馬銀花，鄒芝英，祝璟琳，喻 杰，肖 煒，李大宇，楊 弘，胡平各，陳炳霖

(1.南京農業(yè)大學無錫漁業(yè)學院，江蘇無錫 214081；2.中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心，農業(yè)農村部淡水漁業(yè)和種質資源利用重點實驗室，江蘇無錫 214081)

絲裂酶原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能夠通過磷酸化級聯反應將細胞外的刺激信號帶入細胞核內[1]。p38MAPK是MAPK家族中的重要組成部分，位于細胞眾多信號轉導通路的中樞位置，在炎癥反應[2]、細胞應激、凋亡[3]、細胞周期[4]和生長等生理、病理過程中起重要作用。

p38MAPK基因包括四種亞型：p38α、p38β、p38γ、p38δ，其中p38α和p38β幾乎存在所有組織中，p38γ和p38δ只在肌肉、胰腺、腸和腎等組織中表達[1]。此外，p38MAPK家族的所有成員均具有Thr-Gly-Tyr(TGY)雙磷酸化位點、Ala-Thr-Arg-Trp(ATRW)底物結合位點。在MAPK級聯反應中，MAPK激酶(MAPKK)可以通過磷酸化TGY位點，從而活化p38MAPK，啟動下游基因的表達，進而發(fā)揮調節(jié)作用[5]。研究表明，p38MAPK能被多種細胞外刺激所激活，如炎癥細胞因子、環(huán)境脅迫、病原體感染等。當其被激活時，能介導中性粒細胞的活化，促進巨噬細胞產生IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子，參與機體免疫反應[6]，幫助機體抵御病害威脅。Barruet等[7]曾用脂多糖(LPS)刺激CD14+原代單核細胞，結果顯示p38MAPK表達量上調，細胞因子、趨化因子和轉化生長因子-β(TGF-β)分泌增加?？梢姡琾38MAPK在機體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。目前在大西洋鮭[8]、斑馬魚[9]、鯉[10]、文昌魚[11]等水產動物中都克隆出p38MAPK基因，但關于羅非魚p38MAPK的研究很有限。

羅非魚(Oreochromisspp.)作為聯合國糧農組織(FAO)重點推廣的養(yǎng)殖對象，被譽為未來動物性蛋白質主要來源之一，具有較高的經濟價值[12]。然而近年來羅非魚鏈球菌病頻繁暴發(fā)，使羅非魚養(yǎng)殖產業(yè)的經濟損失日趨嚴重。其中，無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)是主要致病菌，能造成羅非魚全身性組織炎癥反應和器官損害，尤其是肝臟、脾臟、腎臟和腦等重要器官功能障礙和衰竭，嚴重時甚至引起魚類的急性死亡[13]。因此，為了研究p38MAPK與羅非魚的免疫相關性，本實驗克隆獲得尼羅羅非魚p38MAPK基因(ntp38MAPK)cDNA序列，初步分析了其在尼羅羅非魚不同組織以及感染無乳鏈球菌后不同時間點的表達變化規(guī)律，以期能為應對鏈球菌刺激后的調控機理提供一定的基礎數據，為羅非魚的疾病綜合防控提供理論基礎，進而為羅非魚養(yǎng)殖健康可持續(xù)發(fā)展提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用的尼羅羅非魚埃及品系NE來自中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心農業(yè)部羅非魚遺傳育種中心。實驗用魚在水溫28 ℃的循環(huán)水箱中暫養(yǎng)一周后使用。

無乳鏈球菌(LB110808-2)保存于本實驗室-80 ℃超低溫冰箱[14]。該病原菌已經通過API20 Strep快速鑒定及16S rDNA分子鑒定確定為無乳鏈球菌，回歸感染證明其具有較強毒力。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

總RNA的提取采用Trizol 試劑(Invitrogen)，按照說明書進行操作，通過瓊脂糖凝膠電泳與紫外分光光度計確定其完整性及質量。利用反轉錄試劑盒(TaKaRa)合成cDNA，利用SMARTTM RACE Amplification 試劑盒(Clontech)合成3′RACE和5′RACE cDNA第一條鏈。

1.2.2 尼羅羅非魚p38MAPK基因的cDNA克隆

根據NCBI中羅非魚p38MAPK轉錄組預測序列(XM_003441527)，用Primer 5.0軟件設計特異性引物(表1)，將引物送至上海生工生物工程有限公司進行合成。

