張敏倩，劉功良*，費(fèi)永濤，白衛(wèi)東，艾連中，俞劍燊

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州 510225；2.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；3.上海金楓酒業(yè)股份有限公司，上海 200120）

白酒的香氣特征和口感是由酒體中的醇類、酯類和酸類等物質(zhì)所決定。其中醇類中的雜醇油在適量的情況下會(huì)使酒體更為和諧，但雜醇油含量過高不僅會(huì)破壞酒體風(fēng)格，還會(huì)引起飲后“上頭”等不適現(xiàn)象。雜醇油的含量對(duì)白酒風(fēng)味的影響至關(guān)重要。

目前，雜醇油的形成機(jī)制可歸結(jié)為降解代謝機(jī)制和合成代謝機(jī)制，但雜醇油在白酒中的代謝機(jī)制仍未得到系統(tǒng)闡述，調(diào)控雜醇油代謝的方法可分為兩大類：釀造工藝改進(jìn)；菌種選育及代謝調(diào)控。

因此，本文結(jié)合雜醇油的形成機(jī)理，對(duì)歷年來研究學(xué)者從白酒生產(chǎn)中的各階段對(duì)雜醇油的調(diào)控進(jìn)行歸類和總結(jié)，為白酒中雜醇油的有效控制提供新思路。

1 雜醇油的形成機(jī)制

雜醇油又稱高級(jí)醇，是指3個(gè)碳原子以上的一元醇類。正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇、活性戊醇、β-苯乙醇、辛醇、色醇和酪醇是白酒中的主要雜醇油[1-3]。研究表明，酵母雜醇油的代謝機(jī)制主要有降解代謝機(jī)制和合成代謝機(jī)制。

1.1 降解代謝機(jī)制（Ehrlich代謝機(jī)制）

Ehrlich代謝機(jī)制如下：

圖1 Ehrlich代謝機(jī)制Fig.1 Metabolic mechanism of Ehrlich

在酵母酒精發(fā)酵過程中，氨基酸在線粒體中受胞質(zhì)支鏈氨基酸轉(zhuǎn)移酶（branched-chain amino acid transferases，BCAATases）的作用將氨基轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的α-酮酸上；α-酮酸經(jīng)特定的酮酸脫羧酶催化后，脫羧形成相應(yīng)的醛[4]；醛再經(jīng)醇脫氫酶作用進(jìn)一步還原為相應(yīng)的高級(jí)醇[5]。研究表明，異丁醇、異戊醇、活性戊醇的降解產(chǎn)物分別是纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸，因此它們也被稱為支鏈醇[6]。氨基酸與相應(yīng)雜醇油的關(guān)系見表1。

表1 降解代謝機(jī)制中氨基酸的代謝產(chǎn)物Table 1 Metabolites of amino acids in metabolic mechanism of degradation

1.2 合成代謝機(jī)制（Harris代謝機(jī)制）

Harris代謝機(jī)制如下：

葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑（embden-meyerhof-parnaspathway，EMP）形成丙酮酸，在乙酰羥酸合酶的作用下進(jìn)入氨基酸的生物合成途徑形成α-酮酸中間體，進(jìn)一步在相應(yīng)的脫羧酶和脫氫酶的催化下發(fā)生還原反應(yīng)生成相應(yīng)的高級(jí)醇。其中，α-酮酸脫羧酶普遍存在于酵母、真菌但在細(xì)菌中并不常見[7]。

在傳統(tǒng)的白酒釀造過程中，雜醇油主要由釀酒酵母產(chǎn)生[8]。Ehrlich代謝機(jī)制和Harris代謝機(jī)制在酵母中參與雜醇油的合成存在一定比例，雜醇油中大部分低碳鏈醇是由酵母合成代謝機(jī)制生成的。據(jù)以往研究表明[9]高級(jí)醇中的低鏈醇如異戊醇、異丁醇和活性戊醇，75%由合成代謝途徑生成，25%來自降解代謝機(jī)制，這可能是由于Harris代謝機(jī)制中的中間體丙酮酸較易轉(zhuǎn)變?yōu)榈头肿拥摩?酮酸。若酒醪中的蛋白質(zhì)分解不足，導(dǎo)致氨基酸含量偏低，則會(huì)加速糖類合成高級(jí)醇。

