文 章，程 鵬，陳 才，劉緒興，馮 潛，楊生智，陳 杰*

（1.宜賓六尺巷酒業(yè)有限公司，四川宜賓 644000；2.勁牌有限公司，湖北黃石 435000）

中國(guó)白酒是世界六大蒸餾酒之一，是我國(guó)特有的一種經(jīng)固態(tài)發(fā)酵而得的蒸餾酒，其獨(dú)特的生產(chǎn)工藝造就了別具一格的產(chǎn)品風(fēng)格[1]。大曲作為白酒固態(tài)釀造的糖化劑、發(fā)酵劑以及生香劑，是白酒固態(tài)釀造的物質(zhì)基礎(chǔ)。大曲按照其生產(chǎn)產(chǎn)品的特點(diǎn)，分為濃香大曲、清香大曲、醬香大曲、兼香大曲等。傳統(tǒng)白酒大曲中主要有三系（物系、菌系和酶系），其中菌系主要由細(xì)菌、霉菌、酵母以及放線菌等微生物組成。大曲中微生物主要來(lái)源于生產(chǎn)環(huán)境，包括空氣、制曲用水、原料、器具以及曲房環(huán)境等。傳統(tǒng)制曲的實(shí)質(zhì)是與釀酒相關(guān)微生物的擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程，即將來(lái)源于環(huán)境中的野生菌種進(jìn)行自然培養(yǎng)，并通過(guò)翻曲和通風(fēng)排潮等人為干預(yù)的方式，淘汰雜菌選育出有益菌種的過(guò)程。由于試驗(yàn)方法和條件的落后及局限，初期對(duì)大曲中各種微生物的功能及群落結(jié)構(gòu)多樣性研究時(shí)主要采用傳統(tǒng)可培養(yǎng)技術(shù)。近年來(lái)，隨著具有高可信度、高分辨力及快速靈敏等優(yōu)點(diǎn)的現(xiàn)代分子生物學(xué)方法在研究微生物群落結(jié)構(gòu)上的快速發(fā)展[2]，給傳統(tǒng)的微生物可培養(yǎng)技術(shù)及微生物分類鑒定等方面帶來(lái)了巨大的革新，對(duì)傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法的缺陷起到了一定的彌補(bǔ)作用[3]，因此現(xiàn)代分子生物學(xué)方法逐漸被引入到大曲微生物的研究當(dāng)中。

雖然真菌在大曲發(fā)酵體系中具有極其重要的作用，但是相對(duì)于細(xì)菌的研究，對(duì)于真菌的研究就相對(duì)較少?；诖?，該文主要闡述大曲中真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的研究技術(shù)以及研究進(jìn)展，以期為研究大曲發(fā)酵過(guò)程中真菌多樣性構(gòu)成及變化規(guī)律，解析各種真菌的功能及相互作用，提高大曲質(zhì)量以及形成對(duì)傳統(tǒng)大曲固態(tài)發(fā)酵機(jī)理的最新認(rèn)識(shí)奠定理論基礎(chǔ)。

1 微生物群落多樣性研究技術(shù)

21世紀(jì)以來(lái)，微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性研究已經(jīng)成為微生物生態(tài)學(xué)以及環(huán)境科學(xué)的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)[4]，全面剖析目標(biāo)樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性，為揭示微生物具體代謝功能、控制和優(yōu)化群落結(jié)構(gòu)、強(qiáng)化目標(biāo)微生物的代謝功能等提供理論依據(jù)[5-6]。微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性解析技術(shù)的發(fā)展主要經(jīng)歷了傳統(tǒng)可培養(yǎng)技術(shù)、生理學(xué)指紋法及生物標(biāo)記物方法、結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)的傳統(tǒng)分子生態(tài)學(xué)技術(shù)、高通量測(cè)序技術(shù)等四個(gè)階段。隨著微生物生態(tài)學(xué)的發(fā)展及研究技術(shù)的不斷升級(jí)，中國(guó)白酒釀造微生物的群落多樣性的研究手段也由傳統(tǒng)可培養(yǎng)技術(shù)逐漸升級(jí)為下一代測(cè)序技術(shù)。

1.1 傳統(tǒng)可培養(yǎng)技術(shù)

