高 雪，韓世成，馬 波，呂偉華，王念民，張 穎

(1.中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱 150070； 2.上海海洋大學農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水種質資源重點實驗室，上海 201306)

與脊椎動物相似，促性腺激素釋放激素(GnRH)、促性腺激素(GtHs)和性腺類固醇激素作為生殖相關的關鍵激素，主要通過下丘腦-垂體-性腺軸來參與魚類的生殖調控[1]。在調控過程中，GnRH誘導垂體合成并釋放促卵泡激素(FSH)和促黃體激素(LH)[2]，F(xiàn)SH和LH分泌到血流中，并通過與細胞表面上的同源受體GtHRs結合而協(xié)同參與體內(nèi)重要的生理過程，該特定的結合受體主要存在于硬骨魚的性腺中，參與誘導類固醇的分泌和配子的發(fā)生[3,4]。促卵泡激素受體(follicle-stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR)屬于視紫紅質類A家族的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)超家族的一員[5]，目前為止，已經(jīng)在大馬哈魚(Oncorhynchusrhodurus)、鯰(Silurusasotus)、斑馬魚(Daniorerio)和日本鰻(Anjuillajaponica)等多種硬骨魚中克隆得到FSHR基因[6-9]，并進行了組織表達的研究，發(fā)現(xiàn)Gthr基因主要在性腺中表達，這種有限的組織分布強調了這兩種糖蛋白激素在脊椎動物性腺生理調節(jié)中的重要性[10,11]。在成熟的鮭魚中，發(fā)現(xiàn)FSHR定位于雌性鮭魚的包膜細胞和顆粒細胞，以及雄性鮭魚精子囊周圍的細胞[12]，直接參與了生殖細胞的生長和發(fā)育。此外，在日本鰻鱺[13]和非洲鯰魚[14]的間質細胞中也檢測到FSHR基因的表達，該細胞定位與兩種促性腺激素在成熟魚類中分泌的類固醇生成物一致。除了在激素生成調控中的作用，對生殖周期中FSHR基因性腺表達譜的分析表明，它們參與了魚類配子生成的關鍵時期，在金錢魚、歐洲鱸和黃顙魚等魚類中已得到證實[15]。

施氏鱘(Acipenserschrenckii)主要分布在黑龍江、烏蘇里江和松花江等地，是我國北方重要的淡水魚類，具有很高的經(jīng)濟價值，尤其是魚卵價值更高，有“黑色珍珠”的美譽[16]。目前，我國已是世界上最大的鱘魚養(yǎng)殖國與魚子醬出口國，養(yǎng)殖產(chǎn)量占世界產(chǎn)量的85%以上。施氏鱘性成熟晚，不具有副性征，外表難以區(qū)分雌雄性別，繁殖生物學研究的空白很多[17]。目前，國內(nèi)外對施氏鱘生長繁育方面的研究比較少，有關施氏鱘性腺發(fā)育尤其是早期配子形成的分子機制還未闡明，因此開展其分子機理的研究具有重要意義。本研究以施氏鱘為實驗材料，采用RACE技術克隆得到施氏鱘FSHR基因，分析其序列特征和系統(tǒng)進化關系，研究其時空表達特征，為進一步闡明FSHR的生理功能和分子機制奠定基礎，同時也為施氏鱘早期生殖調控提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及分組

實驗選用中國水產(chǎn)科學研究院鱘魚工程繁育中心同一批次90日齡的施氏鱘，共160尾，魚體質量為38～55 g，體長201～266 mm。實驗試劑為促黃體激素釋放激素激動劑LHRH-A(GnRH的類似物)，按不同注射劑量組(未注射、1 μg/kg 、3 μg/kg 、5 μg/kg)進行隨機分組，每組40尾，注射后，各組分別于四個時間點(1 d、3 d、5 d和7 d)取性腺和垂體，每個時間點取9尾，每三尾混合作為一個樣，共三個平行，用液氮迅速冷凍樣品，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ａ砣◇w重(4.8±2.23)kg的施氏鱘，取其心、腎、脾、腸、鰓、腦及卵巢等組織，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA的提取和cDNA的合成

采用總RNA提取試劑盒(Promega)提取總RNA，按照說明書進行操作。用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，超微量核酸蛋白測定儀(Thermo Scientific美國)測定RNA濃度，暫存于-80 ℃保存。以含量為1.5 μg的總RNA為模板，按照GoScriptTM Reverse Transcription Mix，Oligo DT (Promega)和SMARTTM Race cDNA試劑盒(Clontech)的說明書，分別反轉錄合成cDNA和Race cDNA第一鏈，稀釋10倍后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 FSHR全長cDNA序列的獲得