以羅非魚肝臟組織 cDNA為模板進行中間片段PCR擴增，反應體系(20 μL):rTaq 0.2 μL，10×PCR Buffer 2 μL，dNTP Mixture 2 μL，5 μmol/L的p38-F1引物1.6 μL，5 μmol/L的p38-R1引物1.6 μL，cDNA模板1 μL，RNase-free Water添加至20 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后在72 ℃再延伸10 min。PCR擴增后使用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR目的片段產物的大小。將目的片段與pMD19-T載體(TaKaRa)連接，轉入到E.coil感受態(tài)細胞(TaKaRa)中，鋪板于氨芐-LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)。PCR檢測陽性菌落，送至生工生物(上海)工程股份有限公司進行測序。在NCBI中進行比對，確定p38MAPK基因片段。結合RACE技術獲得p38MAPK基因的cDNA全長，具體操作詳見說明書。所用引物見表1。

表1 實驗所用引物Tab.1 The primers used in this study

1.2.3 序列分析

利用Emboss(http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/showorf)軟件預測氨基酸序列；ProtParam(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/ protparam)軟件對推導出的蛋白序列進行蛋白理化特性預測；磷酸化位點預測使用NetPhos(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos)軟件；用NCBI中的Blast程序搜索用于p38MAPK基因同源性分析與系統(tǒng)樹構建的氨基酸序列；采用Clustal X軟件進行多重序列比對；利用MEGA 5.05軟件構建NJ系統(tǒng)進化樹；利用GOR方法(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin gor4)進行二級結構預測。

1.2.4ntp38MAPK基因的組織表達分析

選6尾二齡的健康尼羅羅非魚，選取肝、脾、頭腎、體腎、腦、血液、肌肉、鰓、腸、精巢、心臟等11種組織，放入Trizol中，保存在液氮中，用于ntp38MAPK基因的組織表達分析。

根據ntp38MAPK基因的全長序列設計熒光定量PCR引物p38-F4、p38-R4(表1)，以β-actin為內參基因(表1)，不同組織cDNA為模板，進行熒光定量PCR。反應體系20 μL，包括SYBR?Green PCR Master Mix (TOYOBO)10 μL，0.8 μL 引物(5 μmol/L)，2 μL cDNA模板(1 μg)，RNase-free Water 補足到20 μL。反應程序為95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，40個循環(huán)；融解曲線分析。熒光定量PCR檢測結果采用2-ΔΔct法進行分析。

1.2.5ntp38MAPK基因鏈球菌感染后的表達分析

將經鑒定的無乳鏈球菌原種接種并復壯，劃線培養(yǎng)。實驗時，將菌種接種于腦心浸液液體培養(yǎng)基(BHI)中，210 r/min、29 ℃的條件下擴大培養(yǎng)24 h，用無菌的8.5 g/L NaCl溶液洗滌后配置成濃度為6.9×108cfu/mL的菌懸液原液[14]。感染濃度通過連續(xù)10倍稀釋后涂布于腦心浸液瓊脂平板，28 ℃培養(yǎng)24 h后，計數單克隆菌落倒推計算所得。

選取尼羅羅非魚埃及品系(NE)90尾，體質量(182±30)g，于循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)適應一周，每天適當提高溫度，實驗前使水溫達到(33±1)℃。實驗開始，對實驗魚腹腔注射濃度為1.4×105cfu/mL的無乳鏈球菌，每尾0.3 mL，分別于攻毒后0、2、4、8、12、24、48、72 h共8個時間點進行取樣(0 h設為對照組)，每個時間點取6尾魚，每尾魚取頭腎、肝、脾組織，保存于液氮中用于RNA的提取。人工感染3 d后隨機取瀕死的羅非魚解剖,無菌操作取腦和腎臟組織在血平板上分離、純化病原菌,并用梅里埃API 20 Strep試劑條(Biomerieox)進行快速鑒定。

按照前述方法提取攻毒后各個時間點尼羅羅非魚肝、脾、頭腎組織的RNA，逆轉錄成cDNA。以cDNA為模板，β-actin為內參進行熒光定量PCR。反應體系、反應程序以及數據處理方法同上組織表達。

