陳 杰*，袁 靜，許勇華

(1.浙江農(nóng)林大學(xué) 浙江省綠色農(nóng)藥2011協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州311300；2.浙江省化工研究院有限公司，杭州310023)

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，各種農(nóng)作物病、蟲、草害的頻繁發(fā)生帶來了巨大的損失，嚴(yán)重威脅糧食產(chǎn)量和品質(zhì)。有害生物化學(xué)防治是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐中保證農(nóng)作物高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和品質(zhì)的重要手段。根據(jù)世界糧農(nóng)組織(FAO)評估，通過使用農(nóng)藥進(jìn)行有效的防治，可挽回全世界農(nóng)作物總產(chǎn)量30%～40%的損失。諾貝爾獎獲得者、小麥育種學(xué)家Noman K.Borlang曾經(jīng)說：“沒有農(nóng)藥，人類將面臨饑餓的危險”。農(nóng)藥是農(nóng)業(yè)必需投入品，在近百年的歷程中，農(nóng)藥新品種不斷問世，至今已經(jīng)有681個有效成分，應(yīng)用于市場的登記產(chǎn)品有4萬多。農(nóng)藥創(chuàng)制是一項高投入、高風(fēng)險、高回報的長期項目，新農(nóng)藥品種必須同時滿足“高效、安全、經(jīng)濟(jì)”的要求。據(jù)Phillips McDougall公司統(tǒng)計，成功上市1個新農(nóng)藥品種，平均需要篩選16萬個化合物，耗資約3億美元，耗時12年[1]。作為農(nóng)藥研發(fā)流程中被譽為“眼睛”和“航標(biāo)”之稱的生物活性測定[簡稱生物測定(bioassay)]，貫穿于新化合物結(jié)構(gòu)設(shè)計優(yōu)化、活性發(fā)現(xiàn)、前期研究、開發(fā)登記、生產(chǎn)應(yīng)用到產(chǎn)品生命周期管理(圖1)。隨著具有新作用機(jī)制的農(nóng)藥新品種的不斷問世、新合成方法的產(chǎn)生、外來有害生物的入侵、抗藥性有害生物的發(fā)生以及新型助劑在農(nóng)藥制劑研發(fā)中的應(yīng)用，生物測定技術(shù)水平亟需發(fā)展。筆者根據(jù)多年的工作經(jīng)驗，概述了我國新農(nóng)藥研發(fā)中生物測定的主要內(nèi)容和現(xiàn)狀，并展望其發(fā)展趨勢。

圖1 創(chuàng)制農(nóng)藥研究與開發(fā)評估流程及閘門

1 農(nóng)藥生物測定研究內(nèi)容及作用

農(nóng)藥生物測定(pesticide bioassay)是指運用特定的試驗設(shè)計，利用生物整體或離體的組織、細(xì)胞或酶等靶標(biāo)對農(nóng)藥的反應(yīng)，并以生物統(tǒng)計為工具統(tǒng)計分析測試對象在一定條件下的效應(yīng)，評價某種作用物的生物活性[2]。農(nóng)藥生測現(xiàn)在已發(fā)展成為集昆蟲學(xué)、植物病理學(xué)、微生物學(xué)、植物學(xué)、雜草學(xué)、有機(jī)化學(xué)、分子生物學(xué)、信息學(xué)和統(tǒng)計學(xué)等多學(xué)科于一體的綜合技術(shù)，是農(nóng)藥科技創(chuàng)新工程中不可或缺的關(guān)鍵技術(shù)。農(nóng)藥生測技術(shù)水平?jīng)Q定著新農(nóng)藥創(chuàng)制研發(fā)的進(jìn)程和質(zhì)量。新農(nóng)藥的開發(fā)必須依賴生物活性測定所獲得的各項結(jié)果和信息，以此評價其商品化價值。生物測定是以標(biāo)準(zhǔn)化的靶標(biāo)生物和試驗方法，測定作用物的生物活性、安全性、作用特性、作用方式和應(yīng)用范圍，明確藥劑特性和市場應(yīng)用前景。其研究內(nèi)容：⑴ 創(chuàng)制研究階段生物測定，包括新化合物生物活性篩選，結(jié)構(gòu)與活性構(gòu)效關(guān)系研究，發(fā)現(xiàn)新的作用機(jī)制，高活性化合物深入篩選研究和田間小區(qū)藥效篩選試驗等；⑵ 創(chuàng)制開發(fā)階段即產(chǎn)品登記和市場應(yīng)用階段生物測定，包括農(nóng)藥組合物復(fù)配配方篩選和聯(lián)合毒力測定研究，候選物的區(qū)域性多點多靶標(biāo)田間應(yīng)用技術(shù)研究，農(nóng)藥登記田間藥效試驗、示范推廣試驗和抗性風(fēng)險及其機(jī)理研究等；⑶ 產(chǎn)業(yè)化階段生物測定，包括擴(kuò)大使用范圍，劑型和組合物開發(fā)，抗性監(jiān)測與管理等。