可培養(yǎng)分離技術(shù)是最早應(yīng)用于研究微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的重要手段[4]。該技術(shù)是將樣品或樣品稀釋液接種于固體培養(yǎng)基中，在一定條件下培養(yǎng)后對(duì)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并通過(guò)其菌落形態(tài)、微觀結(jié)構(gòu)以及生理生化等特性進(jìn)行微生物種屬鑒定。由于該方法忽略了來(lái)源環(huán)境或發(fā)酵體系中的養(yǎng)分與人工培養(yǎng)基的差異以及不同微生物之間的相互作用，這就直接導(dǎo)致樣品中許多可培養(yǎng)微生物的種類和數(shù)量大大減少。AMANN R I等[7]研究指出，自然環(huán)境中的微生物僅10%能夠被人工培養(yǎng)分離，同時(shí)傳統(tǒng)可培養(yǎng)技術(shù)操作繁瑣、準(zhǔn)確性較差，不能滿足監(jiān)測(cè)群落結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化的需求。因此，傳統(tǒng)可培養(yǎng)技術(shù)在微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性研究中使用得越來(lái)越少[8]。

盡管傳統(tǒng)可培養(yǎng)技術(shù)具有上述不可避免的局限性，但是該技術(shù)到現(xiàn)在仍在被廣泛使用，原因之一便是能夠得到從樣品中得到活菌，便于后續(xù)研究。研究人員通過(guò)可培養(yǎng)方法逐步揭示了大曲中微生物優(yōu)勢(shì)菌群的種屬分布，在一定程度上促進(jìn)了制曲技術(shù)的快速發(fā)展[9]。傳統(tǒng)微生物分類鑒定方法（可培養(yǎng)技術(shù)）應(yīng)用于研究大曲（清香型、濃香型和醬香型）中真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的情況見(jiàn)表1。

表1 可培養(yǎng)技術(shù)在大曲真菌研究中的應(yīng)用情況Table 1 Application of culture-dependent technology in fungi study of Daqu

1.2 現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)

1.2.1 磷脂脂肪酸技術(shù)

磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）指紋圖譜技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于研究復(fù)雜體系的微生物群落及動(dòng)態(tài)變化規(guī)律[2]。PLFA是除古生菌以外其他所有微生物活細(xì)胞細(xì)胞膜的主要成分，并且環(huán)境中PLFA含量與目標(biāo)環(huán)境中活性微生物生物量具有很好的相關(guān)性[18]。由于不同微生物種屬的PFLA結(jié)構(gòu)及種類存在一定差異，因此可以作為微生物標(biāo)記物，用于研究微生物的群落結(jié)構(gòu)，同時(shí)該技術(shù)也用于微生物菌株的輔助鑒定[19]。

PLFA指紋圖譜技術(shù)應(yīng)用于研究大曲（清香型、濃香型和醬香型）中真菌群落和多樣性的具體情況見(jiàn)表2。

表2 磷脂脂肪酸技術(shù)在大曲真菌研究中的應(yīng)用情況Table 2 Application of phospholipid fatty acid technology in fungi study of Daqu

1.2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳

表3 PCR-變性梯度凝膠電泳技術(shù)在大曲真菌研究中應(yīng)用情況Table 3 Application of PCR-denaturing gradient gel electrophoresis technology in fungi study of Daqu

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)是一種經(jīng)典的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）指紋圖譜技術(shù)，是用于研究環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)的重要手段[19]。通過(guò)比較DNA指紋圖譜中的條帶（數(shù)目及亮度）能夠剖析樣品中微生物的群落組成以及多樣性，若對(duì)圖譜中的條帶進(jìn)行測(cè)序分析就能進(jìn)一步獲得樣品中微生物的系統(tǒng)發(fā)育地位[27]。PCR-DGGE技術(shù)已經(jīng)廣泛用于環(huán)境及發(fā)酵體系中微生物群落組成、多樣性及動(dòng)態(tài)變化的研究。與其他方法相比，PCR-DGGE是目前國(guó)內(nèi)用于白酒釀造環(huán)境中微生物群落組成及多樣性研究的最常用手段。PCR-DGGE技術(shù)應(yīng)用于大曲真菌群落和多樣性研究情況見(jiàn)表3。