1.2.6 統(tǒng)計學分析

實驗數據用統(tǒng)計學軟件SPSS 19.0的單因素方差(ANOVA)分析和Duncan′s多重比較進行組間比較分析，當P<0.05時認為差異顯著。實驗數據用平均值±標準誤(Mean±SE)表示。

2 結果與分析

2.1 ntp38MAPK基因cDNA的克隆及序列分析

通過RACE技術克隆得到尼羅羅非魚p38MAPK基因cDNA全長序列，命名為ntp38MAPK(GenBank登錄號：MN478475)。ntp38MAPK的cDNA全長1 789 bp，ORF長1 086 bp，5′UTR長342 bp，3′UTR為361 bp。3′端含有polyA尾，不含多聚腺苷酸AATAA加尾信號。ORF可編碼361個氨基酸，預測分子量為41.598 kD，理論等電點為5.1。本序列包括35個磷酸化位點(其中絲氨酸位點14個，蘇氨酸位點13個，酪氨酸位點8個)，同時含有p38家族典型的Thr-Gly-Tyr(TGY)雙磷酸化位點、緊密相連的底物結合位點Ala-Thr-Arg-Trp(ATRW)以及CD結構域(圖1)。利用GOR法對蛋白質二級結構預測后發(fā)現，整條氨基酸序列的二級結構有 α 螺旋、延伸鏈以及無規(guī)則卷曲構成，其中α螺旋占37.95%，延伸鏈占14.40%，無規(guī)則卷曲比列最大占47.65%。

2.2 同源性分析

經NCBI中BLAST比對分析發(fā)現，尼羅羅非魚p38MAPK蛋白與其他物種的具有較高的相似性。利用Clustal-X軟件進行多重序列比對，結果表明：該序列與大黃魚(Larimichthyscrocea:XP_010754403.1)、鱸(Dicentrarchuslabrax:CBN8089 3.1)的相似性最高，達到97%。與其他脊索動物的相似性：與斑馬魚(Daniorerio:AAQ91248.1)的相似性為94%；大西洋鮭(Salmosalar:XP_013991178.1)的相似性為93%；與牙鲆(Paralichthysolivaceus:XP_019942433.1)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss:XP_021472540.1)以及牦牛(Bosmutus:QAB47435.1)的相似性都為92%；與人(Homosapiens:NP_002742.3)和小鼠(Musmusculus:AAH12235.1)的相似性都為90%。此外與其他節(jié)肢動物的相似性也很高，與擬穴青蟹(Scyllaparamamosain:AHH29322.1)的相似性為76%；與蠅蛹金小蜂(Nasoniavitripennis:NP_001136337.1)的相似性為75%；與家蠶(Bombyxmori:NP_001036996.1)、棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera:AHL46461.1)的相似性都為73%(圖1)。

利用MEGA 6.0軟件，采用NJ法構建了MAPK系統(tǒng)進化樹(圖2)。從系統(tǒng)進化樹可以看出，尼羅羅非魚的p38MAPK與脊索動物大黃魚、鱸的p38MAPK聚為一支，后與大西洋鮭、虹鱒聚為一支，最后與其他節(jié)肢動物聚合。

圖1 ntp38MAPK的氨基酸序列與其他物種的氨基酸序列比對Fig.1 Comparison of amino acid sequence of ntp38MAPK with multiple amino acid sequences of other species雙磷酸化位點TGY、底物結合位點ATRW和CD結構域用方框標出

圖2 利用MEGA5.05軟件構建的基于ntp38MAPK氨基酸序列的NJ系統(tǒng)進化樹Fig.2 NJ phylogenetic tree based on ntp38MAPK amino acid sequence constructed with MEGA5.05 software尼羅羅非魚ntp38MAPK用星號標出

2.3 ntp38MAPK基因的組織表達分析

如圖3所示，ntp38MAPK在心臟、肝臟、脾、頭腎、體腎、腦、肌肉、腸、鰓、血液以及精巢中都有表達，且存在明顯的組織差異性。其中肌肉組織中表達量最高(為頭腎中相對表達量的6.9倍)，隨后是心臟、肝臟、血液以及腦，精巢、鰓、體腎、脾臟、腸的表達量相對較低，頭腎中最低。

圖3 尼羅羅非魚ntp38MAPK在各組織表達情況Fig.3 Expression of ntp38MAPK in O.niloticus in various tissues1.肝臟，2.脾臟，3.頭腎，4.體腎，5.鰓，6.腸，7.肌肉，8.腦，9.心臟，10.血液，11.精巢。小寫字母不同表示差異性顯著(P<0.05)，標有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)