1.1 創(chuàng)制研究階段生物測定

通過標(biāo)準(zhǔn)的試驗方法，以模式化的菌、蟲、草為測試靶標(biāo)，按照規(guī)范的篩選流程，對大量的新物質(zhì)樣品(化合物或提取物)進(jìn)行農(nóng)藥生物活性篩選。主要目的是發(fā)現(xiàn)活性，確證活性大小、溫室效果和作用特性等，初步確定應(yīng)用范圍和防治對象等，發(fā)現(xiàn)新作用方式，提供QSAR數(shù)據(jù)等。

1.1.1 普篩、初篩和復(fù)篩研究

普篩：單一劑量試驗，以菌、蟲、草模式靶標(biāo)生物為測試對象，明確新化合物是否具有農(nóng)藥生物活性。

初篩：設(shè)置 3～5個劑量(濃度)試驗，以普篩有活性的靶標(biāo)為測試對象，確證樣品生物活性，通過活性比較明確構(gòu)效關(guān)系。

復(fù)篩：設(shè)置5～7個劑量的毒力測定試驗，擴(kuò)大試驗靶標(biāo)范圍，明確對敏感作用對象的活性(EC50/90、ED50/90或LC50/90)、防治譜和對作物的安全性，初步評價其潛在的成藥性；對于除草活性化合物，需要求出其對安全性高的作物的 ED10[3]，對于殺蟲或殺菌活性化合物，需要測定對應(yīng)用對象的安全性，并與商品化藥劑進(jìn)行比較，以評價是否可進(jìn)行田間小區(qū)藥效驗證篩選試驗。

田間小區(qū)驗證篩選：復(fù)篩后的進(jìn)篩化合物，在季節(jié)適合的條件下盡快開展田間藥效試驗，在田間自然生態(tài)環(huán)境條件下，對獲得的靶標(biāo)溫室效果和作物安全性結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)，為進(jìn)一步的研究提供依據(jù)。

1.1.2 深入篩選/田間小區(qū)驗證篩選研究

主要開展目標(biāo)物的作用譜、作用特性、作物安全性以及田間小區(qū)藥效試驗等研究，明確化合物的作用特點、防治對象、目標(biāo)市場和使用技術(shù)等，篩選出具有一定應(yīng)用前景的高活性候選物。

深入篩選：在溫室條件下，開展作用方式(芽前/芽后、內(nèi)吸/胃毒/觸殺/熏蒸、保護(hù)/治療等)、作用特性(吸收傳導(dǎo)性、抗雨水沖刷性、持效/殘效等) 和使用技術(shù)(施藥適期、施藥方式、使用劑量及環(huán)境影響因子)等研究，明確活性化合物的應(yīng)用前景，為進(jìn)一步的開發(fā)研究提供科學(xué)依據(jù)。

田間小區(qū)藥效驗證試驗：在田間自然環(huán)境生態(tài)條件下，對篩選出的高活性化合物進(jìn)行藥效和安全性確認(rèn)，以便開展進(jìn)一步研究。

