胡文攀，吳勝奎，李 衡，曹 慧，孟曉林,2，聶國興,2

(1.河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007；2.河南省水產(chǎn)動物工程技術(shù)研究中心，河南新鄉(xiāng) 453007)

隨著科技的進(jìn)步，集約化養(yǎng)殖程度不斷提高，高密度養(yǎng)殖在提升經(jīng)濟(jì)效益的同時，也引發(fā)了魚類疾病頻發(fā)、抗生素濫用等諸多問題[1]，這給水產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展帶來了巨大影響。雖然抗生素在預(yù)防和治療水生動物疾病方面效果顯著[2]，但長期或過量使用會破壞魚類機(jī)體免疫力，增強(qiáng)病原菌的耐藥性，增加魚體藥物殘留[3]。中草藥含有多種營養(yǎng)素、微量元素和生物活性物質(zhì)，具有增強(qiáng)免疫力、促進(jìn)生長、抑菌殺菌、保肝利膽等作用，在魚類集約化養(yǎng)殖中，已作為新型飼料添加劑替代抗生素廣泛使用[4]。

“懷山藥”，原產(chǎn)地河南焦作，有“懷參”的美譽(yù)，不僅是可食佳肴，也是地道藥材。目前，懷山藥有效成分的提取工藝以及功能性研究較為廣泛[5,6]，但關(guān)于山藥皮的應(yīng)用研究尚少，主要集中在成分提取[7，8]，以及食品加工方面[9]。在山藥加工過程中山藥皮被作為廢料丟棄，不但污染環(huán)境，而且也是對資源的極大浪費[8]。研究發(fā)現(xiàn)，懷山藥皮含有薯蕷皂苷、多糖、黃酮、多酚等多種活性成分[10]，其藥用價值與山藥籽實相當(dāng)。因此，如何有效利用山藥皮，將其進(jìn)行二次開發(fā)利用具有十分重要的意義。

淇河鯽(Carassiusauratus)屬鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)鯽屬(Carassius)，是河南省特有的珍稀優(yōu)質(zhì)魚類[11]。因肉質(zhì)鮮美營養(yǎng)價值豐富，深受消費者的喜愛[12]。本研究通過在飼料中添加不同劑量的懷山藥皮，研究其對淇河鯽血液生化指標(biāo)、肝腸組織形態(tài)、免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響，旨在為懷山藥皮在水產(chǎn)上的開發(fā)利用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

實驗用添加劑懷山藥皮，產(chǎn)自河南省武陟縣，山藥皮經(jīng)超微粉碎過60目篩，60 ℃烘干。將懷山藥皮分別按基礎(chǔ)飼料0.5%、1%和2%的添加量，制成實驗飼料。飼料原材料粉碎過篩(60目)，按配方比重拌勻，加油、加水充分混合?；旌戏椒ú捎枚啻位旌稀⒅鸺墧U(kuò)大的方法。用飼料顆粒機(jī)(KL-125B)制成粒徑2.5 mm的顆粒飼料，晾干后于-20 °C保存?zhèn)溆谩；A(chǔ)飼料配方見表1。

1.2 實驗設(shè)計及飼養(yǎng)管理

實驗魚購自新鄉(xiāng)市延津漁場，購回后用20 mg /L的高錳酸鉀水溶液藥浴10 min，于河南師范大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地循環(huán)水系統(tǒng)暫養(yǎng)2周，以基礎(chǔ)飼料飽食投喂。正式實驗選取健康狀況良好的體質(zhì)量(106.76±3.74)g的淇河鯽240尾。實驗分為4組,分別為對照組(NC)、0.5%添加組(LYP)、1%添加組(MYP)和2%添加組(HYP)。每組設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)20尾魚，實驗養(yǎng)殖8周。按體重3%的量每天投喂4次，分別于每日8 ∶30、11 ∶30、14 ∶30、17 ∶30進(jìn)行。每日記錄攝食情況和死亡數(shù)量，每兩周進(jìn)行飼喂量的調(diào)整。投喂期間定期檢測水質(zhì)，保證溶解氧高于6 mg/L，氨基氮小于0.01 mg/L。水溫控制在(25±1)℃，光照周期為12L ∶12D。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)成分Tab.1 Composition and nutrient composition of base feed

