郭凈潔，王 崇，張維甲，杜 超，李國林

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)簡稱口腔鱗癌，是最常見的口腔癌[1]。其復(fù)發(fā)率約為10%～30%,五年存活率為50%,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和局部侵襲是其預(yù)后不佳的主要原因[2-3]。因此如何有效地抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是控制其復(fù)發(fā)、提高生存率的關(guān)鍵因素。

黃芩素(baicalein)和黃芩苷(baicalin)是從中藥黃芩的干燥根中提取的黃酮類單體，具有抗炎、抗氧化、保護(hù)心腦血管等作用[4]。黃芩中含量最高的黃酮類化合物為黃芩素，其與一分子葡萄糖醛酸結(jié)合可形成黃芩苷[5]。研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素進(jìn)入動物體內(nèi)后，在血液中迅速轉(zhuǎn)換為黃芩苷及其他產(chǎn)物；黃芩苷口服后，需在腸道內(nèi)酶解為黃芩素方能吸收入血，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為黃芩苷[6]。近些年來,黃芩素和黃芩苷因有著較好的抗腫瘤效果，受到越來越多的關(guān)注[7]。王根桃等[8]發(fā)現(xiàn)黃芩素可以通過ERK-FAK信號通路來達(dá)到抑制口腔鱗癌的增殖能力。鐘文德等[9]證實(shí)黃芩苷可有效抑制人舌鱗癌細(xì)胞的遷移能力。有研究發(fā)現(xiàn)黃芩素與黃芩苷聯(lián)合應(yīng)用對肝癌細(xì)胞有明顯的抑制作用[10]。而兩藥聯(lián)合作用于口腔鱗癌的研究在國內(nèi)外尚未見報(bào)道。此外,有文獻(xiàn)稱EMT在腫瘤的轉(zhuǎn)移中起到重要作用[11]。因此本課題旨在探討黃芩素與黃芩苷聯(lián)合應(yīng)用對口腔鱗癌細(xì)胞增殖、遷移能力的影響，以及是否通過影響EMT進(jìn)程來實(shí)現(xiàn)對口腔鱗癌的抑制作用。以期為口腔腫瘤的治療提供一種新的方法與思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

CAL-27口腔鱗癌細(xì)胞株為哈爾濱醫(yī)科大學(xué)轉(zhuǎn)化中心實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫保存；黃芩素、黃芩苷(上海源葉生物科技有限公司，純度>98%)，DMEM、胰蛋白酶(Hyclone公司，美國)；雙抗(GIBCO公司，美國)；胎牛血清(Biowest公司，美國)；二甲基亞砜(DMSO，國產(chǎn)分析純，上海國藥集團(tuán))；四甲基偶氮唑鹽 (MTT，Sigma公司，美國)；E-鈣粘抗體(E-cadherin，Abcam公司，美國)；N-鈣粘抗體(N-cadherin，Abcam公司，美國)；酶標(biāo)儀購自美國Biotek公司；超凈工作臺購自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 主要試劑的配制

黃芩素溶液：準(zhǔn)確稱取20 mg黃芩素粉末，溶于100 μL DMSO中，配制成 200 g/L的母液，0.22 μL孔徑濾器過濾，-20 ℃保存。

黃芩苷溶液：準(zhǔn)確稱取20 mg黃芩苷粉末，溶于100 μL DMSO中，配制成200 g/L的母液，0.22 μL孔徑濾器過濾，-20 ℃保存。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

CAL-27細(xì)胞解凍后用含10%胎牛血清(FBS)和1%的雙抗的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃，含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到80%以上時(shí)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 方法

1.4.1 MTT實(shí)驗(yàn) CAL-27細(xì)胞(密度為8×103個(gè)/孔)接種于96孔板，孵育12 h待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液，分別加入200 μL不同濃度的黃芩素(50、100、150、200、300、400 mg/L)、黃芩苷(50、100、150、200、300、400 mg/L)及兩藥混合(黃芩素170.5 mg/L，黃芩苷190.3 mg/L)培養(yǎng)液，每組六個(gè)復(fù)孔，對照組不加藥。培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，避光4 h。棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，慢速震蕩10 min。應(yīng)用酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光度值(OD值)。