通過深入篩選和田間驗證試驗評價后的化合物為具有一定成藥性的高活性候選物，繼續(xù)開展相關(guān)研究。

1.1.3 高活性候選物篩選研究

主要開展高活性候選物在不同生態(tài)環(huán)境條件下，區(qū)域性多點的田間小區(qū)藥效試驗和使用技術(shù)研究，同時開展公斤級小試工藝、制劑研究和短期的健康和環(huán)境安全性評價等，綜合評估其成藥性。生測的主要研究內(nèi)容：⑴ 通過靶標(biāo)適合區(qū)域多點田間藥效試驗，初步確認(rèn)施藥方式/方法、施藥適期、使用劑量及施藥次數(shù)，明確施藥間隔期、氣候條件對施藥的影響，以及對其他非靶標(biāo)生物和后茬作物的影響等，初步確定其市場應(yīng)用范圍和準(zhǔn)入點；⑵ 開展制劑配方的活性篩選，確定最佳穩(wěn)定制劑產(chǎn)品，進(jìn)行產(chǎn)品登記；⑶ 開展候選物與常規(guī)農(nóng)藥的混配聯(lián)合毒力測定，為后續(xù)市場開發(fā)提供依據(jù)。

對高活性候選物及其制劑綜合評估后進(jìn)行登記開發(fā)，該階段生測結(jié)果是決定其能否進(jìn)入登記開發(fā)的關(guān)鍵要素。

1.2 創(chuàng)制開發(fā)階段生物測定

開展候選物中試產(chǎn)品的使用技術(shù)研究，主要研究內(nèi)容：⑴ 繼續(xù)開展靶標(biāo)適合區(qū)域多點田間藥效試驗，進(jìn)一步確認(rèn)施藥方式/方法、施藥適期、使用劑量、施藥次數(shù)及抗性風(fēng)險預(yù)測，明確施藥間隔期、氣候條件對施藥的影響，以及對其他非靶標(biāo)生物和后茬作物的影響等；⑵ 繼續(xù)開展新制劑生物活性測定和組合物配方篩選，定位新靶標(biāo)、新用途，提高產(chǎn)品性能；⑶ 通過開展靶標(biāo)適合區(qū)域應(yīng)用推廣示范試驗，助力其市場開發(fā)進(jìn)程。

此階段的田間藥效試驗和應(yīng)用技術(shù)研究是決定農(nóng)藥產(chǎn)品登記和未來市場價值評估的關(guān)鍵。對區(qū)域性的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)總結(jié)，明確其市場應(yīng)用推廣技術(shù)要點及注意事項等，指導(dǎo)新產(chǎn)品的正確使用和合理布局；研究結(jié)果既是進(jìn)行農(nóng)藥風(fēng)險評估及風(fēng)險管理決策的基礎(chǔ)，也是進(jìn)行農(nóng)藥登記殘留試驗中制定農(nóng)藥最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)；同時還明確藥劑對作物及非靶標(biāo)有益生物的影響，保證了環(huán)境生態(tài)安全。

同時通過對新制劑和組合物的生測篩選，有利于進(jìn)一步擴(kuò)大產(chǎn)品市場占有率，提高產(chǎn)品的市場競爭力。

1.3 產(chǎn)業(yè)化階段生物測定

如何延長新產(chǎn)品在市場上的生命周期，使其有更長壽命，獲得最大的經(jīng)濟(jì)效益，是該階段生測技術(shù)研究的重點目標(biāo)。

1.3.1 混配產(chǎn)品研發(fā)是延長產(chǎn)品壽命的基本手段

通過對前期的大量試驗數(shù)據(jù)總結(jié)，掌握新產(chǎn)品特點，挖掘其自身潛力，結(jié)合農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中病、蟲、草害發(fā)生情況和市場產(chǎn)品動態(tài)，開發(fā)混配制劑產(chǎn)品，擴(kuò)大防治譜和使用范圍，以提高產(chǎn)品市場占有率和競爭力。同時根據(jù)防治對象發(fā)生規(guī)律，研究新的使用方法，制定新的防治措施，如甲維鹽[methylamino abamectin benzoate (salt)]作為廣譜殺蟲劑，普遍采用噴霧方法施用，但噴霧施用難以有效防治松材線蟲病，而采用注干方法，防效達(dá)80%以上[4]。

1.3.2 抗性監(jiān)測管理是延長產(chǎn)品壽命的重要手段

長期頻繁使用某一種農(nóng)藥品種導(dǎo)致有害生物產(chǎn)生抗性。植物病、蟲、草產(chǎn)生抗藥性以后，再用這種藥劑防治時，不僅藥劑使用濃度、使用次數(shù)增加及防治費用成倍提高，而且還會加重農(nóng)藥對環(huán)境的污染和對有益生物的危害，縮短產(chǎn)品生命周期。為了延緩抗藥性產(chǎn)生，通過農(nóng)藥抗性監(jiān)測，進(jìn)行抗性風(fēng)險評估，制定抗性治理策略，也是農(nóng)藥生物測定的重要工作之一。不同作用機(jī)制的產(chǎn)品混配使用是抗性治理的措施之一，如氟環(huán)唑和吡唑醚菌酯混配，延緩了后者的抗性產(chǎn)生，延長了產(chǎn)品的使用壽命。