注：1)每kg維生素預(yù)混料含：VA 800 000 IU，VB1 1 500 mg，VB21 250 mg，VC 2.5 g，VD3160 000 IU，VE 15 g，VB124 mg，VK3325 mg，VB61 100 mg，肌酸5.5 g，葉酸70 mg，生物素125 mg，煙酸4 g，泛酸4.5 g。2)每千克礦物質(zhì)預(yù)混料含：P 105 g，Ca 330 g，Mg 45 g，F(xiàn)e 15 g，I 50 mg，Se 9 mg，Cu 0.35 g，Zn 3 g，Mn 1.5 g，Co 11 mg。

1.3 樣品采集

養(yǎng)殖實驗結(jié)束后，將淇河鯽禁食24 h，對每桶實驗魚分別計數(shù)和稱重。取樣前用10 mg/L MS-222溶液對魚進(jìn)行麻醉，每個桶中隨機(jī)選取10尾魚放在冰盤上解剖，摘取內(nèi)臟，沖洗干凈，截取每條魚的中腸和肝臟，用PBS沖洗，使用10%福爾馬林溶液對組織進(jìn)行固定。另10條魚進(jìn)行尾靜脈采血，室溫放置2 h后，3 000 r/min的轉(zhuǎn)速，4 ℃離心l5 min，取上清-20 ℃保存；采血后取黃豆粒大小肝臟，1 cm左右中腸，液氮迅速冷凍，放置-80 ℃冰箱保存，用于組織RNA的提取。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 生長指標(biāo)測定

計算肝體比(HIS，%)、臟體比(VSI，%)、特定生長率(SGR，%/d)、增重率(WGR，%)、飼料系數(shù)(FCR)、存活率(SR，%)、初始平均體重(IBW)和末平均體重(FBW)。

WGR=(Wt-W0)/W0×100%，

SGR=(lnWt-lnW0)/t×100%，

FCR=WF/(Wt-W0)，

VSI=WV/W×100%，

HIS=WH/W×100%，

式中：Wt為第t天末均重，W0為第0天初始均重，t為實驗天數(shù)，WF為飼料消耗總量，WV為內(nèi)臟重量，W為體重，WH為肝胰臟重量。

1.4.2 血清生化指標(biāo)的測定

采用全自動生化分析儀(AU-5800，BECKMAN)檢測血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)的含量。

1.4.3 肝臟、中腸組織病理學(xué)觀察

采用H.E染色的方法[13]對淇河鯽肝臟及中腸進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。在對腸道形態(tài)進(jìn)行觀察時，選取了中腸肌層厚度和腸絨毛高度作為參考指標(biāo)。同批次樣品連續(xù)切片，選取完整的片子進(jìn)行觀察統(tǒng)計，然后取平均值作為每個重復(fù)實驗魚腸絨毛高度、肌層厚度的測定數(shù)據(jù)。

1.4.4 免疫相關(guān)基因的表達(dá)

基于淇河鯽免疫相關(guān)基因cDNA序列，設(shè)計正反向引物(見表2)，并以18S rRNA為內(nèi)參基因。取1 μg總RNA，按照PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser(TaKaRa，大連)試劑說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用羅氏LightCycle 96?熒光定量PCR儀，參照SYBR?Premix ExTaqTM(Tli RNase Plus)(TaKaRa，大連)說明書進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系10 μL：5 μL SYBR?Premix Ex TaqTM(TaKaRa，大連)，0.3 μL PCR Forward Primer(10 μmol/L)，0.3 μL PCR Reverse Primer(10 μmol/L)，1.0 μL cDNA模板，3.4 μL無菌水。擴(kuò)增程序采用兩步法：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個循環(huán)，每個樣品3個平行，2-ΔΔCt法計算淇河鯽實驗樣本中免疫相關(guān)基因的相對表達(dá)量。