采用同源克隆的方法，根據(jù)小體鱘FSHR基因的cDNA序列，GenBank登錄號為(ANT47399.1)，在保守區(qū)域內(nèi)設計核心引物，引物由吉林庫美生物技術公司合成(表1)。以施氏鱘成熟期性腺cDNA為模板，使用2×Es Taq MasterMix (CWBIO)進行PCR擴增，反應體系為20 μL，PCR反應程序為：94 ℃預變性3 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個循環(huán)，終延伸72 ℃ 5 min。1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(CWBIO)對目的片段進行切膠回收，純化片段連接到pMD18-T (TaKaRa)載體，轉化至大腸桿菌(DH5α)感受態(tài)細胞，在含Amp的LB平板上37 ℃培養(yǎng)過夜，經(jīng)菌落PCR鑒定，挑選陽性克隆送吉林省庫美生物科技有限公司測序。根據(jù)已經(jīng)獲得的中間片段分別設計5′RACE和3′RACE的內(nèi)外側特異性引物(表1)，以RACE cDNA第一鏈為模板，用引物UPM和FSHR外側引物進行第一輪擴增，隨后以第一輪PCR產(chǎn)物的稀釋液為模板，用NUP和FSHR內(nèi)側引物進行第二輪擴增。反應程序按照SMARTer?RACE 5′/3′Kit (TaKaRa，clontech)試劑盒的說明書設定。膠回收、連接、轉化及測序如上所述。

1.4 施氏鱘FSHR基因的序列分析

用SeqMan對FSHR基因的中間序列和3′ RACE、5′ RACE末端進行全長拼接；使用DNAMAN 8.0軟件查找開放閱讀框(ORF)并將其推導為氨基酸序列，應用NCBI中BLAST程序對序列進行比對；利用Clustal X和Mega 7.0鄰接法(Neighbour-Joining，NJ)構建系統(tǒng)進化樹；使用專業(yè)蛋白在線分析系統(tǒng)(Expert Protein Analysis System，Ex PASy)分析該蛋白基本物理化學參數(shù)、信號肽及修飾位點；利用NetNGlyc1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc)預測N端糖基化位點。利用在線工具TMHMMServer 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)對蛋白的跨膜區(qū)域進行預測。

1.5 熒光定量PCR

以反轉錄得到的cDNA為模板，根據(jù)已獲得的cDNA全長序列設計熒光定量PCR特異性引物，以β-actin基因設計內(nèi)參引物(表1)，采用半定量RT-PCR和qRT-PCR法，檢測FSHR 基因mRNA在雌性施氏鱘各組織中表達情況及GnRH激動劑對FSHR基因表達的影響。熒光定量PCR儀使用ABI 7500 (Applied Biosystems，USA)，熒光試劑使用SYBRPremix Ex Taq (Takara，II 中國大連)，按說明書進行實驗。結果采用2-ΔΔCT方法計算相對表達量，數(shù)據(jù)用平均值±標準差(mean±SD)表示。為確保實驗的準確性和可重復性，每個樣品設3次重復。用SPSS進行單因素方差分析和Duncan多重比較，顯著性水平設為P<0.05。

表1 實驗所用引物及序列Tab.1 Names and sequences of primers used in this study

2 結果與分析

2.1 施氏鱘FSHR基因全序列克隆和分析

使用三對核心序列引物和3′端與5′端非翻譯區(qū)特異性RACE引物擴增得到施氏鱘FSHR基因cDNA序列全長2 696 bp，包括5′端非編碼區(qū)(5′ UTR，102 bp)，開放閱讀框(ORF)1 986 bp以及3′端非編碼區(qū)(3′ UTR，608 bp)，共編碼661個氨基酸。預測施氏鱘FSHR蛋白質的分子量為75.02 kD，理論PI值為8.35，亮氨酸Leu的含量最高，為12.9%。疏水性分析結果顯示， FSHR疏水性平均值為正值0.289，屬于疏水性蛋白質。此蛋白具有典型的G蛋白偶聯(lián)受體家族的結構FSVyT LTVITLERWHtI，位于428～444aa。該氨基酸序列包含339aa的胞外區(qū)域(ECD)和58aa的胞內(nèi)區(qū)，其中前17aa為信號肽；長度為264aa的7次跨膜螺旋區(qū)(7 TM helices)，由3個胞內(nèi)環(huán)(in I～in III)和3個胞外環(huán)(out I～out III)連接。推測該氨基酸含有5個潛在的N端糖基化位點，分別為48NTTH、138NLSK、194NNTK、270NLTY、294NMSQ (圖1)。此外，預測整個編碼區(qū)有31個絲氨酸(Ser)磷酸化位點、21個蘇氨酸(Thr)磷酸化位點和9個酪氨酸(Tyr)磷酸化位點。