1.2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)（polymerase chain reaction-single chain conformation polymorphism technique，PCR-SSCP）技術(shù)與PCR-DGGE技術(shù)相似，但是原理有明顯的差異。SSCP技術(shù)是根據(jù)各類堿基組成的單鏈DNA形成的不同三維構(gòu)象進(jìn)行區(qū)分，當(dāng)不同三維構(gòu)象的單鏈DNA分子在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）中因遷移率不同而形成將DNA條帶進(jìn)行分離，從而將長(zhǎng)度相同但DNA序列不同的片段分離開(kāi)來(lái)[2]。由于樣品中不同微生物種屬的rDNA基因序列堿基組成存在差異，通過(guò)對(duì)PAGE上各DNA條帶測(cè)序后進(jìn)行分析，就能進(jìn)行樣品中微生物系統(tǒng)發(fā)育的研究[19]。因此，該方法也常用于大曲樣品中微生物群落多樣性的剖析。PCR-SSCP技術(shù)應(yīng)用于大曲真菌群落和多樣性研究情況見(jiàn)表4。

表4 PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)在大曲真菌研究中應(yīng)用情況Table 4 Application of PCR-single-strand conformation polymorphism technology in fungi study of Daqu

1.2.4 基因文庫(kù)

基因克隆文庫(kù)技術(shù)可剖析目標(biāo)樣品中各類微生物的種類及對(duì)應(yīng)比例，通過(guò)該技術(shù)能夠檢測(cè)出不能人工分離培養(yǎng)的微生物。通過(guò)建立目標(biāo)樣品中微生物的基因文庫(kù)，再測(cè)定文庫(kù)中的基因序列，從而可以得到樣品中所含微生物基因的種類和相對(duì)數(shù)量[2]。目前基因克隆文庫(kù)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物學(xué)及生態(tài)學(xué)的相關(guān)研究，其中最為常用的是核糖體RNA基因克隆文庫(kù)的構(gòu)建，包括細(xì)菌16SrDNA基因克隆文庫(kù)、真菌18S rDNA基因克隆文庫(kù)以及真菌ITS基因克隆文庫(kù)[2]?；蚩寺∥膸?kù)技術(shù)能準(zhǔn)確獲得目標(biāo)樣品中微生物的基因序列信息，從而可以檢測(cè)出樣品中微生物群落中的優(yōu)勢(shì)菌群。該技術(shù)已廣泛應(yīng)用多種環(huán)境及發(fā)酵體系中微生物群落組成、多樣性和動(dòng)態(tài)變化規(guī)律及平行樣品間微生物群落差異性比價(jià)研究。基因克隆文庫(kù)技術(shù)應(yīng)用于大曲真菌群落和多樣性研究情況見(jiàn)表5。

表5 基因克隆文庫(kù)技術(shù)在大曲真菌研究中應(yīng)用情況Table 5 Application of gene clone library technology in fungi study of Daqu

1.2.5 高通量測(cè)序技術(shù)

高通量測(cè)序（high-throughput sequencing，HTS）技術(shù)，又稱為“下一代”測(cè)序（next-generation sequencing technology，NGS）技術(shù)，是新一代的基因測(cè)序技術(shù)。該技術(shù)一次最多能并行測(cè)定幾百萬(wàn)條DNA分子序列，并且讀長(zhǎng)較短，能夠深入、細(xì)致、全貌的分析一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組。目前常用的二代測(cè)序平臺(tái)主要有Solexa、SOLiD和454等3種平臺(tái)。由于高通量測(cè)序的各種優(yōu)點(diǎn)，其越來(lái)越多的被用于研究大曲、窖泥中微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性。高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于大曲真菌群落和多樣性研究情況見(jiàn)表6。

表6 高通量測(cè)序技術(shù)技術(shù)在大曲真菌研究中應(yīng)用情況Table 6 Application of high-throughput sequencing technology in fungi study of Daqu

續(xù)表

1.2.6 組學(xué)技術(shù)

組學(xué)（Omics）是一項(xiàng)具有廣闊應(yīng)用前景的新興技術(shù)，按照分析目標(biāo)不同分為基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等[54]。目前應(yīng)用于復(fù)雜環(huán)境中微生物多樣性研究較多且較為成熟的技術(shù)是宏基因組學(xué)技術(shù)。它是HANDELSMAN J等[55]于1998年首次提出，將宏基因組定義為環(huán)境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和[56]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，宏基因組學(xué)被廣泛應(yīng)用于自然環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)（如水、空氣、土壤、海洋等）、發(fā)酵食品微生物群落結(jié)構(gòu)（奶酪、漿水菜、普洱茶、泡菜等）以及腸道微生物群落結(jié)構(gòu)（人體及其他動(dòng)物）的研究。宏基因組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于食品微生物群落和多樣性研究情況見(jiàn)表7。

