(xù)，將前者的代謝產(chǎn)物進(jìn)行積累，利用窖產(chǎn)酸細(xì)菌（乳酸菌、醋酸菌等）成為主力，產(chǎn)酒精和二氧化碳的同時，也是酸類、酯類物質(zhì)（乳酸、乙酸、乳酸乙酯、乙酸乙酯等）形成的基礎(chǔ)[15]。石窖泥是醬香型白酒的特色發(fā)酵容器，窖泥中包含了大量的微生物，絕大部分為厭氧菌如厭氧菌乳桿菌科（Lactobacillaceae）、梭菌科（Clostridiaceae）等[16]可以為釀酒提供豐富的風(fēng)味物質(zhì)（如丁酸、己酸和己酸乙酯等），窖泥對白酒中微量香味成分的形成及其量比關(guān)系的協(xié)調(diào)起著重要的作用，極大地影響著白酒釀造的品質(zhì)[17]。

本研究采用高通量測序技術(shù)，利用Illumina公司Miseq測序平臺對醬香型白酒第四輪次酒釀造過程中高溫大曲、酒醅（堆積酒醅、窖內(nèi)酒醅）以及窖泥進(jìn)行研究，分析細(xì)菌微生物多樣性，群落結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、菌群組成的差異性以及各釀造階段的主要優(yōu)勢菌群動態(tài)變化規(guī)律，為優(yōu)化利用釀酒微生物和生產(chǎn)質(zhì)量控制提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

酒曲、酒醅（堆積酒醅、窖內(nèi)酒醅）、窖泥樣品：采自貴州省仁懷市茅臺鎮(zhèn)H酒廠和J酒廠，酒醅采樣輪次為第四輪次。酒曲的采樣方式：以曲塊對角線的中點(diǎn)作為中心抽樣點(diǎn)，再于對角線上選擇四個與中心樣點(diǎn)距離相等的點(diǎn)作為取樣點(diǎn)，將每次取樣點(diǎn)樣品直接混勻后裝于采樣袋，置于-80 ℃冰箱中備用。酒醅（堆積酒醅、窖內(nèi)酒醅）采樣方式：每層中心和四角收集，每100 g混合樣品裝于采樣袋，置于-80 ℃冰箱中備用。窖泥采樣方式：從窖池池壁中線位置距池底10 cm處的3個點(diǎn)及池底中心部位分別取10 g窖底泥，混合均勻后裝于采樣袋，置于-80 ℃冰箱中備用。共采集10個樣品，具體樣品采集信息見表1。

表1 樣品采集信息表Table 1 Sample collection information

1.1.2 試劑

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：美國OMGEA公司；AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒：美國AXYGEN公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ABIGeneAmpR9700型聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；Illumina Miseq測序平臺：上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司；QuantiFlourTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)：美國Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品DNA提取及MiSeq測序分析

1.3.2 高通量測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

測序得到的序列信息，首先根據(jù)雙端序列數(shù)據(jù)之間的對應(yīng)關(guān)系，將成對的數(shù)據(jù)拼接成一條序列，同時對其質(zhì)量和拼接效果進(jìn)行質(zhì)控過濾，根據(jù)序列首尾兩端的序列和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列，并校正序列方向。之后利用不同軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析：通過USEARCH[19]將標(biāo)簽分組成具有97%相似性的操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）?；赟ilva庫對97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)注釋分析、利用QIIME[20]等軟件對樣本進(jìn)行Alpha和Beta多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 醬香型白酒釀造過程中的細(xì)菌多樣性分析

2.1.1 Shannon-Wiener曲線分析

Shannon-Wiener[21]是反映樣本中微生物多樣性的指數(shù)，利用各樣本的測序量在不同測序深度時的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線，以此反映各樣本在不同測序數(shù)量時的微生物多樣性。當(dāng)曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物信息。10個樣品細(xì)菌的Shannon-Wiener曲線見圖1。

圖1 10個樣品細(xì)菌Shannon-Wiener曲線Fig.1 Shannon-Wiener curve of bacteria in ten samples

由圖1可知，10個樣品細(xì)菌的Shannon-Wiener曲線都趨向平坦，說明測序的數(shù)據(jù)量足夠大，對酒醅中微生物多樣性分析基本覆蓋酒醅中細(xì)菌的種類。

