王昌錦，趙燕杰，康占海，王金芳，劉細(xì)平，陶 婧，徐 妍*

(1.北京宇?lèi)偵锟萍加邢薰荆本?100085；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北保定 200020)

吡唑醚菌酯(pyraclostrobin)，化學(xué)名稱(chēng)為N-{2-[1-(4-氯苯基)-1H-吡唑-3-氧甲基]苯基}-(N-甲氧基)氨基甲酸甲酯，是巴斯夫于 1993年開(kāi)發(fā)的目前活性最高的甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑。該農(nóng)藥是全球第一個(gè)以“植物健康作用”登記的產(chǎn)品，其通過(guò)高效抑制病菌線(xiàn)粒體的呼吸作用并抑制病菌孢子萌發(fā)能力，從而發(fā)揮藥效[1-2]。乙嘧酚(ethirimol)化學(xué)名稱(chēng)為 5-丁基-2-乙基氨基-4-羥基-6-甲基嘧啶，是由先正達(dá)公司開(kāi)發(fā)的嘧啶類(lèi)殺菌劑，可被植物根、莖、葉迅速吸收并快速運(yùn)輸?shù)街参矬w的各個(gè)部位，從而達(dá)到保護(hù)的效果，其持效期較長(zhǎng)[3-4]。

30%吡唑醚菌酯·乙嘧酚懸浮劑是由北京宇?lèi)偵锟萍加邢薰鹃_(kāi)發(fā)的殺菌劑品種，由20%的吡唑醚菌酯和10%的乙嘧酚復(fù)配而成。藥效試驗(yàn)證明，它是一種高效廣譜的殺菌劑，具有較高的生物活性和突出的增產(chǎn)作用，可用于防治子囊菌、擔(dān)子菌、半知菌和卵菌綱真菌引起的多種病害，并通過(guò)抑制病原孢子侵入，全面控制白粉病病菌。該劑廣泛用于防治小麥、水稻和蔬菜等農(nóng)作物病害[5-6]。然而，目前有關(guān)該混劑產(chǎn)品同條件分析方法尚未見(jiàn)報(bào)道?；诖?，本文利用反相高效液相色譜法，采取 C18反相柱以及紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器，對(duì)有效成分進(jìn)行了分析和定量。此方法同時(shí)適用于吡唑醚菌酯(乙嘧酚)原藥以及制劑的分析，具有快捷簡(jiǎn)便、靈敏準(zhǔn)確、重復(fù)性好的特點(diǎn)，適用于產(chǎn)品質(zhì)量的檢測(cè)分析。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀配有紫外檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器和Agilent色譜工作站。

水為新蒸二次蒸餾水；乙腈為色譜純；吡唑醚菌酯標(biāo)樣：純度≥99.0% (北京宇?lèi)偵锟萍加邢薰咎峁?；乙嘧酚標(biāo)樣：純度≥99.0% (北京宇?lèi)偵锟萍加邢薰咎峁?；30%吡唑醚菌酯·乙嘧酚懸浮劑(北京宇?lèi)偵锟萍加邢薰咎峁?。

1.2 色譜條件

色譜柱：采用ZORBAX SB C18(150 mm×4.6 mm i.d.，5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)：235 nm；流動(dòng)相：乙腈∶水=85∶15(體積比)；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：30 ℃。在上述色譜條件下，吡唑醚菌酯和乙嘧酚的保留時(shí)間分別約為2.9 min和4.8 min (圖1、圖2)。

圖1 吡唑醚菌酯和乙嘧酚標(biāo)樣液相色譜圖

圖2 30%吡唑醚菌酯·乙嘧酚懸浮劑試樣液相色譜圖

1.3 溶液配制

1.3.1 標(biāo)樣溶液的配制

稱(chēng)取吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)品約 0.05 g、乙嘧酚標(biāo)準(zhǔn)品約0.1 g (精確至0.000 2 g)于100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解后，用超聲波脫氣10 min，使標(biāo)樣全部溶解，冷卻至室溫，定容，搖勻備用。

1.3.2 試樣溶液的配制

首先稱(chēng)試樣0.5 g (精確至0.000 2 g)于100 mL的容量瓶中，用流動(dòng)相溶解后，在超聲波清洗器上脫氣10 min，使試樣全部溶解，冷卻至室溫，定容，搖勻，用0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后備用。

1.4 測(cè)定

在上述色譜操作的條件下，待儀器基線(xiàn)穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針的標(biāo)樣溶液，計(jì)算各針的相對(duì)響應(yīng)值，直至相鄰 2針吡唑醚菌酯(或乙嘧酚)響應(yīng)值的相對(duì)變化量小于1.2%時(shí)，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測(cè)定。用外標(biāo)法計(jì)算各自含量。

1.5 計(jì)算

將測(cè)得的2針試樣溶液以及試樣前后2針標(biāo)樣溶液中的吡唑醚菌酯(或乙嘧酚)峰面積分別進(jìn)行平均。試樣中吡唑醚菌酯(或乙嘧酚)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)w(%)按照下式計(jì)算：