表7 宏基因組學(xué)技術(shù)在發(fā)酵食品微生物多樣性研究中的應(yīng)用Table 7 Application of metagenomic technology in microbial diversity study of fermented food

目前，宏基因組學(xué)在大曲微生物的研究中應(yīng)用較少，在此簡(jiǎn)要介紹了近年來(lái)宏基因組學(xué)技術(shù)在一些發(fā)酵食品中的應(yīng)用情況，以期為利用宏基因組學(xué)分析大曲微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性以及發(fā)現(xiàn)性新的功能基因提供一定的參考依據(jù)。

1.2.7 微生物群落多樣性的研究手段優(yōu)缺點(diǎn)比較

隨著各種微生物分離技術(shù)的不斷發(fā)展和進(jìn)步，能被分離出來(lái)的微生物越來(lái)越多，但在實(shí)驗(yàn)室條件下分離出來(lái)的微生物種類仍不足環(huán)境微生物的10%[7]。同時(shí)，雖然各種微生物群落和多樣性的研究方法也在不斷發(fā)展，但是每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，因此對(duì)微生物群落和多樣性的研究不能局限某一研究方法上，必須結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)的各種方法，包括傳統(tǒng)可培養(yǎng)分離技術(shù)，這樣才能對(duì)可培養(yǎng)微生物和非可培養(yǎng)微生物有一個(gè)系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)。各種微生物群落和多樣性研究方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較見(jiàn)表8。

表8 微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性研究方法的比較Table 8 Comparison of research technology on microbial community structure diversity

2 大曲中真菌多樣性

大曲中的主要微生物種類是霉菌、酵母菌、細(xì)菌和放線菌四大類。大曲發(fā)酵體系中的微生物菌系不斷發(fā)生著復(fù)雜的動(dòng)態(tài)變化，其中霉菌是豐度最高的微生物類群，其次是酵母和細(xì)菌[17]。大曲中霉菌的特殊作用（如為釀造提供糖化力、液化力、蛋白質(zhì)分解能力以及多種有機(jī)酸等物質(zhì)）決定著大曲各方面的質(zhì)量特性，霉菌菌群的功能分化，對(duì)大曲的質(zhì)量起著關(guān)鍵的作用[69]。酵母菌為大曲提供發(fā)酵力，作為大曲微生物區(qū)系中最重要的類群之一，不僅主導(dǎo)了酒精的產(chǎn)生，而且大量產(chǎn)生酯類、醇類、酮類、烯類、酚類等揮發(fā)性化合物，對(duì)大曲和大曲酒的品質(zhì)有著決定性的影響[70]。

不同類型大曲中分離出的霉菌和酵母菌種類見(jiàn)表9。從表9中可知，各類大曲中霉菌和酵母菌多樣性差異較大，且濃香型大曲＞清香大曲＞醬香大曲，同時(shí)大曲中霉菌多樣性少于酵母菌[58]。各類大曲中均有的真菌主要有根霉屬、曲霉屬、毛霉屬、橫梗霉屬、嗜熱真菌屬以及對(duì)大曲及大曲酒釀造有害的青霉屬等；三類大曲中共同的酵母菌主要有酵母屬、畢赤酵母屬、假絲酵母屬、漢遜酵母屬、復(fù)膜孢酵母屬、伊薩酵母屬等。

表9 不同類型大曲中霉菌和酵母菌對(duì)比Table 9 Comparison of mold and yeast in different types of Daqu

3 展望

近年來(lái)，隨著各種現(xiàn)代分子生物學(xué)新技術(shù)的不斷完善與發(fā)展，對(duì)大曲中真菌群落結(jié)構(gòu)的研究不再受傳統(tǒng)微生物純培養(yǎng)技術(shù)的限制，同時(shí)使用這些新興的高新技術(shù)可以從不同的維度來(lái)研究大曲中真菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性，為大曲中真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性解析奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。需要特別指出的是，由于各種方法均具有一定的局限性，因此為了獲得更為全面地解析大曲中真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的信息，在研究過(guò)程中應(yīng)當(dāng)根據(jù)研究目的，選擇合適的一種或多種方法結(jié)合起來(lái)使用，形成優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，才能更有效地挖掘和利用大曲中真菌多樣性信息。目前對(duì)于大曲中真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的研究是多方面的，通過(guò)對(duì)其多樣性的研究必能為大曲質(zhì)量以及曲酒質(zhì)量的提升提供理論基礎(chǔ)。