2.1.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

基于門（phylum）水平上的樣品群落結(jié)構(gòu)見圖2。

圖2 基于門水平的樣品菌落組成Fig.2 Microbial community composition of samples based on phylum level

結(jié)合圖2在門（phylum）水平上分析樣品群落結(jié)構(gòu)組成可知，在門的水平上10個樣品共檢測到16種類群，其中最重要的細(xì)菌是厚壁菌門（Firmicutes），在10個樣品間的平均占有百分比達(dá)35.1%，平均占有比例最高，其次是變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）等。

基于屬（genus）水平上的樣品群落結(jié)構(gòu)見圖3。

圖3 基于屬水平的樣品菌落組成Fig.3 Microbial community composition of samples based on genus level

由圖3可知，在10個樣品中主要存在34個細(xì)菌菌屬，在酒曲中主要是未定義微生物菌群、芽孢桿菌科的未定義菌屬、海洋芽胞桿菌屬（Oceanobacillus）和芽孢桿菌目的其他菌群、堆積發(fā)酵中主要優(yōu)勢菌有未定義微生物菌群、芽孢桿菌科的未定義菌屬、變形菌綱的未定義菌屬、乳桿菌屬（Lactobacillus）和金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和普氏菌屬（Prevotella）；在窖內(nèi)發(fā)酵中乳桿菌屬（Lactobacillus）占絕對優(yōu)勢；窖泥中主要優(yōu)勢菌有未定義微生物菌群、放線菌（Actinomyces）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和醋菌屬（Acetobacter）。

2.1.3 多樣本聚類樹

基于樣本OTU即操作分類單元種類數(shù)計算樣本間的weighted unifrac距離矩陣，綜合考量序列數(shù)據(jù)、序列同源性、微生物構(gòu)成的豐度等對各個樣本進(jìn)行聚類。聚類樹枝間的距離反應(yīng)了各樣品間的微生物組成間的親緣關(guān)系。樣本相似度分析結(jié)果見圖4。由圖4可知，樣品A1和C1歸屬到了一起，說明了不同酒廠A1和C1的細(xì)菌組成親緣關(guān)系較近，說明不同酒廠間的成品曲細(xì)菌群組成相似，這可能是各酒廠之間制曲配方及工藝的相似所致。

圖4 樣本相似度分析樹狀圖Fig.4 Dendrogram of sample similarity

樣品A2和B2歸屬到了一起，但與樣品C2相隔一定距離。說明同一酒廠不論是新車間還是老車間它們堆積發(fā)酵酒醅的細(xì)菌組成親緣關(guān)系很接近，而不同酒廠堆積發(fā)酵酒醅細(xì)菌組成親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。不同酒廠雖然都在茅臺鎮(zhèn)赤水河邊，但酒廠間地理位置有差異，發(fā)酵車間環(huán)境微生物以及來自大曲的微生物親緣關(guān)系有較大差異。同時也說明了堆積發(fā)酵與發(fā)酵車間環(huán)境關(guān)聯(lián)度較高，發(fā)酵環(huán)境微生物的多樣性影響著堆積酒醅的微生物多樣性。

樣品A3、B3、C3都?xì)w屬到了一起，說明不同酒廠以及同一酒廠新老車間窖內(nèi)酒醅細(xì)菌群組成相似，其中樣品A3和C3親緣關(guān)系相對較近。依據(jù)聚類樹枝最先分枝最進(jìn)化的原理，從圖4亦可知，樣品B3中的微生物進(jìn)化優(yōu)先于A3和C3中的微生物，說明在窖內(nèi)釀造環(huán)境中，老窖池的微生物優(yōu)勢菌群最突出。樣品A4和C4沒有歸于同一歸屬并且與酒醅相距較遠(yuǎn)，說明不同酒廠窖泥相互之間細(xì)菌菌相組成差別較大，這可能是窖泥的來源不同所致。