式中：A1為標(biāo)樣溶液中吡唑醚菌酯(或乙嘧酚)峰面積的平均值；A2為試樣溶液中吡唑醚菌酯(或乙嘧酚)峰面積的平均值；m1為標(biāo)樣質(zhì)量，g；m2為試樣質(zhì)量，g；P為標(biāo)樣中吡唑醚菌酯(或乙嘧酚)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%(m/m)；5為稀釋因子。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相的選擇是決定液相色譜分離效果的關(guān)鍵所在。通過(guò)試用不同比例的甲醇、水，乙腈、水作為流動(dòng)相對(duì)試樣進(jìn)行分離檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，采用乙腈、水作為流動(dòng)相分離效果好，出峰時(shí)間短，且峰型尖銳，最終選定流動(dòng)相的比例為乙腈∶水=85∶15(體積比)。

2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

通過(guò)對(duì)吡唑醚菌酯和乙嘧酚進(jìn)行紫外掃描，得到其相應(yīng)的吸收波長(zhǎng)與響應(yīng)值的紫外吸收光譜圖。當(dāng)選用235 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，吡唑醚菌酯和乙嘧酚均有較強(qiáng)吸收峰，同時(shí)雜質(zhì)響應(yīng)值小，流動(dòng)相無(wú)吸收。因此，為兼顧兩者均有較好的吸收，將檢測(cè)波長(zhǎng)選為235 nm。

2.2 特異性的測(cè)定

本試驗(yàn)方法采用 HPLC-DAD峰純度分析法來(lái)鑒別。吡唑醚菌酯HPLC-DAD中的最小峰純度相似度均為1.000 000，最小峰純度閥值為0.999 284，最小峰純度指數(shù)為正值，說(shuō)明樣品色譜峰中不含有雜質(zhì)峰；乙嘧酚HPLC-DAD中的最小峰純度相似度為1.000 000，最小峰純度閥值為0.999 486，最小峰純度指數(shù)為正值，說(shuō)明樣品色譜峰中不含有雜質(zhì)峰。標(biāo)樣液相色譜峰與試樣液相色譜峰出峰時(shí)間差在1.0%以?xún)?nèi)，如圖1和圖2所示。制劑中峰純度色譜圖如圖3和圖4所示。

圖3 制劑中吡唑醚菌酯HPLC-DAD峰純度色譜圖

圖4 制劑中乙嘧酚HPLC-DAD峰純度色譜圖

2.3 線(xiàn)性相關(guān)性測(cè)定

配制吡唑醚菌酯(乙嘧酚)一系列不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的標(biāo)樣溶液，按照上述色譜操作條件，測(cè)定相應(yīng)的響應(yīng)值，并且以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，從而得到吡唑醚菌酯和乙嘧酚的線(xiàn)性相關(guān)性曲線(xiàn)。吡唑醚菌酯線(xiàn)性方程是：y=10 827x-1 781(圖5)，相關(guān)系數(shù)為0.999 5；乙嘧酚的線(xiàn)性方程是：y=757 26x+436 942(圖6)，相關(guān)系數(shù)為0.999 5。

圖5 吡唑醚菌酯線(xiàn)性關(guān)系圖

圖6 乙嘧酚線(xiàn)性關(guān)系圖

2.4 分析方法的精密度測(cè)定

在上述色譜操作條件下，對(duì)同一30%吡唑醚菌酯·乙嘧酚懸浮劑樣品平行測(cè)定5次，吡唑醚菌酯和乙嘧酚的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.06和0.08，變異系數(shù)分別為0.58%和0.42%，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5 分析方法的準(zhǔn)確度測(cè)定

稱(chēng)取5個(gè)已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的30%吡唑醚菌酯·乙嘧酚懸浮劑樣品，分別加入一定量的吡唑醚菌酯和乙嘧酚標(biāo)準(zhǔn)品，按照上述色譜條件測(cè)定樣品的吡唑醚菌酯和乙嘧酚總質(zhì)量，并計(jì)算其平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表 2。吡唑醚菌酯和乙嘧酚的平均回收率分別為100.03%和100.10%。

表1 30%吡唑醚菌酯·乙嘧酚懸浮劑分析方法的精密度試驗(yàn)結(jié)果

表2 30%吡唑醚菌酯·乙嘧酚懸浮劑回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.6 非分析物干擾的試驗(yàn)

在評(píng)價(jià)準(zhǔn)確度時(shí)，通常需要包含非分析物質(zhì)的干擾，因?yàn)橛行С煞种械娜魏胃蓴_物都會(huì)導(dǎo)致分析方法出現(xiàn)系統(tǒng)誤差。而且，在分析時(shí)應(yīng)同時(shí)測(cè)定不帶有效成分的空白樣品，或證明其無(wú)干擾。通過(guò)對(duì)溶劑(乙腈)、空白樣品(不含有效成分的助劑)、原藥等按分析方法1.2進(jìn)行分析，溶劑(乙腈)、原藥及不含有效成分助劑空白，對(duì)分析無(wú)干擾；分離度高于1.5%，因此均不影響相互定性定量分析；因此本文的分析方法未受到非分析物干擾。

3 結(jié) 論

本文建立了30%吡唑醚菌酯·乙嘧酚懸浮劑中有效成分的分析方法，此方法具有高精密度和高準(zhǔn)確度的特點(diǎn)，其線(xiàn)性關(guān)系良好，試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，是進(jìn)行在線(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)較理想的分析方法。