1.3.3 利用新技術(shù)和新理論延長產(chǎn)品生命周期

新農(nóng)藥研發(fā)具有周期長、投入多、風(fēng)險高和回報高的特點，延長產(chǎn)品使用壽命是提高回報的重要途徑。隨著產(chǎn)品在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的頻繁、長期使用，以及不斷擴(kuò)大的應(yīng)用市場，需要新技術(shù)、新理論等手段解決藥效減弱和環(huán)境安全等問題，以延長其生命周期。如草甘膦(glyphosate)的應(yīng)用持續(xù)增長得益于孟山都公司轉(zhuǎn)基因技術(shù)；汽巴-嘉基公司提出抗病激活劑(plant activator)理論；日本明治制果株式會社將烯丙苯噻唑(probenazole)應(yīng)用于水稻育苗[5]，2011年銷售額達(dá)到1.20億美元，成為全球最大的抗病激活劑；巴斯夫公司開發(fā)的甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑吡唑醚菌酯(pyraclostrobin)，為了解決因其對水生生物的毒性而限制在水稻上的應(yīng)用問題，公司開展大量的篩選研究，開發(fā)的新微囊懸浮劑配方中使用專利微膠囊技術(shù)，確保霧滴在水稻葉片上迅速釋放，對病害產(chǎn)生最佳的預(yù)防和防治效果，而少量落入稻田水中的微膠囊迅速沉入底泥避免其對魚類的暴露。研究中需要對微囊懸浮技術(shù)配方的每個參數(shù)進(jìn)行大量的測試以確定其生物防效及其對水生生物的毒性潛力。此外，在田間推廣試驗中發(fā)現(xiàn)該藥劑的促生作用后，研究發(fā)現(xiàn)該藥劑作用機(jī)制獨特，保健增產(chǎn)效果明顯，成為全球第一個以“植物健康作用”登記的殺菌劑。當(dāng)然這些新技術(shù)、新產(chǎn)品研發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)需要研究新的生測技術(shù)給予相應(yīng)評價。

2 我國創(chuàng)制農(nóng)藥生物測定研究進(jìn)展

我國農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)經(jīng)過70年的發(fā)展，發(fā)生了翻天覆地的變化，目前我國已經(jīng)成為農(nóng)藥生產(chǎn)大國和全球最大的農(nóng)藥出口國。2017年，農(nóng)藥產(chǎn)量已超過300萬t，出口量超過150萬t。我國農(nóng)藥經(jīng)歷了仿制為主、仿中有創(chuàng)、仿創(chuàng)結(jié)合、創(chuàng)制為主、自主創(chuàng)新的歷程。20世紀(jì) 50年代后期，中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所合成了乙基大蒜素(ethyl allicin)[6]，60年代沈陽化工研究院試制成功除草醚(nithophen)，從新中國第一個創(chuàng)制農(nóng)藥產(chǎn)品多菌靈(carbendazim)[7,8]，到我國首個獲得中、美、歐等多國發(fā)明專利的創(chuàng)制農(nóng)藥品種氟嗎啉(flumorph)[8,9]，創(chuàng)制農(nóng)藥品種陸續(xù)問世，到目前為止創(chuàng)制的農(nóng)藥品種有50多個。農(nóng)藥生物測定在農(nóng)藥研究中發(fā)揮著重大作用，近20年來，隨著具有中國特色農(nóng)藥研發(fā)體系的形成和穩(wěn)步發(fā)展，農(nóng)藥生物測定技術(shù)逐步完善，形成越來越科學(xué)的評價體系。