圖2 Harris代謝機(jī)制Fig.2 Metabolic mechanism of Harris

2 白酒釀造過程中雜醇油的調(diào)控技術(shù)

2.1 通過優(yōu)化發(fā)酵工藝降低雜醇油

2.1.1 酒曲比例的優(yōu)化

酒曲被譽(yù)為“酒之骨”、“酒之魂”，其按制曲原料可分為麥曲和米曲。酒曲中的微生物一般包括霉菌、細(xì)菌和酵母菌；微生物在發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生的各類酶與微生物共存于酒曲原料中，形成了集糖化力、蛋白質(zhì)分解力和產(chǎn)酯力于一身的粗酶制劑[10]。因此不同酒曲間的差異不僅在微生物的菌落結(jié)構(gòu)，所含酶的種類與數(shù)量及其活力也不盡相同。雜醇油是各類酶作用下的產(chǎn)物。

羅惠波等[11]在濃香型白酒釀造過程中的拌曲階段分別梯度添加一定量的酵母、糖化酶、蛋白酶和α-淀粉酶，通過氣質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)酒醅中雜醇油的含量。結(jié)果表明，添加糖化酶和干酵母的樣品雜醇油產(chǎn)量較低；添加蛋白酶的樣品，其雜醇油的產(chǎn)量增加，而α-淀粉酶的添加對(duì)雜醇油產(chǎn)量沒有顯著影響。孫金旭等[12-13]研究了醬香型白酒發(fā)酵過程中酶對(duì)雜醇油含量的影響，結(jié)果表明，添加糖化酶的實(shí)驗(yàn)組雜醇油總量降低了48.28%，糖化酶的添加對(duì)控制醬香型白酒發(fā)酵產(chǎn)生雜醇油具有顯著效果。唐取來等[14-15]通過加入酶制劑或純種培養(yǎng)酵母協(xié)同酒曲發(fā)酵得到的米香型白酒經(jīng)工藝優(yōu)化，其總酯、酒精度均有提高，而加入酵母的白酒其雜醇油含量也有所下降。

因此，無論何種香型的白酒，添加至酒曲中酶的類型和含量對(duì)雜醇油有一定的影響，其中糖化酶用量的增加能有效降低雜醇油的生成量，這可能是由于糖化酶用量的增加，淀粉更快地轉(zhuǎn)化為還原糖，當(dāng)酵母量充足的情況下，會(huì)迅速消耗糖分，而對(duì)氨基酸的作用不充分，從而降低雜醇油的生成。

2.1.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

在白酒發(fā)酵過程中，雜醇油含量的高低與白酒的發(fā)酵條件息息相關(guān)。

在適當(dāng)濃度的同化氮源下，酵母會(huì)優(yōu)先利用氮源并生成氨基酸；在氨基酸含量充足的情況下，酵母通過降解代謝機(jī)制利用氨基酸合成雜醇油，與此同時(shí)，酵母通過合成代謝機(jī)制生成雜醇油的代謝通量會(huì)降低，綜合作用使得雜醇油的合成量降低。楊生智等[16]在小曲白酒拌曲階段添加不同氮源，對(duì)比五種同化氮源對(duì)雜醇油生成量的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，添加0.4%的碳酸氫銨能有效降低雜醇油的生成量。宋瑞濱等[17]以濃香型白酒作為研究對(duì)象，研究人工窖泥制作、用曲量、投料量、窖泥pH、不同發(fā)酵輪次、不同發(fā)酵周期等對(duì)正丁醇生成的影響，實(shí)驗(yàn)表明，窖泥配方不合理是造成正丁醇含量偏高的主要原因，同時(shí)加強(qiáng)窖池保養(yǎng)、適當(dāng)提高用曲量和降低投料量，能有效降低糟醅正丁醇的含量。黃婷等[18]考察酵母接種量、糖化時(shí)間、發(fā)酵液料比以及發(fā)酵溫度對(duì)米香型白酒的雜醇油含量和出酒率的影響，結(jié)果表明，合適的工藝條件能保證高出酒率的情況下同時(shí)降低米香型白酒中雜醇油的含量。HAN Q A等[19]在白酒發(fā)酵期間加入從蘋果皮中提取的粗酶液，結(jié)果表明，從富士蘋果中提取的粗酶液能降解醇類物質(zhì)（正己醇、正丙醇、異丁醇和異戊醇）效果最佳，對(duì)于降低白酒中的雜醇油有較好的效果。不同香型的白酒因其原料，酒曲以及發(fā)酵工藝的不同，導(dǎo)致整個(gè)微生物系統(tǒng)在發(fā)酵過程中也截然不同。因此，雜醇油的控制應(yīng)是考慮針對(duì)單一香型的白酒建立并優(yōu)化一套實(shí)用合理的發(fā)酵工藝。