1.4.2 劃痕實(shí)驗(yàn) CAL-27細(xì)胞(密度為5×105個(gè)/孔)接種于6孔板中。孵育待貼壁細(xì)胞鋪滿六孔板底90%以上，用10 μL槍頭垂直孔板底部劃痕。PBS沖洗3遍，洗去脫落細(xì)胞，分別加入2 mL黃芩素(170.5 mg/L)、黃芩苷(190.3 mg/L)及兩藥混合(黃芩素170.5 mg/L，黃芩苷190.3 mg/L)的培養(yǎng)液，每組3個(gè)復(fù)孔。對照組不加藥，于0、6、12、24 h在倒置顯微鏡下拍照，觀察細(xì)胞愈合情況并計(jì)算細(xì)胞遷移率，公式如下：細(xì)胞遷移率(愈合率)=(T0時(shí)劃痕面積-Tt時(shí)劃痕面積)/T0時(shí)劃痕面積×100%。

1.4.3 免疫熒光實(shí)驗(yàn) CAL-27細(xì)胞(密度為4×104個(gè)/孔)接種于24孔板中，孵育12 h后，分別加入1 mL黃芩素(170.5 mg/L)、黃芩苷(190.3 mg/L)及兩藥混合(黃芩素170.5 mg/L，黃芩苷190.3 mg/L)的培養(yǎng)液，對照組不加藥，48 h后，Hoechst進(jìn)行細(xì)胞核染色30 min，多聚甲醛溶液固定15 min，將固定的細(xì)胞與5%的BSA溶液避光封閉30 min，分別加入E-cadherin和N-cadherin抗體，4 ℃孵育過夜后加入熒光二抗，室溫避光孵育30 min，于熒光顯微鏡下觀察并記錄。

1.4.4 聯(lián)合指數(shù)(CI) 為了確定黃芩苷與黃芩素兩者聯(lián)合應(yīng)用是單純兩者藥效疊加作用還是協(xié)同作用，我們在本實(shí)驗(yàn)中引入了Chou-Talady的中效原理計(jì)算CI，其計(jì)算公式為：

D1和D2是藥物1和藥物2聯(lián)合作用抑制率為50%時(shí)的藥物濃度，Dx1和Dx2是藥物1和藥物2分別單獨(dú)應(yīng)用時(shí)，抑制率為50%時(shí)的藥物濃度。根據(jù)Chou-Talady理論，如果CI=1，藥物聯(lián)合作用效果為疊加；CI<1，藥物聯(lián)合作用效果為協(xié)同；CI>1，藥物聯(lián)合作用效果為拮抗[12]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 19.0、 compusyn進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差。兩組間分析采用t檢驗(yàn)，多組間分析應(yīng)用單因素方差分析，P<0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CI<1視為兩藥有協(xié)同作用。

2 結(jié) 果

2.1 黃芩素、黃芩苷及兩藥聯(lián)合時(shí)對CAL-27細(xì)胞增殖的影響

MTT實(shí)驗(yàn)證明不同濃度的黃芩素、黃芩苷可以抑制CAL-27細(xì)胞的增殖，隨著藥物濃度的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)(圖1a、1b)。計(jì)算得出，48 h時(shí)，黃芩素與黃芩苷的IC50值分別為170.5 mg/L和190.3 mg/L。選取空白對照組，黃芩素(170.5 mg/L)、黃芩苷(190.3 mg/L)和兩藥混合(黃芩素170.5 mg/L，黃芩苷190.3 mg/L)作用CAL-27細(xì)胞48 h，各組存活率分別為(46.96±6.89)%、(49.17±4.40)%、(31.87±4.98)%(圖1c)。聯(lián)合用藥與黃芩素、黃芩苷相比對CAL-27細(xì)胞增殖的抑制作用更強(qiáng)。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.045，P=0.000 3，CI=0.552 31)。