2.1 室內(nèi)生物測定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化

室內(nèi)生測技術(shù)是研究作用物、靶標(biāo)生物和反應(yīng)強度三者關(guān)系的一項專門技術(shù)，是測定被試物在一定的環(huán)境條件下對試驗靶標(biāo)的作用。該技術(shù)對供試靶標(biāo)生物、測試的環(huán)境條件、試驗設(shè)計及結(jié)果分析等均提出了嚴(yán)格的要求。其首要條件就是培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化靶標(biāo)生物，靶標(biāo)生物的生理狀態(tài)不同對作用物具有不同的反應(yīng)，為了保證測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，供試生物要有足夠數(shù)量和良好質(zhì)量。從20世紀(jì)90年代開始，政府和企業(yè)十分重視農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域創(chuàng)新體系建設(shè)，加大研發(fā)投入，其關(guān)鍵的生測技術(shù)研究和體系建設(shè)得以快速發(fā)展。多家實驗室建立了環(huán)境條件可控的養(yǎng)蟲室、植物培養(yǎng)室、人工氣候室和溫室，規(guī)范了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)生的、具有代表性的有害昆蟲、病原菌、雜草和衛(wèi)生倉儲害蟲等靶標(biāo)的培養(yǎng)方法，如小菜蛾[Plutella xylostella(Linnaeus)]、黏蟲[Mythimna separata(Walker)]、苜蓿蚜(Aphis craccivoraKoch)、水稻褐飛虱[Nilaparvata lugens(Stal)]和朱砂葉螨(Tetranychus cinnabarinusBoiduval)等已經(jīng)成為新藥篩選的模式靶標(biāo)。此外，農(nóng)業(yè)重要害蟲棉鈴蟲[Helicoverpa armigera(Hübner)]、甜菜夜蛾[Spodoptera exigua(Hübner)]和斜紋夜蛾[Spodoptera litura(Fabricius)]、桃蚜[Myzus persicae(Sulzer)]和西花薊馬[Frankliniella occidentalis(Pergande)]等均已實現(xiàn)常年累代飼養(yǎng)[10]。建立了殺菌劑生測靶標(biāo)黃瓜霜霉病菌[Pseudoperonospora cubensis(Berk.et Curt.)Rostov.]、黃瓜白粉病菌(Erysiphe cichoracearumDC)和水稻紋枯病菌[Thanatephorus Cucumeris(Frank) Donk]等45種病原菌保存和培養(yǎng)方法[11]，并能保存和培養(yǎng)稗草[Echinochloa crusgalli(L.) Beauv]、牛筋草[Eleusine indica(L.) Gaertn.]和反枝莧(Amaranthus retroflexusL.)等70多種農(nóng)田重要的禾本科、闊葉和莎草科雜草[12]。建立了規(guī)范的殺蟲劑毒力測定方法50多種[10]，殺菌劑活體盆栽法20多種[11]，除草劑室內(nèi)生測方法30 多種[12]。

為了保證試驗方法的一致性，國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部從2006年開始，陸續(xù)發(fā)布行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《農(nóng)藥室內(nèi)生物測定試驗準(zhǔn)則》《農(nóng)藥對作物安全性評價準(zhǔn)則》《農(nóng)藥抗性風(fēng)險評估》，對殺蟲劑、殺菌劑、除草劑以及植物生長調(diào)節(jié)劑的室內(nèi)生物活性、作物安全性、抗性風(fēng)險評估試驗方法進(jìn)行了規(guī)范和統(tǒng)一。目前建立了《農(nóng)藥室內(nèi)生物測定試驗準(zhǔn)則》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)殺蟲劑14個(NY/T1154.1～14-2006)[13]、除草劑 11個(NY/T 1155.1～11-2006)[14]、殺菌劑 19 個(NY/T 1156.1～19-2006)[15]，建立農(nóng)藥對作物安全性評價行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)3個[16]，建立農(nóng)藥抗性風(fēng)險評估行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)12個[17-19]。行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)從試驗靶標(biāo)、儀器設(shè)備、試材準(zhǔn)備、藥劑配制、試驗處理、試驗調(diào)查、數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析等方面對農(nóng)藥室內(nèi)生物測定進(jìn)行了全面的規(guī)范，目前已成為我國開展農(nóng)藥室內(nèi)生物測定試驗的主要依據(jù)。