2.2 施氏鱘FSHR氨基酸同源性分析

利用DNAMAN8軟件對施氏鱘的氨基酸序列進行比對，施氏鱘FSHR氨基酸序列與小體鱘(Acipenserruthenus)FSHR的同源性最高為99%，與斑馬魚同源性為65%，與人類等哺乳動物同源性為59%(表2)，在進化中比較保守。不同物種氨基酸序列對比發(fā)現(xiàn)了多個半胱氨酸保守性區(qū)域和GpHR家族保守信號序列，為CCAF、ERW、FTD、NPFLY(圖2)。利用MEGA7.0構建系統(tǒng)進化樹，F(xiàn)SHR進化分析發(fā)現(xiàn)，進化樹可分為兩大支，其它各種魚類聚為一支，施氏鱘、哺乳類和鳥類聚為一支且與小體鱘親緣關系最近(圖3)。

圖1 施氏鱘FSHR基因cDNA全長序列Fig.1 Full sequence of FSHR gene cDNA of A.schrenckii起始密碼子ATG；跨膜螺旋區(qū)(TM Ⅰ-TM Ⅶ)：黑底白字；胞內(nèi)環(huán)(in Ⅰ-in Ⅲ)→；胞外還 (out Ⅰ-out Ⅲ)←；潛在的N-糖基化位點?；終止密碼子：TGA

表2 FSHR氨基酸序列的同源性比對Tab.2 Comparative identity of amino acid sequence of FSHR

圖2 施氏鱘FSHR氨基酸序列與其他物種FSHR氨基酸比對Fig.2 Alignment of A.schrenckii FSHR with FSHRs from several other species相同的氨基酸、高度保守的氨基酸，分別以“黑色”和“灰色”表示；黑色邊框：GpRH家族的特殊保守信號序列；黑色下劃線：富含半胱氨酸殘基的高度保守區(qū)。

圖3 施氏鱘FSHR與其他脊椎動物FSHR構建的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of A.schrenckii FSHR and other species FSHR

2.3 施氏鱘FSHR基因組織分布表達

采用半定量 RT-PCR 和熒光定量RT-qPCR檢測 FSHR 基因在Ⅱ期雌性施氏鱘不同組織中的表達。從圖4中看出β-actin 基因片段在施氏鱘各組織中的擴增良好，能夠排除RNA 提取失敗導致的假陰性結果。結果顯示，施氏鱘的促卵泡受體基因在心臟、肝、脾、腦、性腺等12種組織中均有表達，在垂體中表達量最高，其次為性腺，而在肌肉、皮膚、腎和鰓中幾乎不表達 (圖5)。

圖4 FSHR基因在雌性施氏鱘各組織中的表達Fig.4 The expression of FSHR gene in female A.schrenckiiM：DNA分子量標準；O卵巢；P垂體；B腦；H心臟；L肝臟；SP脾；K腎；ST胃；FG前腸；MG中腸；HG后腸；Mu肌肉；T輸卵管；F脂肪；SK皮膚；G鰓。

圖5 FSHR 基因在雌性施氏鱘各組織中的表達Fig.5 The expression of FSHR gene in female A.schrenckiiO卵巢；P垂體；B腦；H心臟；L肝臟；SP脾；K腎；ST胃；FG前腸；MG中腸；HG后腸；Mu肌肉；T輸卵管；F脂肪；SK皮膚；G鰓。

2.4 LHRH-A對施氏鱘FSHR基因表達的影響

與對照組相比，注射不同濃度LHRH-A 的施氏鱘垂體中 FSHR 基因mRNA的表達量在不同時間點均有上升，其中，3μg/kg組在注射第3天 FSHR 的表達量達到最高峰，差異性顯著，表明GnRHα處理后FSHR大量表達(圖6)；性腺中FSHR的表達量整體呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，但是各濃度組中FSHR達到最高表達量的時間不同(圖7)，其中，1 μg/kg組在第3天達到峰值，5 μg/kg組在第5天達到峰值，均高于對照組，且差異性顯著。