*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001；a：黃芩素對CAL-27細(xì)胞活力的影響；b:黃芩苷對CAL-27細(xì)胞活力的影響；c:黃芩素、黃芩苷及聯(lián)合用藥對CAL-27細(xì)胞活力的影響

圖1不同用藥對細(xì)胞活力的影響

Fig.1Effects of different drugs on cell viability

2.2 黃芩素、黃芩苷及聯(lián)合用藥對CAL-27細(xì)胞的遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)表明，6 h時(shí)，對照組愈合率為(23.8±1.6)%，黃芩素組愈合率為(10.9±2.9)%，黃芩苷組愈合率為(16.4±1.9)%，聯(lián)合應(yīng)用組愈合率為(1.3±2.0)%，黃芩素、黃芩苷、聯(lián)合用藥組均低于對照組(P=0.038，P=0.044，P=0.008)，且聯(lián)合用藥組低于黃芩素、黃芩苷單藥組(P=0.006,P=0.004)。12 h時(shí)，對照組愈合率為(42.7±1.7)%，黃芩素組愈合率為(19.4±1.6)%，黃芩苷組愈合率為(24.5±1.0)%，聯(lián)合應(yīng)用組愈合率為(15±1.9)%，黃芩素、黃芩苷、聯(lián)合用藥組均低于對照組(P=0.002,P=0.003,P=0.002)，且聯(lián)合用藥組低于黃芩素、黃芩苷單藥組(P=0.003,P=0.003)。24 h時(shí)，對照組愈合率為(72.9±0.7)%，黃芩素組愈合率為(36.2±1.9)%，黃芩苷組愈合率為(32.6±2.5)%，聯(lián)合應(yīng)用組愈合率為(21±2.6)%，黃芩素、黃芩苷、聯(lián)合用藥組均低于對照組(P=0.001,P=0.002,P=0.001)，且聯(lián)合用藥組低于黃芩素、黃芩苷單藥組(P=0.003,P=0.002)(圖2、3)。

2.3 黃芩素、黃芩苷及兩藥聯(lián)合時(shí)對EMT相關(guān)蛋白E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)影響

免疫熒光結(jié)果顯示黃芩素、黃芩苷及聯(lián)合用藥時(shí)與對照組相比，E-cadherin蛋白的表達(dá)升高，N-cadherin蛋白的表達(dá)降低。且兩藥聯(lián)合組較單藥組差異更為顯著(圖4、5)。

*：P<0.05；**：P<0.01

圖2黃芩素、黃芩苷作用于CAL-27的劃痕愈合率

Fig.2Scratch healing rates of the effect of baicalein, baicalin and their combination on CAL-27cells

圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測CAL-27細(xì)胞的遷移能力( ×200)

圖4 免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察CAL-27細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)情況

圖5 免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察CAL-27細(xì)胞N-cadherin蛋白表達(dá)情況

3 討 論

口腔鱗癌是頜面部高發(fā)的惡性腫瘤，目前治療方法以綜合治療為主，其中晚期患者常發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，治療方案多為手術(shù)結(jié)合放、化療，其中化療是現(xiàn)在最為常用的口腔鱗癌輔助治療方法之一。傳統(tǒng)化療藥物在腫瘤治療中應(yīng)用廣泛且療效顯著，但存在許多不良反應(yīng)，如骨髓抑制，脫發(fā)及惡心、嘔吐等胃腸道不良反應(yīng)。近年來，中藥提取物因其安全、低毒、高效的特點(diǎn)在腫瘤治療方面的應(yīng)用越來越廣泛，其中黃芩素、黃芩苷是從黃芩中提取的黃酮類單體，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等生物學(xué)活性，且對正常組織毒性小[13-14]。有研究顯示黃芩素、黃芩苷對結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌等癌細(xì)胞的生長具有抑制作用[15-17]。然而近年來研究者除了關(guān)注單藥對腫瘤的抑制作用，開始對聯(lián)合用藥進(jìn)行廣泛研究[18]，有報(bào)道稱在卵巢癌的治療中，姜黃素和紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用比單獨(dú)用藥更有效，展現(xiàn)出協(xié)同作用[19]。黃芩素、黃芩苷與姜黃素和紫杉醇均為中藥提取物，因此，為探究中藥間的聯(lián)合用藥對口腔鱗癌的抑制效果，在體外條件下，本研究通過MTT、劃痕及免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)了黃芩素與黃芩苷聯(lián)合用藥可以有效抑制CAL-27細(xì)胞的增殖和遷移能力。