2.2 田間藥效試驗管理規(guī)范化

農(nóng)藥田間藥效試驗主要內(nèi)容：⑴ 明確防治效果及應(yīng)用技術(shù)試驗，如農(nóng)藥新品種、新劑型的篩選試驗，農(nóng)藥產(chǎn)品(包括不同制劑、復(fù)配制劑、農(nóng)藥混用等)之間效果比較試驗，對有害生物的防治適期、最佳劑量和最佳施用次數(shù)的研究試驗，不同使用方式及環(huán)境與耕作栽培條件對藥效的影響試驗等。⑵ 農(nóng)藥對試驗作物的影響試驗，如農(nóng)藥對作物安全性、產(chǎn)量、品質(zhì)和抗逆性等的影響。⑶ 農(nóng)藥對鄰近作物及天敵的影響試驗，如農(nóng)藥對試驗區(qū)域鄰近作物的影響，主要是對天敵等非靶標(biāo)生物的影響。

田間藥效試驗結(jié)果是進(jìn)行農(nóng)藥產(chǎn)品市場應(yīng)用價值評估、殘留或其他登記試驗劑量設(shè)置、市場經(jīng)濟(jì)效益分析、產(chǎn)品生命周期管理的關(guān)鍵數(shù)據(jù)。為了保證結(jié)果真實、準(zhǔn)確、可溯源，田間藥效試驗質(zhì)量規(guī)范管理非常重要。1985年FAO發(fā)布了《農(nóng)藥登記藥效資料要求》，2002年FAO重新修訂《農(nóng)藥銷售和使用行為國際準(zhǔn)則》對藥效試驗提出了相應(yīng)要求，2006年 FAO制定《農(nóng)藥登記藥效評審準(zhǔn)則》[20]，要求藥效試驗遵循良好試驗操作(Good Experimental Practice，GEP)。此外，1992 年 EPPO 發(fā)布“Standards for efficacy evaluation of plant protection products”，之后于1996年、2003年和2012年進(jìn)行了修訂。FAO和EPPO都對田間藥效試驗單位及人員、試驗藥劑、施藥器械和條件、試驗方案、試驗程序、原始記錄和結(jié)果分析等做了規(guī)范性要求，同時必須建立試驗標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程(SOP)。

我國田間藥效試驗的規(guī)范和管理也在持續(xù)進(jìn)行，先于2000年頒布《農(nóng)藥田間藥效試驗準(zhǔn)則(一)》[21]，后于2004年頒布《農(nóng)藥田間藥效試驗準(zhǔn)則(二)》[22]，制定了上百項農(nóng)藥登記田間藥效試驗準(zhǔn)則，并陸續(xù)發(fā)布行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，指導(dǎo)登記農(nóng)藥田間藥效試驗技術(shù)。同時相繼出臺管理辦法，如《農(nóng)藥登記藥效試驗認(rèn)證管理辦法》《農(nóng)藥登記田間藥效試驗報告編寫要求》等，逐步要求試驗單位遵循GEP。2014年，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所依據(jù)GEP要求，組織行業(yè)專家著手起草，并多次組織討論“農(nóng)藥登記田間藥效試驗規(guī)范”，于2016年5月23日發(fā)布《NY/T 2885-2016農(nóng)藥登記田間藥效試驗質(zhì)量管理規(guī)范》[23]。2017年2月8日，國務(wù)院通過新的《農(nóng)藥管理條例》，條例自2017年6月1日起施行。在此背景下，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布2570號公告《農(nóng)藥登記試驗質(zhì)量管理規(guī)范》，加強并規(guī)范了包括田間藥效試驗在內(nèi)的農(nóng)藥登記試驗管理，確保了農(nóng)藥登記試驗數(shù)據(jù)的完整性、可溯源和真實性。至此，我國農(nóng)藥藥效試驗管理與國際接軌。截止2020年2月5日，已經(jīng)有81家試驗機(jī)構(gòu)獲得符合《農(nóng)藥登記試驗質(zhì)量管理規(guī)范》的田間藥效試驗資質(zhì)。