3 討論

FSHR是視紫紅質樣受體家族的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)(家族A)，與TSHR一起構成了糖蛋白激素受體(GpHR)的亞家族[5]。本實驗克隆得到施氏鱘促卵泡激素受體基因的全長cDNA序列，全長為2 696 bp，編碼661個氨基酸，蛋白質相對分子量約為75.02 kD，理論PI值為8.35。在NCBI數(shù)據(jù)庫中，經(jīng)blast對比，其與小體鱘的促性腺激素受體基因氨基酸的相似性高達99%，可以確定其為施氏鱘的促性腺激素受體基因。施氏鱘與其它魚類的促性腺激素受體相似，其一般拓撲結構包括一個大的細胞外結構域、七個跨膜螺旋區(qū)和一個羧基末端的尾部[18]，但與哺乳動物FSHR氨基酸序列相比，魚類FSHR的細胞外結構域存在顯著差異，一個關鍵特征是它們的細胞外結構域構成蛋白質長度的一半以上，有助于激素的識別和特異性結合[19]。已有報道證明，該受體的跨膜結構域是最保守的部分，它們穿過脂質雙層并由三個細胞內(nèi)和三個細胞外環(huán)鏈接，具有受體激活和信號轉導的作用[20]。此外，在施氏鱘FSHR氨基酸序列的ECD區(qū)，發(fā)現(xiàn)了5個N-糖基化位點，該位點最早在大馬哈魚(Oncorhynchusrhodurus)中發(fā)現(xiàn)[21]，暗示其在脊椎動物糖蛋白激素受體中的保守性。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，魚類和哺乳類位于2個明顯不同的分支，然而在進化樹中我們發(fā)現(xiàn)，施氏鱘、小體鱘與哺乳動物和鳥類聚為一支，推測與該物種的特殊性有關。

圖6 注射不同濃度GnRH激動劑的施氏鱘在不同時間點垂體中FSHR基因表達量的變化Fig.6 The changes on FSHR expression in pituitary of A.schrenckii injected with different concentrations of GnRHα at different time points小寫字母代表同一實驗組不同時間點有顯著性(P<0.05)，大寫字母代表在同一時間點不同實驗組有顯著性差異(P<0.05)。圖7同。

圖7 注射不同濃度GnRH激動劑的施氏鱘在不同時間點性腺中FSHR基因表達量的變化Fig.7 The changes on FSHR expression in gonad of A.schrenckii injected with different concentrations of GnRHα at different time points

施氏鱘FSHR在各組織中的熒光定量PCR結果表明，施氏鱘的促卵泡受體基因在大部分組織中均有表達，但表達量存在差異，說明促卵泡受體在施氏鱘中具有廣泛的生理作用。FSHR在施氏鱘垂體和卵巢中的表達量較高，該結果與黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)和非洲鯰魚(Oncorhynchusrhodurus)相似。而在垂體中的高表達可能與FSH在下丘腦的分泌有關。除此之外，F(xiàn)SHR在施氏鱘心臟、肝臟、脾、腦和輸卵管等組織中也存在不同程度的表達，這在歐洲鱸魚[9]和斑馬魚[22]的非性腺組織中均有相似的發(fā)現(xiàn)。以上研究推斷，施氏鱘的促卵泡受體基因在雌性的生殖功能中有著重要作用，同時可能具有更廣泛的性腺外生理功能。研究資料顯示，GnRH在離體或在體情況下都可以刺激魚類腦垂體釋放GtH并促進魚類的性腺發(fā)育[23]。LHRH-A是哺乳類GnRH的高活性類似物，能刺激魚類性垂體釋放GtH。本研究結果表明，腹腔注射LHRH-A可不同程度地升高施氏鱘早期性腺和垂體中促卵泡激素受體基因mRNA表達，進而促進其性腺發(fā)育。注射劑量為3 μg/kg的LHRH-A 2 d施氏鱘垂體FSHR mRNA表達無顯著變化(P>0.05)，3 d的表達量才顯著提高(P<0.05)，之后下降(P<0.05)，而注射1 μg/kg和5 μg/kg LHRH-A垂體mRNA表達水平與對照組差異較小，這表明LHRH-A在注射3 d后可顯著促進施氏鱘垂體FSHR mRNA表達水平。與垂體的表達模式不同，不同劑量LHRH-A的作用下，性腺中FSHR mRNA的表達均為先升高后降低的變化趨勢，其中，1 μg/kg和5 μg/kg分別在第三天和第五天達到極值(P<0.05)，暗示LHRH-A可能以劑量依賴的方式提高施氏鱘垂體和性腺的FSHR mRNA水平和促進FSHR的分泌，但這種促進作用在注射1周后明顯下降，可能由于LHRH-A屬于小肽，在魚體內(nèi)被降解無法長期保留。Kumakura等[24]研究證實，在紅海鯛(Pagrusmajor)中，單獨施用GnRH激動劑可以刺激紅雕性腺早熟。在未成熟的歐洲鰻魚中，GnRHa和DA拮抗劑聯(lián)合治療以誘導LH的釋放和卵巢發(fā)育[25]。綜上所述，LHRH-A可通過調控FSHR的表達參與施氏鱘的早期性腺發(fā)育，為進一步闡明FSHR的生理功能和分子機制奠定基礎，同時也為施氏鱘早期生殖調控提供基礎數(shù)據(jù)。