黃芩素與黃芩苷可有效抑制CAL-27細(xì)胞的增殖，且抑制效果呈濃度依賴性，藥物濃度越高，抑制效果越好，當(dāng)聯(lián)合用藥與黃芩素和黃芩苷的藥物濃度相同時(shí)，聯(lián)合用藥對CAL-27細(xì)胞增殖的抑制作用更好，且CI<1，表明黃芩素與黃芩苷聯(lián)合應(yīng)用時(shí)具有協(xié)同作用。Dou等[20]發(fā)現(xiàn)黃芩素與黃芩苷聯(lián)合應(yīng)用可有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

腫瘤患者生存率低的重要原因之一是腫瘤細(xì)胞具有較高的侵襲性和轉(zhuǎn)移性。因此抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移是提高生存率的關(guān)鍵。近年來，有研究者發(fā)現(xiàn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在腫瘤的遷移性研究中具有重要作用，這是一個(gè)由正常形態(tài)的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有惡性潛能的間充質(zhì)細(xì)胞的過程[21]。其中E鈣粘蛋白(E-cadherin)和N鈣粘蛋白(N-cadherin)分別為EMT進(jìn)程中上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物。有研究表明，通過改變一些蛋白的表達(dá)可以引發(fā)或逆轉(zhuǎn)EMT進(jìn)程，從而影響OSCC的遷移能力[22-23]。閆婉君等[24]研究證明黃芩素通過抑制Snail蛋白的表達(dá)阻止EMT發(fā)生從而抑制乳腺癌細(xì)胞的肝轉(zhuǎn)移，劉海霞等[25]發(fā)現(xiàn)黃芩苷可以抗腎小管纖維化，其機(jī)制是上調(diào)E-鈣粘蛋白的表達(dá)并抑制TGF-β1途徑阻斷腎小管細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。既往實(shí)驗(yàn)表明黃芩素、黃芩苷具有抗腫瘤遷移的作用，其機(jī)制可能是通過上調(diào)或下調(diào)EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白，抑制EMT進(jìn)程。這與本實(shí)驗(yàn)機(jī)制相類似，本研究通過劃痕實(shí)驗(yàn)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了黃芩素、黃芩苷及聯(lián)合用藥可有效增強(qiáng)CAL-27細(xì)胞內(nèi)E-cadherin蛋白的表達(dá)并抑制N-cadherin蛋白的表達(dá)及遷移性，且聯(lián)合用藥對CAL-27細(xì)胞遷移的抑制作用強(qiáng)于單藥，提示腫瘤細(xì)胞惡性程度的降低可能與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化蛋白的逆向表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，黃芩素與黃芩苷聯(lián)合用藥對CAL-27細(xì)胞的增殖和遷移具有抑制作用，且抑制效果優(yōu)于黃芩素、黃芩苷單藥。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為黃酮類藥物聯(lián)合應(yīng)用抗腫瘤的臨床治療提供了依據(jù)，但仍需探索更適宜的聯(lián)合用藥濃度。目前對黃芩素與黃芩苷聯(lián)合用藥的研究仍處在體外實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)相關(guān)研究及其更多的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探索。