2.3 生物測定在新農(nóng)藥研發(fā)中逐漸成熟

我國農(nóng)藥生物測定起于20世紀(jì)60年代并逐步發(fā)展，在“九五”“十五”期間，形成以沈陽化工研究院、南開大學(xué)為依托單位的國家北方農(nóng)藥創(chuàng)制中心和以浙江省化工研究院、江蘇省農(nóng)藥研究所、湖南化工研究院、上海農(nóng)藥研究所為依托單位的國家南方農(nóng)藥創(chuàng)制中心。同時，一些高等學(xué)校、科研院所及農(nóng)藥企業(yè)也建立了農(nóng)藥創(chuàng)新研究中心?？萍疾客ㄟ^科技攻關(guān)計劃，支持農(nóng)藥新品種創(chuàng)制研究、生測技術(shù)研究、創(chuàng)制農(nóng)藥生物活性篩選標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)體系建設(shè)研究，使我國農(nóng)藥生物測定技術(shù)和方法立足實際需求，本著“邊建設(shè)邊運行邊出成果”的原則，建立了規(guī)范、系統(tǒng)、可行的農(nóng)藥生物活性篩選評價體系及操作規(guī)程。“十一五”“十二五”期間，國家科技支撐計劃繼續(xù)支持農(nóng)藥新品種創(chuàng)制和生物測定技術(shù)研究，通過生物測定技術(shù)研究課題，新增和規(guī)范了病、蟲、草重要測試靶標(biāo)的室內(nèi)培養(yǎng)和生測篩選技術(shù)，開發(fā)了基于分子生物學(xué)的高通量篩選方法和微量快速篩選技術(shù)，對病、蟲、草抗性靶標(biāo)進(jìn)行了抗性突變和機(jī)理研究，并將抗性靶標(biāo)應(yīng)用于反抗性農(nóng)藥篩選。在遼寧、浙江和湖南等地建立了規(guī)范化的田間試驗示范基地，規(guī)范和完善了農(nóng)藥生物活性篩選技術(shù)體系。一些新靶標(biāo)、新方法已經(jīng)應(yīng)用于新農(nóng)藥研究，提高了農(nóng)藥的創(chuàng)新能力和開發(fā)效率。經(jīng)過多年的研究和實踐積累，我國的生測技術(shù)取得突破性進(jìn)展。

目前新化合物合成能力已達(dá)到3萬個/年，生測篩選能力達(dá)到6萬個/年[24]。篩選出我國具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新農(nóng)藥品種近50個，其中四氯蟲酰胺、氰烯菌酯、噻唑鋅和喹草酮等新產(chǎn)品已經(jīng)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用，還在開發(fā)過程中的新產(chǎn)品即將閃亮登場。

2.4 新農(nóng)藥登記管理中抗性風(fēng)險評估備受重視

新農(nóng)藥使用2～20年，一些主要有害生物即出現(xiàn)抗性，全世界至少有600種害蟲及害螨對一種或多種殺蟲劑產(chǎn)生了抗性，其中小菜蛾、棉蚜和溫室白粉虱等已對常用殺蟲劑產(chǎn)生了較高的抗性水平[25]；從1992年至今，我國已有 44例抗性雜草報道，其中稗草、雨久花、日本看麥娘和播娘蒿等雜草抗性發(fā)展嚴(yán)重[26-28]；植物病原菌抗性更是不斷發(fā)展，灰霉病菌、霜霉病菌及白粉病菌等已對多種藥劑產(chǎn)生了不同程度的抗性[29]。吡蟲啉是用于防治褐飛虱的第一個商品化新煙堿類藥劑，邵振潤等對多地稻飛虱進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)褐飛虱對其產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性[30]。我國學(xué)者在監(jiān)測水稻褐飛虱、白背飛虱對吡蟲啉等煙堿類抗性的同時，對其交互抗性和抗性機(jī)制等均進(jìn)行了研究[31-34]。

為了延緩有害生物抗藥性的發(fā)展，需對農(nóng)藥的抗性風(fēng)險進(jìn)行評估和管理。1999年EPPO首次發(fā)布EPPO Efficacy evaluation of plant protection products——PP 1/213 (4) Resistance risk analysis，并分別于2002、2012和2015對其進(jìn)行修訂完善[35]。歐盟 (歐共體) 也早在2009年統(tǒng)一要求申請者在藥物登記的過程中提供可能出現(xiàn)和抗性發(fā)生有關(guān)的信息。我國于2010年頒布了《農(nóng)藥抗性風(fēng)險評估總則》，隨后出臺了 12條行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[17-19]，規(guī)范了抗藥性評估方法。要求在登記新農(nóng)藥和涉及新使用范圍的化學(xué)農(nóng)藥時，原則上應(yīng)提供抗性風(fēng)險評估資料。按殺蟲劑、殺菌劑、除草劑分別建立應(yīng)開展抗性風(fēng)險評估的靶標(biāo)生物和化合物清單，實行分類管理。