2.1.3 蒸餾條件的優(yōu)化

蒸餾操作對(duì)于降低白酒中的雜醇油亦具有一定的效果?！捌^去尾”指掐去高酒精度的酒頭，去掉低酒精度的酒尾，這主要是由于雜醇油屬于一元醇類，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有的氫鍵導(dǎo)致雜醇油相比乙醇而言，其與水分子氫鍵締合強(qiáng)度更弱而在蒸酒過程中更易揮發(fā)，因此，掐去酒頭可以降低酒中雜醇油含量[20]。孫慧[21]認(rèn)為僅通過“掐頭去尾”的方式是無法一勞永逸地降低白酒中雜醇油的含量，截頭雖然可以降低雜醇油的含量，但酒頭中的總酯含量也高，尤其是呈香好，香味濃的乙酸乙酯，故“掐頭”這一蒸餾操作取決于蒸餾酒中雜醇油含量是否超標(biāo)。郭梅君等[22]利用慢速蒸餾結(jié)合精餾酒頭降低米酒雜醇油含量，研究數(shù)據(jù)表明，當(dāng)截取的酒頭比例為10%～30%，雜醇油的去除率達(dá)到23.5%～60.0%，同時(shí)保留了白酒原有風(fēng)格，使酒的香氣和口感大大提升。

有效的蒸餾裝備與優(yōu)化的蒸餾條件固然可降低雜醇油的含量，但各酒廠的實(shí)際情況不同，其中可能存在蒸餾裝置昂貴引起的投資成本大和風(fēng)險(xiǎn)高等問題，因此，可尋找合適的工藝方法，降低酒中雜醇油的含量。

2.2 通過篩選或改造微生物降低雜醇油

雜醇油是酵母發(fā)酵的副產(chǎn)物，其產(chǎn)量的多少最終取決于酵母代謝途徑。因此，可圍繞酵母菌種的選育開展研究，通過自然選育、菌種誘變或通過基因工程等方法獲取低產(chǎn)雜醇油的酵母菌株。

2.2.1 選育低產(chǎn)雜醇油的菌株

自然選育用于篩選低產(chǎn)雜醇油的酵母菌是最為傳統(tǒng)的育種方法。陳良強(qiáng)等[23]從醬香型白酒大曲和酒醅中獲得一株低產(chǎn)高級(jí)醇且高產(chǎn)乙醇的粟酒裂殖酵母，其異丁醇和異戊醇的產(chǎn)量?jī)H為其他粟酒裂殖酵母的51.0%和53.4%。梁璋成等[24]從福建紅曲中通過設(shè)計(jì)溫度梯度實(shí)驗(yàn)篩選低產(chǎn)雜醇油的酵母菌株JH301，在加入糖化酶和淀粉酶的無菌糯米培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，其雜醇油產(chǎn)量?jī)H為117.12 mg/L。衛(wèi)云路等[28]從酒曲中分離純化一株同時(shí)具備低產(chǎn)雜醇油和高產(chǎn)酒精能力的釀酒酵母，并將其添加至米曲中，結(jié)合發(fā)酵新工藝，雜醇油含量明顯下降。

利用微生物誘變育種選育低產(chǎn)雜醇油的菌株也是有效方法之一。朱莉娜等[25]通過微波誘變選育出低產(chǎn)雜醇油的啤酒酵母。王國正等[26]對(duì)低產(chǎn)雜醇油的酵母菌株CF4采用常溫常壓等離子體誘變方法，篩選一株雜醇油生成量降低了20%的酵母ARTP5。

張翠英等[27]將低產(chǎn)雜醇油釀酒酵母工程菌株加入到小曲酒的釀造中，以研究低產(chǎn)雜醇油的酵母菌對(duì)白酒發(fā)酵的影響，研究結(jié)果顯示，酵母AYΔBAT2的添加對(duì)于采用半固態(tài)發(fā)酵的小曲酒而言，正丙醇、異丁醇和異戊醇分別降低了20.6%、32.3%和50.8%，同時(shí)對(duì)小曲酒的酒精度、殘?zhí)?、總酸和總酯基本無影響。