2.2 釀酒過程優(yōu)勢細(xì)菌群落動態(tài)變化分析

2.2.1 酒曲細(xì)菌多樣性分析

由圖5可知，H酒廠和J酒廠成品酒曲主要優(yōu)勢菌群組成相似，但細(xì)菌主要優(yōu)勢菌群的豐度存在明顯差異。未定義微生物菌群、芽孢桿菌科（Bacillaceae）、海洋芽胞桿菌屬（Oceanobacillus）和芽孢桿菌目的其他菌群是H酒廠和J酒廠的成品曲中主要的優(yōu)勢菌群，在樣品A1和C1中占有豐度分別是35.06%和20.86%，19.14%和13.56%，11.13%和15.28%，8.53%和11.12%。說明芽胞桿菌是高溫大曲中的主要微生物菌群。芽孢桿菌具有耐高溫的特性，能夠分泌蛋白酶、淀粉酶等水解原料，產(chǎn)生發(fā)酵性糖和氨基酸，為發(fā)酵釀酒過程中美拉德反應(yīng)初期階段生成阿馬多利化合物提供大量原料。

圖5 不同車間不同酒廠酒曲樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)餅狀圖Fig.5 Pie chart of bacterial community structure of different distilleries samples in different workshops

2.2.2 堆積酒醅細(xì)菌多樣性分析

堆積發(fā)酵是將淀粉糖化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，這時需要更多的微生物代謝產(chǎn)生大量的水解酶類。由于高溫堆積階段要求溫度達(dá)50 ℃左右[25]，所以耐熱微生物成為了優(yōu)勢菌群。堆積處于開放式的好氧、兼氧環(huán)境條件下，再次網(wǎng)羅空氣中有益微生物，進(jìn)一步為產(chǎn)生醬香物質(zhì)和積累醬香前體物質(zhì)創(chuàng)造條件，它是生成醬香物質(zhì)的接力站，直接關(guān)系到產(chǎn)品的風(fēng)格質(zhì)量。

結(jié)合圖6對比分析可得，A2中共發(fā)現(xiàn)450個菌屬，在0.1%以上的菌屬111個，其中樣品A2中的優(yōu)勢微生物菌群為：未定義微生物菌群27.24%、芽孢桿菌科的未定義菌屬5.03%、變形菌綱的未定義菌屬4.74%、海洋芽胞桿菌屬（Oceanobacillus）3.82%、芽孢桿菌目的其他菌群3.01%、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）2.80%、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）2.48%、乳桿菌屬（Lactobacillus）1.61%、魏斯氏菌屬（Weissella）1.18%、普氏菌屬（Prevotella）1.15%、地桿菌屬（Pedobacter）1.05%等。

樣品B2中共發(fā)現(xiàn)404個菌屬，在0.1%以上的菌屬93個，仍以未定義微生物菌群27.24%、乳桿菌屬（Lactobacillus）13.22%、芽孢桿菌科的未定義菌屬5.03%、γ-變形菌綱的未定義菌屬4.74%、海洋芽胞桿菌屬（Oceanobacillus）3.82%、芽孢桿菌目的其他菌群3.01%、普氏菌屬（Prevotella）1.15%為主要優(yōu)勢菌群。樣品A2和B2相比主要優(yōu)勢菌群組成相似，但豐度差異較大，這說明堆積發(fā)酵與發(fā)酵車間環(huán)境有關(guān)，同一酒廠，同樣的制酒工藝和酒曲，發(fā)酵車間使用年限長的比新車間微生物多樣性降低，但優(yōu)勢菌群越突出。

J酒廠的堆積酒醅C2中共發(fā)現(xiàn)437個菌屬，在0.1%以上的菌屬有108個。其中未定義微生物菌群27.24%、γ-變形菌綱的未定義菌屬4.74%、芽孢桿菌科的未定義菌屬5.03%、海洋芽胞桿菌屬（Oceanobacillus）3.82%等為主要優(yōu)勢菌屬。樣品A2與C2相比主要優(yōu)勢菌群組成相似，但豐度和占比有較大差異。這說明不同的酒廠發(fā)酵車間之間環(huán)境微生物多樣性的差異影響著堆積酒醅的微生物多樣性。另外，不同酒廠的發(fā)酵工藝雖然相似，但發(fā)酵物料物態(tài)、其工藝參數(shù)及地理位置也會造成優(yōu)勢菌群差異。