2.4 無乳鏈球菌感染后ntp38MAPK表達分析

無乳鏈球菌感染后ntp38MAPK在肝臟中的表達變化情況如圖4。結果顯示，感染2 h，表達量逐漸上調，在4 h達到峰值，為對照組的2.1倍。8 h下調為對照組的0.8倍，與對照組差異不顯著。感染12 h表達量上調到又一峰值，為對照組的3.9倍。24～72 h表達量趨于對照組水平。

圖4 無乳鏈球菌感染后肝臟中ntp38MAPK的表達情況Fig.4 Expression of ntp38MAPK in liver after streptococcal infection小寫字母不同表示差異性顯著(P<0.05)，標有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)。下圖同。

在無乳鏈球菌感染的過程中，ntp38MAPK在脾臟中的表達量在感染后2 h明顯上調，為對照組的1.6倍。之后表達量開始下調，8 h表達量下降到最低，為對照組的0.06倍。12 h表達量有所回升但顯著低于對照組，為對照組的0.5倍。24～72 h，表達量趨于平穩(wěn)，但顯著低于對照組 (圖5)。

圖5 無乳鏈球菌感染后脾臟中ntp38MAPK的表達情況Fig.5 Expression of ntp38MAPK in spleen after streptococcal infection

在頭腎中的表達量變化趨勢與肝臟有些類似，均呈現上調與下調波動性往復變化。無乳鏈球菌感染后2 h，表達量上調到對照組的1.9倍。之后開始下降，8 h達到最低值，為對照組的0.3倍。12 h表達量又回升，為對照組的1.4倍。24～72 h趨于對照組水平(圖6)。

圖6 無乳鏈球菌感染后頭腎中ntp38MAPK的表達情況Fig.6 Expression of ntp38MAPK in head kidney after streptococcal infection

3 討論

p38MAPK在炎癥反應、細胞因子產生、轉錄調節(jié)等過程中具有重要作用[5]。為了深入研究尼羅羅非魚p38MAPK在抗菌免疫方面的作用，本實驗克隆了尼羅羅非魚埃及品系p38MAPK全長序列。該基因編碼的氨基酸序列含有p38家族典型保守的Thr-Gly-Tyr(TGY)雙磷酸化位點、緊密相連的底物結合位點Ala-Thr-Arg-Trp(ATRW)，以及CD結構域。經序列比對以及同源性分析發(fā)現，ntp38MAPK與其他物種的相似性都在70%以上，可見p38MAPK在進化中十分保守。通過系統(tǒng)進化分析，尼羅羅非魚p38MAPK與同為鱸形目的大黃魚、鱸親緣關系最近，這與傳統(tǒng)的分類系統(tǒng)相一致。綜上所述，本實驗克隆得到的是尼羅羅非魚埃及品系的p38MAPK基因。

組織測定結果顯示ntp38MAPK在尼羅羅非魚各組織均廣泛表達。類似地，在斑馬魚[9]、文昌魚[11]等水生生物中，p38MAPK在各組織中均有表達，這與p38MAPK在不同組織參與不同的生理功能有關[15]。但是在不同的物種中，p38MAPK在不同組織中的mRNA豐度并不相同。本實驗中，ntp38MAPK在肌肉中的表達量最高，哺乳動物中的研究表明p38MAPK主要在骨骼肌中表達，并參與肌肉的分化調控[16]。然而，擬穴青蟹[17]中p38MAPK表達量最高的組織是血細胞、腸道，而肌肉中的表達量最低；這可能與p38MAPK在不同生物組織中功能的多樣性有關[15]。

諸多研究表明，p38MAPK參與調控多種生物的免疫過程，尤其在調節(jié)先天免疫反應方面[2]。Jiu等[11]發(fā)現在文昌魚中脂多糖(LPS)刺激能引起p38MAPK表達量變化。Yan等[18]證實p38MAPK在調控中國對蝦抵抗病毒細菌感染、清除病原、提高存活率過程中起至關重要的作用。本實驗中，無乳鏈球菌刺激后，尼羅羅非魚肝臟、脾臟和頭腎等免疫組織中ntp38MAPK的表達量顯著變化，推測ntp38MAPK參與了羅非魚抗菌免疫過程。