使用低產(chǎn)雜醇油酵母，可減少白酒發(fā)酵過程中雜醇油的生成，但白酒是多種微生物混合發(fā)酵、共同作用下的產(chǎn)物。雜醇油的降低可能是一兩種醇類如異丁醇或異戊醇含量的降低，但其他雜醇油物質(zhì)的含量可能不變甚至增高。此外，部分細(xì)菌和真菌也能產(chǎn)生雜醇油，其代謝產(chǎn)物對(duì)改良的酵母菌株的影響機(jī)制尚不清楚，對(duì)于純種發(fā)酵的啤酒而言，選育低產(chǎn)雜醇油的菌株是高效的途徑；但對(duì)于混菌發(fā)酵的白酒而言，這未必是最有效的途徑。因此，研究白酒發(fā)酵過程中微生物菌群與雜醇油產(chǎn)量的關(guān)系更加意義重大。

2.2.2 基因工程誘變育種

由基因Bat1p和Bat2p催化的Ehrlich途徑的轉(zhuǎn)氨酶反應(yīng)是反應(yīng)中主要的限速步驟，編碼基因的缺失會(huì)影響雜醇油的形成[29-32]。ZHANG C Y等[33]以工業(yè)酵母菌株作為工程株，刪除其編碼BCAATases的基因BAT2，以減少黃酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的雜醇油，成功構(gòu)建了BAT2單基因缺失二倍體突變株，產(chǎn)生的雜醇油含量顯著減少，同時(shí)改造過的酵母菌株其生長和發(fā)酵性性能正常。

YOSHIMOTO H等[34]為了鑒定α-酮異辛酸酯脫羧生成異戊醇所涉及的酶和基因，對(duì)酶進(jìn)行了部分純化，并進(jìn)行了質(zhì)譜分析，遺傳分析表明，在PDC1缺失突變體中，α-酮異辛酸酯脫羧酶活性和異戊醇產(chǎn)量部分下降，而在攜帶PDC1基因的多拷貝質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移子中，α-酮異辛酸酯脫羧酶活性和異戊醇產(chǎn)量增加。這表明了釀酒酵母中的PDC1基因編碼的丙酮酸脫羧酶部分地參與了α-酮異辛酸酯脫羧酶的脫羧作用，若刪除該基因能降低酵母發(fā)酵中產(chǎn)生的異戊醇，但刪除該基因?qū)ζ渖L與發(fā)酵性能的影響尚未有學(xué)者研究。李維等[35-36]以釀酒酵母AY-15作為實(shí)驗(yàn)菌通過分子育種技術(shù)對(duì)其單倍體α-5進(jìn)行ATF1的過表達(dá)并使其缺失BAT2，單倍體重組后的雜交體經(jīng)同樣的培養(yǎng)條件，異戊醇和異丁醇的產(chǎn)量大幅下降。

DICKENSON J R等[37-39]報(bào)導(dǎo)的YDL080C基因編碼的類丙酮酸脫羧酶是α-酮基異己酸生成異戊醇的代謝途徑中的關(guān)鍵酶，敲除YDL080C基因可使異戊醇的生成量顯著降低。李童等[40]構(gòu)建YDL080C基因缺失工程菌產(chǎn)生的異戊醇含量與親本并無明顯差異，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與郝欣等[41]在釀酒酵母中的研究結(jié)果相同，說明類丙酮酸脫羧酶并非異戊醇的代謝途徑中的關(guān)鍵酶。

低產(chǎn)雜醇油基因工程菌的構(gòu)建及相關(guān)研究，采用的培養(yǎng)基不完全相同但風(fēng)味物質(zhì)的形成與培養(yǎng)基的成分密切相關(guān)[42-43]，因此，篩選低產(chǎn)雜醇油酵母的應(yīng)用存在一定局限性。

2.3 降低雜醇油的其他技術(shù)

新釀酒的合理貯存可降低酒體中雜醇油含量，一般包括吸附法，生物膜透析法，機(jī)械過濾，重新翻烤或勾兌等方法[44]。HSIEH C W等[45]采用納濾法和超濾法研究了白酒中雜醇油的去除效果，結(jié)果表明，納濾膜去除酒中雜醇油的效率高于超濾膜，可去除酒中44%的雜醇油。