3 展 望

我國新農(nóng)藥創(chuàng)制起步較晚，“九五”期間在國家的大力支持下，建立了南北方6個農(nóng)藥創(chuàng)制研究基地生測中心，開啟了為創(chuàng)制農(nóng)藥測定生物活性的研究之路。經(jīng)過20余年的發(fā)展，從設(shè)施、設(shè)備到測試靶標(biāo)、方法、活性評價標(biāo)準(zhǔn)和篩選模式等建立了基本符合我國農(nóng)藥生物活性篩選的平臺，也組建了專業(yè)配套的研究隊伍。近10年來，國內(nèi)數(shù)家農(nóng)藥企業(yè)相繼組建了農(nóng)藥生測研究團(tuán)隊，生物測定技術(shù)取得較大的進(jìn)展。但是我國農(nóng)藥企業(yè)總體上在生測方面缺乏先進(jìn)技術(shù)和設(shè)施，對生測的研發(fā)重視程度不夠，人力和財力投入不足，與國際農(nóng)藥公司相比差距仍然很大。生測技術(shù)的適用性、先進(jìn)性和系統(tǒng)性已成為制約我國綠色生態(tài)農(nóng)藥品種研發(fā)的瓶頸因素。

農(nóng)藥生物測定是一門重要的實用和實踐科學(xué)，其研究內(nèi)容隨著農(nóng)藥的發(fā)展不斷得到加強和豐富。農(nóng)藥研發(fā)定位慣以市場為導(dǎo)向，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)生的危害嚴(yán)重的病、蟲、草就是新農(nóng)藥產(chǎn)品研發(fā)的市場所在。近年來，隨著土地流轉(zhuǎn)，農(nóng)藥不科學(xué)的頻繁使用，農(nóng)產(chǎn)品結(jié)構(gòu)和耕作制度的改變，加之自然氣候、環(huán)境條件變化，導(dǎo)致病、蟲、草種群及其敏感性隨之變化，抗藥性持續(xù)加劇和低效藥劑等問題突出，如稻飛虱、小菜蛾、白粉病、灰霉病、稗草和播娘蒿等有害生物的抗藥性呈指數(shù)增長。2012-2016年對水稻褐飛虱田間種群抗藥性監(jiān)測結(jié)果顯示，其對吡蟲啉抗藥性達(dá)132.0～8 478.0倍[36]。急需高效、低毒、無殘留的農(nóng)藥新產(chǎn)品、新劑型產(chǎn)品投入市場。因此，需要研究和發(fā)展重要標(biāo)準(zhǔn)化的生測靶標(biāo)、科學(xué)的試驗方法和評價體系等技術(shù)。

近些年來，隨著基因編輯、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、化學(xué)生物學(xué)和大數(shù)據(jù)智能化等技術(shù)發(fā)展，并向農(nóng)藥創(chuàng)新領(lǐng)域的滲透，催生了RNA干擾和免疫激活蛋白等全新機(jī)制農(nóng)藥。如孟山都公司開發(fā)出阻止害蟲或病原基因表達(dá)、防治玉米蟲害和病害的 RNA噴劑BioDirect；昆士蘭大學(xué)研發(fā)出通過修飾植物基因表達(dá)提高抗病毒能力的 RNA噴霧農(nóng)藥 BioClay(LDH-dsRNA)。目前我國尚缺乏這些全新機(jī)制農(nóng)藥的生測技術(shù)。

總之，作為“眼睛”的發(fā)現(xiàn)新農(nóng)藥的生物測定技術(shù)面臨極大的挑戰(zhàn)。未來，隨著人工智能、分子生物學(xué)、遺傳工程技術(shù)、遙感定位系統(tǒng)和信息智能化的飛速發(fā)展，以及化學(xué)農(nóng)藥分子設(shè)計與作用機(jī)制研究的不斷深入，相信越來越多先進(jìn)的生測新方法、新技術(shù)將不斷應(yīng)用于我國綠色農(nóng)藥創(chuàng)新研究中，為綠色創(chuàng)制農(nóng)藥發(fā)現(xiàn)和科學(xué)使用提供關(guān)鍵支撐，為農(nóng)產(chǎn)品提質(zhì)增產(chǎn)保駕護(hù)航。