表2 實時熒光定量PCR引物Tab.2 Quantitative real-time PCR primers

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行One-Way ANOVA單因素方差分析和Duncan’s多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 山藥皮對淇河鯽生長性能的影響

由表3可以看出，與NC組相比，添加山藥皮的實驗組特定生長率、增重率有升高的趨勢，特定生長率分別提高了9.09%、18.18%、4.54%，增重率分別提高了21.96%、27.49%、17.17%，但差異不顯著；同時飼料系數(shù)與NC組相比有下降趨勢,分別為3.37%、0.67%、2.03%，但差異不顯著。LYP、MYP和HYP組肝體比、臟體比與NC組相比，無顯著差異，但LYP組與MYP組臟體比組間差異顯著。

表3 各組淇河鯽的生長指標(biāo)Tab.3 Growth performance in the C.auratus fed the different diets

2.2 山藥皮對淇河鯽血清生化指標(biāo)的影響

由表4可以看出，與NC組相比，各實驗組總蛋白、白蛋白、球蛋白的含量均有升高趨勢，但無顯著性差異；與NC組相比，谷草轉(zhuǎn)氨酶活性在MYP組顯著性降低，堿性磷酸酶活性在MYP組顯著性升高；谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性在各組間差異不顯著。

表4 各組淇河鯽的血清生化指標(biāo)Tab.4 The values of the blood chemophysiological parameters in the C.auratus in different treatments

注：表中同行數(shù)據(jù)后標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 山藥皮對淇河鯽肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

由圖1發(fā)現(xiàn)，LYP組與NC組相比，細(xì)胞膜與核膜更為完整且核染色質(zhì)密度升高，同時空泡變性減輕，但效果不明顯。MYP組和HYP組肝細(xì)胞大小正常且細(xì)胞間界限相對較清晰，細(xì)胞膜核膜較整齊。

圖1 各組淇河鯽肝臟的組織切片(×400)Fig.1 Histological sections of liver of C.auratus in different treatments(×400)NM：細(xì)胞核偏移；VD：空泡變性

2.4 山藥皮對淇河鯽中腸組織結(jié)構(gòu)的影響

由圖2觀察發(fā)現(xiàn)，MYP和HYP組相較于NC組，腸絨毛結(jié)構(gòu)相對較完整，細(xì)胞清晰，絨毛高度和肌層厚度得到提高。通過對切片進(jìn)行拍照測量得到中腸絨毛高度與肌層厚度的具體數(shù)值(表5)?？煽闯?，與NC組相比，各組鯽中腸絨毛高度與肌層厚度有增高趨勢但不顯著。

圖2 各組淇河鯽中腸組織的切片(×100)Fig.2 Histological sections of mid-gut of C.auratus in different treatmentsV：腸絨毛；M：肌層

表5 各組淇河鯽中腸絨毛高度和肌層厚度Tab.5 The villous height and muscular thickness of mid-gut of C.auratus among different treatmentsμm

2.5 山藥皮對淇河鯽肝臟免疫相關(guān)基因的影響

各實驗組肝臟免疫相關(guān)基因表達(dá)情況如圖3所示。可以看出，在淇河鯽肝臟中，與NC組相比，抑炎基因IL-10的表達(dá)在HYP組顯著上調(diào)。CAT、GST的表達(dá)量，隨添加濃度的升高而升高，與NC組相比，CAT在HYP組具有顯著性，GST在MYP和HYP組表達(dá)量顯著升高。通路相關(guān)因子NF-κB與NC組相比表達(dá)量下降，在MYP組顯著性降低，TLR4在HYP組顯著性升高。

圖3 各組淇河鯽肝臟免疫相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量Fig.3 The relative mRNA expression levels of immune-related genes in C.auratus liver in each group“*”代表與對照組相比有顯著差異(P<0.05)，圖4同。