2.2.3 窖內(nèi)酒醅細(xì)菌多樣性分析

樣品A3中共發(fā)現(xiàn)400個菌屬，在0.1%以上的菌屬有77個，樣品B3中共發(fā)現(xiàn)292個菌屬，在0.1%以上的菌屬有31個，樣品C3中共發(fā)現(xiàn)404個菌屬，在0.1%以上的菌屬有83個。結(jié)合圖7對比分析可知，3種窖內(nèi)酒醅細(xì)菌菌群多樣性均較高，主要優(yōu)勢細(xì)菌群組成相似結(jié)構(gòu)相似，但豐度差異較大。乳桿菌屬（Lactobacillus）在窖內(nèi)發(fā)酵中占絕對優(yōu)勢，在樣品A3、B3和C3中占有豐度分別達(dá)到40.37%、74.00%和32.03%。窖內(nèi)發(fā)酵過程中是處于高溫厭氧環(huán)境，乳酸菌的乳桿菌屬是醬香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程中最常見的重要微生物菌群。乳桿菌屬（Lactobacillus）的作用是通過代謝產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸。酸類也是主體呈味物質(zhì)，起緩沖協(xié)調(diào)作用，是決定酒的香型、風(fēng)格的基礎(chǔ)要素之一。與樣品B3相比，樣品A3的細(xì)菌多樣性較高，但樣品B3的優(yōu)勢菌群更突出。說明同一酒廠，同樣的制酒工藝和酒曲，不同使用年齡的車間和窖齡的微生物多樣性的差異影響著窖內(nèi)發(fā)酵酒醅細(xì)菌多樣性。老窖池中細(xì)菌菌落多樣性同樣較高，并且主要優(yōu)勢細(xì)菌的種類和豐度與堆積發(fā)酵酒醅相關(guān)度高。這說明使用時間長的車間和窖池其環(huán)境微生物種群結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，優(yōu)勢菌群更突出。樣品C3與A3相比，主要優(yōu)勢菌群相似，但豐度存在明顯差異。說明不同的酒廠發(fā)酵車間使用年限和窖齡影響著窖內(nèi)酒醅的微生物多樣性。

圖7 不同車間不同酒廠窖內(nèi)酒醅細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)餅狀圖Fig.7 Pie chart of bacterial community structure of the fermented grain in pit of different distilleries in different workshops

2.2.4 窖泥細(xì)菌多樣性分析

樣品A4中共發(fā)現(xiàn)525個菌屬，在0.1%以上的菌屬有143個，C4樣品中共發(fā)現(xiàn)482個菌屬，在0.1%以上的菌屬有114個。

圖8 不同酒廠窖泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)餅狀圖Fig.8 Pie chart of bacterial community structure in pit mud in different distilleries

由圖8可知，不同酒廠使用的窖泥中細(xì)菌組成差異明顯。A4中的主要優(yōu)勢菌群是放線菌（Actinomyces）1.79%、乳桿菌屬（Lactobacillus）1.70%。C4的主要優(yōu)勢菌群是醋桿菌屬（Acetobacter）14.98%、乳桿菌屬（Lactobacillus）2.35%，與樣品A4對比主要優(yōu)勢菌群存在明顯差異。這可能與不同酒廠的窖泥來源和使用時間、使用方法不同有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究應(yīng)用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)，探究醬香型白酒第四輪次酒釀造過程中細(xì)菌多樣性，闡明第四輪次酒釀造過程中優(yōu)勢細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)及其隨釀造工藝動態(tài)變化。結(jié)果表明，醬香型白酒的高溫大曲、堆積發(fā)酵和窖池發(fā)酵的細(xì)菌資源豐富且主要優(yōu)勢菌群存在動態(tài)變化。在酒曲中主要優(yōu)勢菌有：芽孢桿菌科的未定義菌屬、海洋芽胞桿菌屬（Oceanobacillus）；堆積發(fā)酵中主要優(yōu)勢菌有芽孢桿菌科的未定義菌屬、γ-變形菌綱的未定義菌屬；在窖內(nèi)發(fā)酵中乳桿菌屬（Lactobacillus）占絕對優(yōu)勢；窖泥中主要優(yōu)勢菌有放線菌（Actinomyces）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和醋桿菌屬（Acetobacter）。同一酒廠新老車間酒曲、堆積發(fā)酵、窖內(nèi)發(fā)酵、窖泥之間細(xì)菌組成相似度較高，不同酒廠酒曲、堆積發(fā)酵、窖內(nèi)發(fā)酵、窖泥之間細(xì)菌組成相似度亦較高，但其優(yōu)勢菌群豐度差異顯著。發(fā)酵車間使用年限及窖齡影響著微生物多樣性；時間長的車間和窖池其環(huán)境微生物種群結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，優(yōu)勢菌群更突出。