腹腔注射無乳鏈球菌后，尼羅羅非魚脾臟中ntp38MAPK快速響應，在感染后2 h表達量上調到對照組的1.6倍；肝臟中ntp38MAPK在4 h開始響應，12 h達到峰值，為對照組的3.9倍，推測可能與無乳鏈球菌對組織感染入侵途徑有關。利用免疫組織化學定位技術發(fā)現，腹腔注射無乳鏈球菌后病原菌陽性信號首先出現在脾臟，之后是肝臟[19]。脾臟是羅非魚的主要免疫器官，同時是無乳鏈球菌的主要攻擊對象[20]。而肝臟是魚類的代謝器官，同時具有一定解毒和防御功能。無乳鏈球菌侵入魚體內后，少量病菌入侵肝臟，肝臟內吞噬細胞即可吞噬清除病原菌，但隨著病原菌在體內大量繁殖，其毒力因子累積增多，機體需逐漸擴大炎癥反應來抵抗病原菌[21]，因此肝臟中的反應稍有滯后。同時，不同種類致病菌引起p38MAPK變化時間也有差異。石斑魚感染海豚鏈球菌(革蘭氏陽性菌)、遲鈍愛德華氏菌(革蘭氏陰性菌)和巨細胞病毒(病毒)后，p38MAPK的表達量分別在感染3 h、12 h和48 h達到峰值[22]；凡納濱對蝦[18]感染革蘭氏陰性菌后，血細胞、鰓中p38MAPK的表達量分別在8 h、12 h達到峰值，感染革蘭氏陽性菌后，鰓中p38MAPK的表達量在8 h即達到最大值，血細胞中在12 h才達到峰值。另外，頭腎是魚類重要的淋巴組織，在免疫應答過程中起主要作用[21]，在感染后的2 h檢測到頭腎中ntp38MAPK表達量顯著上調。感染8 h后肝臟、脾臟和頭腎中p38MAPK的表達量均有下調，推測與機體自身免疫調節(jié)有關。類似的，海參[23]、對蝦[24]感染弧菌后，p38MAPK表達量分別在8 h、4 h明顯下調。

尼羅羅非魚無乳鏈球菌感染24 h后，肝臟、頭腎中ntp38MAPK表達量恢復至對照組水平。同樣地，Yu等[17]用金黃色葡萄球菌感染擬穴青蟹，24 h后血細胞中p38MAPK基因表達量恢復到對照組水平。已有研究表明，p38MAPK在免疫過程中具有雙重調節(jié)作用。當炎癥反應到達一定程度后，p38MAPK能通過雙特異性磷酸酶(DUSP)介導的MAPK去磷酸化來形成負反饋調節(jié)以降低免疫反應對組織帶來的損傷[25]。Keranen等[26]發(fā)現增加雙特異性磷酸酶MKP-1的表達，能夠抑制p38MAPK信號通路，從而抑制細胞因子的產生，進而降低炎癥反應，使機體達到穩(wěn)定狀態(tài)。然而，本實驗中脾臟中ntp38MAPK表達量顯著低于對照組。推測可能是由于無乳鏈球菌的長時間感染造成了脾臟組織功能和結構的損壞。病理形態(tài)學分析發(fā)現，無乳鏈球菌感染能造成脾臟內紅細胞大量破壞，進而導致貧血，免疫功能降低[14]。另外，賀揚[20]運用轉錄組測序技術分析發(fā)現Toll樣受體 (TLR5)在無乳鏈球菌感染4～72 h表達量顯著上調，進而介導促炎因子的大量表達，這可能是導致脾臟過度炎癥，出現脾臟急性壞死的主要原因。ntp38MAPK在尼羅羅非魚免疫組織中表達量的變化，說明ntp38MAPK參與了機體抗菌免疫反應，在先天免疫反應中具有重要作用，然而具體的作用機制需要進一步研究。

本實驗首次成功克隆獲得尼羅羅非魚的ntp38MAPK全長序列，并利用實時熒光定量PCR技術檢測ntp38MAPK的組織表達情況，分析了無乳鏈球菌感染過程中尼羅羅非魚肝臟、脾臟、頭腎中ntp38MAPK相對表達量的變化，推斷p38MAPK基因在尼羅羅非魚抵抗細菌侵染中起重要作用，為深入研究尼羅羅非魚p38MAPK信號通路的作用機制以及調控機理奠定了基礎。