2.6 山藥皮對淇河鯽中腸免疫相關(guān)基因的影響

各實驗組中腸免疫相關(guān)基因表達(dá)情況如圖4所示。可以看出，在淇河鯽中腸，與NC組相比，炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)量有下降趨勢，抑炎基因IL-10的表達(dá)量在MYP和HYP組顯著上調(diào)。對于IL-10，MYP和HYP組表達(dá)量分別是NC組的4.5倍、4倍，與其他調(diào)控因子相比，實驗各組的上調(diào)幅度較大。CAT在HYP組顯著升高，Claudin-1在LYP和MYP組顯著性升高。與NC組相比，TLR4表達(dá)水平在MHY組顯著升高。

圖4 各組淇河鯽中腸免疫相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量Fig.4 The relative mRNA expression levels of immune-related genes in C.auratus mid-gut in each group

3 討論

3.1 山藥皮對淇河鯽生長指標(biāo)的影響

山藥皮中富含皂甙、黃酮等多種生物活性物質(zhì)，對機(jī)體生長、代謝及免疫力提升均有積極作用。以不同濃度的山藥皮粉飼喂肉仔雞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度的添加劑均對其生長無顯著性差異[14]。Ekenyem等[15]同樣在肉仔雞中以15%的山藥皮粉替代玉米粉，其增重率卻顯著高于對照及其它劑量組。在水產(chǎn)動物研究中，Lawal等[16]以不同濃度山藥皮粉替代玉米粉飼喂革胡子鯰，結(jié)論表明山藥皮粉對其增重率、飼料轉(zhuǎn)化率及特定生長率均無影響，不能作為玉米粉的有效替代物。喬志剛等[17]在黃河鯉基礎(chǔ)飼料中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的懷山藥，發(fā)現(xiàn)其能提高黃河鯉特定生長率、增重率，但效果并不顯著，這與本研究山藥皮對鯉無明顯促生長作用的結(jié)果相似。分析山藥皮在不同動物上促生長效果差異原因，一方面可能與山藥皮中營養(yǎng)物質(zhì)和飼料配方中的營養(yǎng)配比不同相關(guān)，另外魚類相較于畜禽類，其生長受多方面因素影響，魚體本身的特異性與環(huán)境因素亦會影響到飼料添加劑的作用效果。

3.2 山藥皮對淇河鯽血清生化指標(biāo)的影響

血清生化指標(biāo)被認(rèn)為是評價魚類健康水平的重要指標(biāo)之一，它的含量和變化規(guī)律是動物體重要的生物學(xué)特征[18]。肝細(xì)胞受損，細(xì)胞膜通透性增加，血液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶濃度增加，可借谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的變化評價藥物的毒副作用[19]。在本研究中，與NC組相比，添加1%濃度山藥皮的實驗組鯽魚血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性顯著降低。表明在飼料中添加山藥皮，可降低淇河鯽血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性，具有保肝的功效。這與陳鵬飛等[20]的研究結(jié)果相一致。堿性磷酸酶是消化代謝的關(guān)鍵酶，廣泛分布于魚體的血液、組織以及各個器官，其活性能反映動物體的生長速度以及生產(chǎn)性能[21]。堿性磷酸酶還是重要的解毒系統(tǒng)[22]，在血細(xì)胞溶酶體吞噬和包裹病原體時分泌，對外界微生物入侵起水解破壞效果。研究表明，血液中堿性磷酸酶活性提高，可增強(qiáng)機(jī)體對病原的識別和吞噬能力，有利于提高畜禽的生長[20]，鯽血清堿性磷酸酶含量高于NC組，說明魚體的代謝活性增強(qiáng)，利于魚體的生長。