2.4 白酒釀造微生物與雜醇油的關(guān)系

白酒的釀造體系是霉菌、酵母和細(xì)菌相互作用下所形成的穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)，其中霉菌在白酒釀造過程中主要起糖化作用，部分霉菌如根霉其細(xì)胞含有的酒化酶可同時(shí)進(jìn)行糖化和發(fā)酵，使得發(fā)酵速率提高導(dǎo)致小曲酒的出酒率上升，這對(duì)酒的風(fēng)味和品質(zhì)都具有重要的作用[46]。孫樂平等[47]經(jīng)關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，異戊醇的產(chǎn)生與嗜熱真菌屬（Thermomyces）呈負(fù)相關(guān)，嗜熱真菌屬可能參與異戊醇的分解代謝，可能對(duì)高級(jí)醇的控制具有積極的效果。

在白酒釀造過程存在多種酵母的共同作用，其中釀酒酵母是優(yōu)勢(shì)酵母，具有較高的酒精發(fā)酵能力；非釀酒酵母，主要為產(chǎn)酯酵母，其產(chǎn)酒能力相對(duì)較弱，但在白酒釀造中可以將霉菌糖化產(chǎn)生的還原糖或其他微生物分解所得的氨基酸等前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為白酒的重要風(fēng)味物質(zhì)，如醛、酯、高級(jí)醇等[48]。DICKINSON J R[37]的研究結(jié)果表明釀酒酵母能將纈氨酸合成異丁醇。

細(xì)菌是白酒釀造中的重要微生物之一，是白酒香氣來源的主力軍。在濃香型白酒的發(fā)酵過程中，如梭狀芽孢桿菌中的己酸菌和丁酸菌，會(huì)利用酒醅浸潤到窖泥中的營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生己酸和丁酸，在相關(guān)酶的作用下生成己酸乙酯和丁酸乙酯，形成濃香型白酒的特征香氣成分[49]；梭狀芽胞桿菌也是丁醇的天然生產(chǎn)者，它能在合適的發(fā)酵條件下產(chǎn)生大量丁醇[50]。在此外，乳酸菌在白酒釀造過程中不僅起產(chǎn)酸作用，同時(shí)也有利于酒醅中的成分發(fā)生美拉德反應(yīng)，從而促進(jìn)香氣物質(zhì)的形成[51]。白酒的釀造過程中，參與的微生物種類成百上千，若沒有這些功能菌，也無法釀造各類白酒。

酵母與真菌之間相互作用，主要表現(xiàn)在酵母作為生物防治劑，對(duì)真菌有拮抗作用，絲狀真菌則提供相應(yīng)的水解酶類分解復(fù)雜的底物，為酵母的生長和發(fā)酵提供底物，而酵母將底物轉(zhuǎn)化為乙醇和風(fēng)味物質(zhì)[51]。

目前國內(nèi)關(guān)于白酒中微生物相互影響的研究鮮有報(bào)道，但白酒是多菌種混合發(fā)酵，發(fā)酵過程中微生物之間的協(xié)同、拮抗和抑制等相互作用是應(yīng)予以重視。單菌種發(fā)酵對(duì)雜醇油形成的影響是必然的，而多菌種發(fā)酵對(duì)雜醇油的形成機(jī)制的具體作用機(jī)理，也是潛在的研究熱點(diǎn)。

3 小結(jié)

白酒有多種香型之分，其釀造曲種與發(fā)酵工藝也不盡相同。從曲種的制備到原酒的貯存，每一步均有相應(yīng)措施用以控制白酒中的雜醇油含量，但因香型多樣，曲種不同，目前尚未能建立有效控制白酒中雜醇油含量的體系：工藝優(yōu)化僅適用于個(gè)例，且成本高；選育低產(chǎn)雜醇油的菌株，實(shí)際應(yīng)用的可行性不大且對(duì)其他微生物的生長代謝影響不明；改善蒸酒方式不能普遍應(yīng)用于所有酒廠，酒廠需打造適合的蒸餾裝置導(dǎo)致投資成本較高。因此，采用高通量測(cè)序技術(shù)、組學(xué)分析技術(shù)等生物技術(shù)以系統(tǒng)了解白酒中微生物的多樣性、解析微生物菌群與雜醇油的關(guān)系、挖掘功能微生物可為控制白酒中的雜醇油含量提供新思路。