3.3 山藥皮對淇河鯽組織結(jié)構(gòu)的影響

小腸是機(jī)體消化、吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所，腸道健康依賴于正常的生理結(jié)構(gòu)，而小腸的腸絨毛長度、肌層厚度則是評價小腸消化吸收能力的重要依據(jù)[23]。腸絨毛(intestinal villus)是由固有層和腸上皮細(xì)胞向腸腔延伸形成的一個個細(xì)小突起，通常呈柱狀或指狀等。絨毛的長度與腸上皮細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)。腸絨毛長度增加，腸上皮細(xì)胞數(shù)增多，消化吸收能力增強(qiáng)，生長發(fā)育加快[24]。本研究中，實驗組腸絨毛長度及完整性、肌層厚度相較NC組，有一定程度的增加，這表明懷山藥皮對鯽腸道營養(yǎng)物質(zhì)吸收與促生長方面有正向調(diào)節(jié)作用。本研究中，相同放大倍數(shù)下，實驗組肝細(xì)胞與NC組相比，細(xì)胞膜與核膜完整性增強(qiáng)；胞質(zhì)破碎，核溶解、偏移現(xiàn)象消失，說明添加懷山藥皮能一定程度保護(hù)并增強(qiáng)肝臟的完整性，作用機(jī)制可能與多糖的抗氧化能力相關(guān)。在哺乳動物上的研究證實：山藥多糖對肝損傷具有免疫保護(hù)作用[25-26]。

3.4 山藥皮對淇河鯽免疫相關(guān)基因的影響

緊密連接蛋白Claudin-1是腸粘膜機(jī)械屏障的重要組成部分，在調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞通透性、阻礙毒性大分子通過等維護(hù)腸道屏障功能方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[27]。有研究報道，石斛多糖、巖藻多糖均可上調(diào)哺乳動物腸上皮細(xì)胞中Claudin-1的mRNA表達(dá)量，保護(hù)和增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞功能[28，29]。此外，酚類化合物也可影響緊密蛋白結(jié)合的能力，提高腸上皮屏障完整性[30]。本研究中，山藥皮的添加增加了Claudin-1在鯽腸道中的mRNA表達(dá)水平，表明山藥皮的添加可增強(qiáng)對鯽腸道屏障的保護(hù)作用。

過氧化氫酶(CAT)是一類末端氧化酶，可通過清除自由基和降低氧化應(yīng)激，預(yù)防、阻止或減少氧化損傷，來保護(hù)機(jī)體免受疾病的侵襲[31]。而谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)的作用是保護(hù)細(xì)胞免受過氧化損傷，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡，防止外界刺激引起的脂質(zhì)過氧化損傷加劇。本研究中，隨著山藥皮添加濃度增大，肝臟GST表達(dá)量有上升趨勢，并且CATmRNA水平顯著高于對照組，這說明添加懷山藥皮可以增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，減少氧化損傷。

Toll樣受體是連接特異性免疫和非特異性免疫的橋梁，能通過增加細(xì)胞因子的合成和釋放促發(fā)炎癥反應(yīng)，其中TLR4是與免疫相關(guān)的模式識別受體，可以識別并結(jié)合革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁脂多糖，激活NF-κB信號通路，活化巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子表達(dá)[32]。促炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α等，在魚類早期感染和炎癥調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，可通過炎性反應(yīng)提高機(jī)體抗感染能力。抑炎性細(xì)胞因子如IL-10，參與多項免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)，抑制細(xì)胞因子的過度釋放，控制炎癥過程[33]。有研究表明，多糖作為一種有效的免疫刺激物，直接參與巨噬細(xì)胞的活化[34]，通過與靶細(xì)胞上的受體結(jié)合引起免疫反應(yīng)，從而提高魚體的免疫應(yīng)答和抗病性。在本實驗中，添加1%或2%山藥皮可一定程度下調(diào)鯽肝臟、中腸IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達(dá)，上調(diào)IL-10、TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)，表明山藥皮有提高機(jī)體免疫功能，抑制炎癥反應(yīng)的作用。其機(jī)制可能是山藥多糖刺激巨噬細(xì)胞，通過調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，下調(diào)Th1細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)，同時上調(diào)Th2抑炎性細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)，平衡Th1/Th2穩(wěn)態(tài)[35]。

綜上所述，在飼料中添加懷山藥皮，能在一定程度上提高鯽肝臟細(xì)胞的完整性、促進(jìn)腸道腸絨毛長度和肌層厚度增加，對炎性細(xì)胞因子起到調(diào)控作用，從而增強(qiáng)鯽免疫力，加強(qiáng)肝臟和腸道屏障的保護(hù)作用。